转移性前列腺癌患者循环肿瘤细胞免疫检查点的表达

摘要

介绍

前列腺癌是男性最常见的癌症，每年导致的癌症相关死亡人数居第二位[1]. 使用雄激素剥夺疗法（ADT）确定雄激素可用性最初是有效的；然而，在许多情况下，转移性、去势耐受性前列腺癌（mCRPC）也随之发生。mCRPC表型具有攻击性，通常具有致死性，有效治疗有限[2,三]. mCRPC的免疫原性一直存在争议，许多研究表明，在大多数人类前列腺癌微环境中缺乏浸润性T细胞，因此前列腺癌被称为免疫沙漠[4,5].

随着我们对肿瘤免疫相互作用的理解不断发展[6,7]，人们已经努力改变适应性免疫反应，通过靶向受严格调控的激活和抑制信号系统来操纵效应T细胞。这些努力通过一类免疫治疗检查点抑制剂（ICIs）阻断T细胞上的检查点受体（包括细胞毒性T淋巴细胞抗原-4[CTLA-4]和程序性细胞死亡1[PD-1]），从而在免疫治疗方面取得了重大进展。ICIs提高了多发转移性实体瘤的生存率，但迄今为止用于前列腺癌的临床数据尚未显示出显著疗效[8——11]. 作为mCRPC的单一疗法，pembrolizumab根据RECIST 1.1标准显示了约5%的客观缓解率，骨优势疾病男性的疾病控制率（稳定疾病或更好）高达23%，> 50%的PSA下降率高达8%，中位PFS为2.1个月（内脏疾病患者）和3.7个月（骨优势疾病男性）[10]. 最近在28名男性中进行的pembrolizumab联合恩扎鲁胺的试验中> 18%的患者观察到50%的PSA下降，客观缓解率为25%（12例患者中有3例患有可测量的疾病）[11].

mCRPC患者对ICIs反应相对较差的一个原因是对前列腺癌免疫检查点目标的了解有限。最近的报道暗示了先天免疫STING途径[12]检查点配体PD-L1、PD-L2和B7H3是前列腺癌潜在的免疫治疗靶点。对苯扎鲁胺耐药的mCRPC患者肿瘤细胞PD-L1表达和抗原提呈细胞PD-1表达均上调[13]. PD-L1也曾在转移性乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌和尿路上皮癌的循环肿瘤细胞（CTC）上发现[14,15]. 前列腺切除标本的基因表达谱也表明PD-L2的高表达是预后因素，与生化复发、转移扩散和前列腺癌特异性生存率较差相关[16]. 本研究选择B7-H3和CTLA-4作为其他检查点，分别对其在前列腺癌细胞上的发病率和在肿瘤免疫相互作用中的重要性进行表征。尤其是，B7-H3的表达被认为是原发性前列腺肿瘤的普遍检查点[17]与前列腺癌进展和不良预后相关[18,19]经雄激素受体信号抑制剂（ARSI）苯扎鲁胺或醋酸阿比特龙加泼尼松治疗后，肿瘤微环境无变化[20].

尽管这些疗法在整个mCRPC表型的连续统中无效，但生物标记物选择的mCRPC男性人群显示出ICI的一些益处，包括错配修复缺陷的男性[21,22]，双等位基因CDK12型损失[23——25]以及同源重组基因的突变巴西航空公司2[26,27]. 除了一些潜在基因型条件的反应外，ICIs的反应也可能在苯扎鲁胺耐药的情况下得到改善[13,28,29]. 在恩扎鲁他胺耐药疾病中，AR阻断抑制DNA损伤修复过程，这可能在一定程度上解释了对ICIs反应增加的原因。

除了基于基因组的治疗反应标记外，肿瘤微环境中的几个免疫原性标记也被证明可以预测前列腺癌的侵袭性和耐药性，这可能有助于更好地了解ICIs的反应和耐药性。反映肿瘤微环境变化的实时生物标记物有潜力改进疾病监测和治疗。作为实时生物标记物，CTC是循环中扩散的癌细胞，代表转移性、抗药性疾病[30——32]. CTC比存档组织标本能更好地反映肿瘤微环境的变化，并能提供细胞表面变化的外围监测[33]. 在前列腺癌中，CellSearch®平台已被用于量化患有转移性去势抵抗疾病的男性的CTC负担，并被美国食品药品监督管理局批准为总生存率的预后生物标志物[34,35]. CTC生物标记物的分子和数字病理分析也验证了CTC表征在确定一系列临床环境中治疗反应的预后和预测生物标记物方面的临床实用性，包括对苯扎鲁胺耐药性的发展[36——38]醋酸阿比特龙加泼尼松[39]和紫杉烷类[40——42]. 我们之前已经描述了基于MET癌基因表达的CTC捕获[43]，并通过对CTC的基因组分析，发现激素治疗抵抗可能是由于AR mRNA剪接变异体、AR信号缺失[37]和神经内分泌样特征的获得[44]. 总之，这些研究证明了分析CTC生物标记物对预后和预测效益的作用和实用性。

在这项研究中，我们试图利用CTC生物标志物表征的独特优势，更好地了解前列腺癌免疫检查点表达的分子格局。为此，本研究的主要目的是描述PD-L1、PD-L2、B7-H3和CTLA-4在不同激素敏感和去势抵抗疾病状态下以及在治疗和疾病进展过程中随时间的推移在转移性前列腺癌患者分离的CTC上的表达，目的是对转移性前列腺癌患者免疫检查点抑制的未来治疗靶向性和预后生物标志物研究。

材料和方法

标记物验证研究

基于EpCAM的CTC捕获和下游免疫检查点生物标记物表达的敏感性和特异性已经过验证，并在这里应用，在对照癌细胞系（阳性和阴性对照）中评估每个荧光标记物的敏感性/特异性[45]. 对于PD-L1，乳腺癌细胞株MDA-MB-231作为阳性对照，MCF7作为阴性对照。对于PD-L2，肺癌细胞系Calu-1用作阳性对照，LNCaP前列腺癌细胞系用作阴性对照。对于B7-H3，乳腺癌细胞系MCF7作为阳性对照，SKBR3作为阴性对照。最后，对于CTLA-4，乳腺癌细胞系DU4475作为阳性对照，LNCaP作为阴性对照。与藻红蛋白结合并针对PD-L1的商用抗体（29E.2A3，Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥）；PD-L2（MIH18，Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥）；使用B7-H3（MIH42，Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥）和CTLA-4（BNI3，BD Bioscience，加利福尼亚州圣迭戈）验证阳性和阴性对照细胞系，然后进行健康志愿者加标研究。每个健康志愿者的全血样本中，每个免疫检查点配体的阳性或阴性对照细胞系中大约有500个细胞，这些加标研究大约每两个月重复一次，以在整个研究过程中对这些免疫检查点的特征进行质量控制（图1). 根据杜克IRB批准的方案（Pro00027680）招募健康志愿者，并提供知情同意书。

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图1

CTC上（A）PD-L1、（B）PD-L2、（C）B7-H3和（D）CTLA-4检查点配体的健康志愿者峰值实验。将已知每个免疫检查点生物标记物表达阳性或阴性的细胞系注入健康志愿者的全血中。对照样品中加入了大约500个细胞（由于随机误差而发生变化）。每个面板显示了从这些峰值实验中捕获的未着色、阴性和阳性对照细胞，下面显示了捕获的CTC总数。下面描述的CTC面板是Cellerch的原始CTC输出–从左到右，捕获细胞的合并图像，细胞角蛋白（CK）染色，DAPI核染色，CD45（白细胞标记物，肿瘤细胞阴性）和感兴趣的检查点配体

结果

患者特征

在2016年11月28日至2018年11月15日期间，共有39名男性获得了同意并接受了资格评估。由于基线时缺乏CTC，9名男性被替换，并被认为没有价值。从30名男性中采集外周血进行CTC鉴定，如上所述，三个队列中每个队列中有10人（CONSORT图如图所示2). 在mCRPC前ARSI队列中，男性的中位年龄为74岁，通常有骨和淋巴结为主的转移，只有2名男性有内脏转移，表现为基线PSA较低（中位7 ng/mL），只有30%的患者LDH水平升高（中位83 U/L）。在mCRPC后ARSI队列中，男性的中位年龄为72岁，也有以骨和淋巴结为主的转移，只有2名男性有内脏转移，平均基线PSA为27 ng/mL，70%的患者LDH水平升高（平均224 U/L）。对于mHSPC队列，中位年龄为72岁，均伴有骨/淋巴结转移（无内脏转移），男性PSA水平较高（中位90 ng/mL，范围高达1427 ng/mL），40%的LDH水平升高（中位193 U/L）（表1)。

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图2

本研究中检查的转移性前列腺癌患者与循环肿瘤细胞的对照图。A组：mCRPC患者开始服用醋酸阿比特龙/泼尼松或恩扎鲁胺（ARSI前），B组：正在服用安扎鲁胺或醋酸阿比特龙/泼尼松（ARSI后）的mCRPC男性，C组：新诊断转移性激素敏感前列腺癌（mHSPC）患者开始雄激素剥夺治疗（ADT）或ADT/多西他赛化疗

表1

三组转移性前列腺癌患者的基线特征

基线特征	主CRPC ARSI之前(n个 = 10)	主CRPC ARSI后（n=10）	多热休克蛋白C 启动ADT（n=10）	总计(n个 = 30)
年龄
中位数（范围）	74 (51–83)	72 (53–88)	72 (55–82)	72 (51–88)
比赛
白色	9 (90%)	9 (90%)	8 (80%)	26 (87%)
黑人或非裔美国人	0 (0%)	0 (0%)	2 (20%)	2 (7%)
其他	1 (10%)	1 (10%)	0 (0%)	2 (6%)
PSA（纳克/毫升）
中位数（范围）	7 (2–1327)	27 (5–126)	90 (4.3–1427)	32 (2–1427)
血红蛋白（g/dL）
中位数（范围）	12.2 (7.9–14.3)	12.2（9.4–14.1）	13.6 (8.5–16.2)	12.6 (7.9–16.2)
<13.7 g/dL（LLN）	9 (90%)	8 (80%)	5 (50%)	22 (73%)
乳酸脱氢酶（单位/升）
中位数（范围）	238 (142–517)	224（117–330）	193 (142–230)	224 (117–517)
>100 U/L（ULN）	3 (30%)	7 (70%)	4 (40%)	14 (47%)
碱性磷酸酶（U/L）
中位数（范围）	83 (44–877)	87 (41–207)	111 (43–1378)	96 (41–1378)
>110 U/L（ULN）	4 (40%)	3 (30%)	5 (50%)	12 (40%)
既往化疗
卡巴齐塔塞尔	0 (0%)	2 (20%)	0 (0%)	2 (7%)
多西紫杉醇	3 (30%)	5 (50%)	0 (0%)	8 (27%)
变质地点
骨骼	8（80%）	10 (100%)	9 (90%)	27 (90%)
淋巴结（骨盆内）	5 (50%)	3 (30%)	7 (70%)	15（50%）
淋巴结（骨盆外）	4 (40%)	4（40%）	4 (40%)	12 (40%)
肝脏	0 (0%)	1 (10%)	0 (0%)	1 (3%)
肺	2 (20%)	1 (10%)	0 (0%)	3 (10%)
格里森分数（总和）
< 6	1 (10%)	1 (10%)	1 (10%)	3 (10%)
7	3 (30%)	3 (30%)	1 (10%)	7 (23%)
8–10	5 (50%)	6 (10%)	6 (60%)	17 (57%)
缺少	1 (10%)	0 (0%)	2 (20%)	3 (10%)

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在基线检查时，所有男性至少有四分之一的血液样本中检测到了CTC，并且替换了基线检查时没有CTC的男性。然而，一些男性在治疗12周或疾病进展时没有检测到CTC。此外，在给定的时间点，可能在某些样本中检测到CTC，但不是全部四个样本。因此，针对每个生物标志物分析的样本数量在时间点和队列之间变化（参见中的详细生物标志物CONSORT图补充图。 1)。

在数据锁定时，中位随访21个月，15名男性显示出疾病进展的证据（7名男性在mCRPC发生ARSI前，6名男性在mCRPC发生ARSI后，2名男性发生mHSPC）（图。​（图22)。

前列腺癌CTCs表达PD-L1、PD-L2和CTLA-4；最频繁表达B7-H3

基线时，在40%的mHSPC男性、60%的mCRPC ARSI前男性和70%的mCRPC ARSI后男性中检测到PD-L1表达（至少在1个CTC上），较少的CTC表达PD-L1的男性（每个队列的20-30%）（图4一). 在40%的mHSPC男性患者、40%的mCRPC前ARSI男性患者和20%的mCRPC-ARSI后男性患者中检测到PD-L2的表达（至少在1个CTC上）。更少的男性CTCs表达PD-L2超过50%（每个队列的20-30%）（图。​（图44b条). 在10%的mHSPC男性、20%的mCRPC前ARSI男性和10%的mCRPC-ARSI后男性中，至少在1个CTC中检测到CTLA-4的表达。每个队列中只有10%的男性在基线时CTCs表达>50%（图。​（图44d日)。

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图4

每个队列中免疫检查点生物标记物随时间的表达。（A） PD-L1、（B）PD-L2、（C）B7-H3、（D）CTLA-4。制作直方图，描述每个患者的总CTC百分比。每个队列中每个时间点至少有一个标记阳性CTC的患者百分比（E）。每个队列中每个时间点至少50%标记阳性CTC的患者百分比（F）。雄激素受体信号抑制剂

确定的CTC表达PD-L1、PD-L2、B7-H3和CTLA-4，并显示每个检查点配体的代表性阳性CTC和阴性CTC（阳性CTC：图三; 阴性CTC：补充图。 2). 在基线检查时，B7-H3是表达最普遍的免疫检查点配体（图。​（图44c（c）). B7-H3在90%的mHSPC男性患者、80%的mCRPC前ARSI男性患者和90%的mCRPC-ARSI男性患者中存在（至少在1个CTC上检测到）。在所有队列中，超过一半检测到的CTC在80%的mCR前ARSI患者、90%的mCR后ARSI男性和80%的mHSPC-男性患者中B7-H4表达阳性（图。​（图44c（c）)。

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图3

对具有代表性的患者CTC进行细胞角蛋白（CK）、4′，6-二氨基苯吲哚（DAPI）、CD45（白细胞标记物）和相关免疫检查点配体（[A]PD-L1，[B]PD-L2，[C]B7-H3或[D]CLTA-4）染色。CTC被定义为CK阳性、DAPI阳性和CD45阴性。橙色方框是CellTracks Analyzer II的指示灯，表示某个细胞被识别为标记阳性

在所有队列中，B7-H3阳性CTCs>50%的男性比率为83%，PD-L1为27%，PD-L2为23%，CTLA-4为10%（表​（表2，2，图。​图4）。4). 由于每个队列和每个患者中的CTC在测试的免疫检查点中具有异质性表达，因此报告队列中男性的比例显示了每个疾病环境中的表达流行率，并报告了具有>表达每个免疫检查点的50%CTC代表了每个患者CTC人群的异质性。

讨论

前列腺癌精确免疫肿瘤学的一个主要目标是确定最可能对特定免疫治疗方法（如ICI治疗）产生反应的男性[47]. 在患有mCRPC的男性患者中，单剂CTLA-4或PD-1阻断剂的客观反应率较低，为5-10%[8——11,28]从而表明对预测性生物标记物的主要需求尚未得到满足。这些有反应的男性通常缺乏MSI检测，而基因组预测因子如肿瘤突变负荷（TMB）[48],CDK12型损失[23]，或LRP1b型变更[49]可能会发现一些对PD-1阻断有非凡和持久反应的男性，大多数对ICI治疗有反应的mCRPC患者缺乏可识别的生物标记物来解释这种反应。在这项研究中，我们对转移性前列腺癌男性CTC上的四种免疫检查点生物标志物（PD-L1、PD-L2、B7-H3和CTLA-4）进行了表征，并描述了随着时间的推移，转移性前列腺癌疾病状态下以及男性之间和男性内部CTC上的每个IC配体的明显异质性。仅在mCRPC前ARSI队列中发现CTLA-4表达的CTC达到预定的成功阈值20%，而在mHSPC男性患者（10%）或mCRPC后ARSI男性患者（10%）中没有发现。否则，达到了预先定义的成功阈值，每个队列中至少有20%的人表达PD-L1和PD-L2的CTC，每个队列至少有50%的人表达B7-H3的CTC。

这项研究的结果与我们的假设一致，即免疫检查点配体在疾病设置之间、队列内和时间点之间的前列腺CTC上呈异质性表达。而其他人则在包括前列腺癌在内的其他实体肿瘤的CTC表面显示PD-L1表达[14,15,50——52]，我们在CTC上检测到4种不同的检查点配体PD-L1、PD-L2、B7-H3和CTLA-4。此外，我们可以评估疾病状态之间、特定队列中男性之间以及特定患者临床过程中不同时间点之间的变化。本研究的一个关键观察结果是这种异质性，尤其是CTC上PD-L1和PD-L2的表达，其中10-20%的男性CTC表达免疫逃避和衰竭的标志之一。我们试图使用任何具有免疫检查点配体的CTC和在任何患者样本中表达免疫检查点配体的>50%的CTC的这些描述符来描述前列腺癌生物学的这种多样性。我们观察到，患有mCRPC的男性在苯扎鲁胺/醋酸阿比特龙+泼尼松敏感和耐药环境中表现出类似的CTC免疫检查点生物标记物异质性。从基线检查到12周，两个mCRPC队列（ARSI前和ARSI后）的PD-L1+CTC患者较少。这一趋势与mHSPC男性队列不同，后者患有PD-L1+CTC的男性比例从基线增加到12周。12周时患有PD-L1+CTCs的mHSPC男性患者的百分比超过了患有B7-H3+CTCs mHSPC患者的百分比。这些数据可能表明，在PD-L1/2 CTC丰富的男性中，未来有针对性地实施PD-1通路阻断策略，以测试CTC PD-L1/2检测的预测价值。

在许多男性中，只有一部分CTC在任何一个时间点表达某种配体。我们首次描述了癌症CTC上CTLA-4的表达，已知CTLA-4在免疫细胞和垂体细胞上表达，与男性CTLA-4阻断剂的已知疗效和毒性有关，并且据报道在一些癌症细胞系上表达[53,54]. 观察到的CTLA-4的异质性，PD-L1和PD-L2的表达加强了这样一种观念，即肿瘤细胞的多种不同表型通常在患者体内同时发生，从外周血中分离转移性CTC有助于确定肿瘤细胞群的特征，以便更好地进行靶向治疗，而组织活检可以排除某些亚群，尤其是那些动态的，其表达随着治疗而纵向变化的[55].

目前美国FDA批准的免疫疗法靶向PD-L1、PD-1或CTLA-4；然而，这项研究强调了B7-H3作为免疫治疗靶点的潜在重要性。B7-H3几乎在每个疾病队列和所有时间点的CTC上普遍表达。鉴于其在前列腺癌患者CTC上的高表达及其与不良临床结局的相关性[17——20]，利用B7-H3作为靶向机制的免疫疗法可能会成功上调内源性T细胞对侵袭性肿瘤的反应。在接受PD-1抑制剂治疗的mCRPC患者中，表达B7-H3的CTC持续表达，同时CTC上PD-L1表达缺失，这立即表明了免疫逃避和未来靶向的可能机制。

目前的研究存在一些局限性。这包括每个队列的样本量较小，临床结果有限，以及确定表达这些免疫检查点的CTC的预后或预测意义不明确，因为它与相同男性的免疫检查点抑制有关。我们的患者在mCRPC设置中不经常使用ICIs治疗，因为缺乏FDA批准，并且ICIs在这种设置中缺乏一致的疗效，因此我们无法确定这些具有免疫检查点表达的CTC是否会在任何ICI治疗中发生特异性变化。然而，这项初步研究表明，描述CTC上免疫检查点的表达特征并跟踪这些免疫检查点表达CTC随时间变化的可行性。这一发现为未来的治疗研究奠定了基础，将这些CTC生物标记物植入前瞻性试验中，以预测反应并监测免疫检查点的表达。

这项研究揭示了转移性前列腺癌患者CTC免疫检查点表达的异质性，并表明CTC特征分析的发展前景广阔，该分析可作为临床疾病负担和治疗反应的实时生物标记物。我们的研究结果表明，免疫检查点抑制剂可能对部分但并非所有转移性前列腺癌患者有益。未来对更多患者群体的研究可能会显示免疫检查点配体表达与治疗反应之间的更强相关性。随着未来研究的增加，评估免疫检查点表达与反应之间的关系，外周血CTC特征化有可能作为一种快速、无创的预后或监测工具，用于免疫检查点抑制剂治疗前列腺癌。

补充信息

数据和材料的可用性

作者的贡献

TZ：研究构思、设计、分析、数据解释、初稿；AA：数据采集、分析、数据解释、初稿；RGA：数据采集、分析、初稿；DR、SP、EB：数据采集和分析；RB、CR：研究概念、设计、数据分析和解释；MA：数据分析、解释、初稿；TO、PH：数据分析和解释；MAM：研究概念、设计、数据分析；KW、JAS：概念、设计、数据分析；DJG：概念和设计；AJA：研究概念、设计、分析、数据解释、初稿。所有作者都审查并批准了这份提交的手稿。

基金

Janssen Research and Development资助了这项临床研究。JAS感谢国防部（W81XWH-18-1-0189）和国家癌症研究所（1R01CA233585–02）的支持。

道德批准和参与同意

该研究由杜克大学机构审查委员会（Pro00063296）批准。所有患者均签署知情同意书并自愿参与本研究。

出版同意书

本出版物中未披露任何可识别的患者信息。患者签署了临床研究的知情同意书，其中包括潜在的汇总数据发布。

竞争性利益

TZ拥有辉瑞、杨森、Acerta、Abbvie、诺华、Merrimack、OmniSeq、PGDx、Merck、Mirati、Astellas和Regeneron的研究资金（杜克）；咨询/与Genentech Roche、Exelixis、Genomic Health和赛诺菲-安万特对话；以及咨询委员会/咨询公司包括阿斯利康、拜耳、辉瑞、基金会医学、杨森、安进、美赞臣联合公司、默克、BMS、Pharmacyclics、西雅图遗传学、Calithera和Dendreon。Capio Biosciences和Archimmune Therapeutics的股权/就业（配偶）。苏格兰皇家银行（RB）和捷克共和国（CR）在詹森（Janssen）有员工和股票。AA、RGA、DR、EB、SP、MAM、KW、MA、TO、PH和JAS没有可披露的竞争利益。DJG得到了Acerta、Astellas、BMS、Bayer、Calithera、Exelixis、Janssen、Myovant、辉瑞、诺华、赛诺菲-安万特的研究支持（杜克）。Vizuri健康科学、UroToday、赛诺菲、辉瑞、耐克塔、Myovant、Modra、默克、易普生、Flatiron、Exelixis、Capio、EMD Serono、BMS、拜耳、阿斯利康、阿斯特拉斯的咨询收入。

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脚注

工具书类