创伤性脑损伤后可溶性单体α-突触核蛋白丰度的不同区域反应

摘要

介绍

创伤性脑损伤（TBI）是发病率和死亡率的主要原因，估计全球发病率约为1000万[1]. TBI可导致记忆和认知障碍、意识状态改变、精神障碍（包括抑郁）和身体损伤，这些损伤可能是暂时性的，也可能会发展为永久性残疾，并导致生活质量下降[2–4]. TBI引发一系列复杂的病理生理学变化，其中包括兴奋毒性、线粒体功能受损、轴突损伤以及神经递质释放和突触功能的延迟性长期改变[5–14]. 大鼠控制性皮质撞击模型（CCI）是一种广泛应用且成熟的TBI模型，它在齿状回、CA1、CA3和肝门产生渐进性皮质挫伤和海马突触及细胞丢失，导致突触功能改变[14,54,71,72]以及CCI损伤后几天和几周内运动和认知障碍的表现，包括执行功能和空间学习记忆[6,25,73,74,75].

突触前蛋白是一个小而丰富的突触前蛋白家族，包括α-、β-和γ-突触核蛋白。突触核蛋白在正常神经元功能中的生理作用一直是研究的主题。评估结构、突触前位置和蛋白质相互作用的研究表明，突触囊泡运输和神经递质释放中具有调节和调节作用[15–19]. N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物的形成是突触小泡对接和神经递质释放到突触间隙的重要步骤[20–22]. 在表现出SNARE复合物形成受损的α-synuclein基因敲除小鼠中，α-synuglein参与神经递质释放的关键作用被确定[18,23]强调可溶性单体α-synuclein的减少可能与突触功能受损有关。我们之前已经证明，在两个TBI实验模型（包括CCI）中，海马中SNARE复合物的形成在损伤后数周内减少[24–26]. 总之，这些报告在α-突触核蛋白丰度和SNARE蛋白质机制之间建立了强有力的联系，SNARE蛋白机制对神经传递和囊泡池的维持至关重要，支持突触中单体α-突触素水平的变化有助于TBI后神经元功能受损。

越来越多的证据表明，慢性神经退行性蛋白病（包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和慢性创伤性脑病（CTE））与TBI诱导的蛋白质代谢改变（包括α-突触核蛋白、淀粉样β、tau和TDP-43）有关[27,28]. 特别是对于α-突触核蛋白，先前的研究重点是了解病理形态，重点是纹状体和黑质，因为这些区域通常与PD相关。进一步的证据来自于人类TBI后神经元和轴突中病理性α-突触核蛋白聚集体的发现[31–33]. 然而，目前还没有完成多少工作来了解TBI对α-突触核蛋白单体水平的影响。成人脑脊液中单体α-突触核蛋白升高[29]婴儿和儿童[30]在严重TBI后的一周，突出了作为生物标记物的效用。这种知识差距突出表明，需要在实验性TBI中进行研究，以确定单体α-突触核蛋白的变化，因为这些变化可能直接影响神经传递受损和慢性神经退行性变。

在当前的研究中，我们试图测定成年大鼠CCI损伤后长时间（6小时、1天、1、2、4和8周）内可溶性单体α-突触核蛋白的变化。通过western blot评估大脑皮层海马和纹状体中α-突触核蛋白的丰度，并通过免疫组织化学方法评估背海马，包括CA3，这是CCI后SNARE蛋白丰度发生改变的区域[26].

材料和方法

蛋白质印迹分析

为了评估受伤或假手术大鼠同侧和对侧皮层、海马和纹状体组织中α-突触核蛋白的丰度，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）之前，将含有20μg蛋白质的样品煮沸10分钟通过12%的凝胶分离蛋白质样品和分子量标记（Bio-Rad，Hercules，CA）。将溶解的蛋白质电泳转移到硝化纤维素膜上。在室温下，用含0.05%吐温-20（PBST）的0.1 M PBS中的5%非脂肪干乳封闭膜1小时，并使用可识别aa15–123处单体α-突触核蛋白的商用抗体进行免疫标记（小鼠单克隆克隆42/α-突触核蛋白，1:2000，BD Biosciences）[18,35–37]损伤后6小时显示典型的免疫印迹染色模式图1一级抗体在4°C下培养过夜，然后在室温下培养山羊抗鼠免疫球蛋白G结合过氧化物酶（1:10000；PIERCE，Rockford，IL）1小时。使用化学发光检测系统（SuperSignal、PIERCE、Rockford、IL）对蛋白质进行可视化。为了使蛋白质负荷正常化，用小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（1:10000，Sigma，St.Louis，MO）剥离并重新切割膜。将损伤组织和假对照组放在同一凝胶中进行比较。将斑点暴露于X射线自显影胶片10秒至1分钟，并使用SCION ImagePC（Frederick，MD）软件对条带进行量化。数值报告为受伤样本的光密度比率，归一化为肌动蛋白，作为每个时间点每个半球同侧或对侧假对照的百分比。

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图1。

控制性皮质撞击（CCI）改变了损伤后皮质α-突触核蛋白的丰度。

皮质全细胞损伤后α-突触核蛋白和肌动蛋白的典型western blot图像溶解。6小时免疫印迹图像显示了单体α-突触核蛋白的代表性单带模式（18 kDa，标记物为15、20、160 kDa）。由于免疫印迹和间隙的数量，随后的图像被裁剪。通过Western blot分析评估CCI损伤或假手术大鼠在损伤后6小时、1天、1周、2周、4周和8周处死的皮层匀浆的半定量测量。对α-突触核蛋白（18 kDa，标记物为15和20 kDa）的评估显示，损伤后1周和2周，同侧皮层的丰度显著降低（*p<0.05）。损伤后，对侧皮层α-突触核蛋白的丰度没有改变。α-突触核蛋白归一化为肌动蛋白（42 kDa，标记物为37 kDa；n=6/组/时间点）。

结果

CCI大鼠皮层、海马和纹状体α-突触核蛋白的Western blot分析

在同侧皮层，CCI后1周和2周，α-突触核蛋白丰度显著低于shams（双向方差分析：主要损伤效应，p<0.001 F（1，60）=15.21；主要时间效应，p<0.05 F（5,60）=2.559；相互作用，p<0.05F（5,60）=2.559；事后t检验，p<0.05；图1A). 在对侧皮层，α-突触核蛋白无明显变化，但在伤后8周时无明显升高（主要损伤效应p=0.22 F（1,60）=1.532；图1B). 与假损伤相比，CCI在损伤后6小时、1天、1周、2周和8周导致同侧海马α-突触核蛋白丰度显著降低，但在损伤后4周没有显著降低（双向方差分析：主要损伤效应，p<0.0001 F（1，60）=111.5；事后t检验p<0.05；图2A). 在评估的任何时间点，对侧海马的α-突触核蛋白均未观察到显著变化（双向方差分析：主要损伤效应，p=0.07 F（1,60）=3.323；主时间效应，p=0.18 F（5,60）=1.591；相互作用，p=0.18 F（5,60）=1.592；图2B). 在同侧纹状体中，与假损伤相比，CCI导致损伤后6小时α-突触核蛋白水平显著降低（双向方差分析：主要损伤效应，p<0.05 F（1，60）=6.34；事后t检验p<0.05；图3A). 在检查的任何时间点，对侧纹状体中未观察到α-突触核蛋白的显著变化(图3B).

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图2。

在伤后8周内，控制性皮质撞击（CCI）在多个时间点降低了同侧海马α-突触核蛋白的丰度。

海马全细胞损伤后α-突触核蛋白和肌动蛋白的典型western blot图像溶解。通过Western blot分析评估CCI损伤或假手术大鼠损伤后6小时、1天、1周、2周、4周和8周海马匀浆的半定量测量。α-突触核蛋白（18kDa，标记物为15和20kDa）的评估显示，与假损伤相比，CCI损伤后6小时、1天、1、2和8周，同侧海马中的蛋白质显著降低，但4周后没有降低（*p<0.05）。损伤后对侧海马中α-突触核蛋白的丰度没有变化。α-突触核蛋白归一化为肌动蛋白（42 kDa，标记物为37 kDa；n=6/组/时间点）。

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图3。

损伤后6小时，控制性皮质撞击（CCI）降低了同侧纹状体α-突触核蛋白的丰度。

纹状体全细胞损伤后α-突触核蛋白和肌动蛋白的典型western blot图像溶解。通过Western blot分析评估CCI损伤或假手术大鼠损伤后6小时、1天、1周、2周、4周和8周处死纹状体匀浆的半定量测量。对α-突触核蛋白（18kDa，标记物为15和20kDa）的评估显示，与假损伤相比，CCI损伤后6小时同侧纹状体中的蛋白质显著降低（*p<0.05）。损伤后对侧海马中α-突触核蛋白的丰度没有变化。α-突触核蛋白归一化为肌动蛋白（42 kDa，标记物为37 kDa；n=6/组/时间点）。

CCI大鼠海马α-突触核蛋白的免疫组织化学分析

与假对照手术相比，CCI后1周，甲酚-维生素E染色显示海马齿状回、CA3和门的皮质损伤和细胞丢失(图4)如之前在TBI单侧CCI实验模型中建立的。单体α-突触核蛋白的免疫组织化学分析显示，在检测的时间点没有证据表明α-突触核蛋白聚集。我们在CCI后1周对海马中的单体α-突触核蛋白进行免疫标记分析，在我们之前的研究中，通过免疫印迹观察到α-突触核蛋白水平最低和SNARE复合物形成减少的时间点[25,26]. 与在整个海马匀浆中获得的免疫印迹结果一致（如图2)与对侧CCI海马和假对照组相比，CCI后1周同侧CCI脑海马α-突触核蛋白免疫反应性显著降低(图5A,​，B；B类; 单因素方差分析；主要影响，p<0.005 F（3,20）=9.275；事后t检验p<0.05）。在与α-突触核蛋白共同标记的同一节段中，突触素（突触前终末标记物）在同侧CCI海马的免疫反应性也较低，但这并不显著（单向方差分析；主效应p=0.26 F（3,20）=1.451；图5C). 每个时间点的平均像素强度分析，如所示表1，在6小时（单向方差分析：p=0.1867，F（3,20）=1.762）或24小时（单向变异分析：p<0.05，F（3，20）=3.401）时，CCI组之间没有显著差异，但在CCI后1周，同侧海马的α-突触核蛋白免疫反应性显著降低（单向方差计算：p<0.005，F，伤后2周（单因素方差分析：p<0.001，F（3,20）=15.18），4周（单原因方差分析：p<0.05，F（320=4.972）和8周（单因方差分析：p<0.01，F（3.20）=4.671）。双标记α-突触核蛋白和突触素免疫组化的评价(图6A,​，B）B类)损伤后1周，海马CA3中α-突触核蛋白免疫反应性点状结构减少，CA3放射层免疫反应性降低。在分子层，突触素免疫反应阳性的点状结构也减少。除了突触素的变化外，CA3中还观察到NeuN-阳性锥体神经元减少，提示神经元丢失(图7A,​，B）B类)在损伤后1周，支持观察在图4.

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图4。

受控的皮层冲击在损伤后1周产生皮层和海马细胞损失。

CCI的解剖位置由同侧皮层和海马在（A）假对照（-3.48mm前角）或（B）CCI损伤（-3.60mm前角）后1周的典型甲酚紫染色切片所示。伤后1周，CCI导致震中组织明显缺失。在海马体中，CA3（箭头）、齿状回和门（箭头）中观察到细胞丢失。比例尺等于500μm。

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图5。

损伤后1周，控制性皮质撞击（CCI）降低了同侧海马的α-突触核蛋白免疫反应性。

损伤后1周，假手术和CCI损伤脑切片中海马α-突触核蛋白和突触素免疫反应的典型图像（A）。CCI导致同侧海马中α-突触核蛋白免疫反应性降低。α-突触核蛋白免疫反应的定量评估显示，与假损伤（B）相比，CCI后1周，同侧海马的像素强度显著降低（*p<0.01）。然而，相同切片中突触素的强度测量结果显示没有显著差异（单向方差分析；p=0.26；C）。比例尺等于500μm（每个时间点每组n=6）。

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图6。

损伤后1周，控制性皮质撞击（CCI）降低了CA3区海马α-突触核蛋白和突触素免疫反应性。

α-突触核蛋白（红色）和突触前末端标记物突触素（绿色）的免疫荧光染色的代表性图像显示，损伤后1周CA3（A，B）的透明层（SLu）的免疫反应性降低。辐射层（Rad）和锥体细胞层（Py）。比例尺代表100μm（每个时间点每组n=6）。

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图7。

损伤后1周，控制性皮质撞击（CCI）降低了CA3区海马α-突触核蛋白和NeuN免疫反应性。

α-突触核蛋白（红色）和神经元细胞核标记NeuN（绿色）的免疫荧光染色代表性图像显示，损伤后1周CA3（A，B）中这两个标记的免疫反应性降低。放射层（Rad）、锥体细胞层（Py）、透明层（SLu）、比例尺代表100μm（每个时间点每组6个）。

表1：

控制性皮质撞击后海马α-突触核蛋白免疫反应

时间点	Sham（同侧）	Sham（对侧）	CCI（同侧）	CCI（对侧）
受伤后6小时	100 ± 14%	113 ± 13%	73 ± 12%	98 ± 11%
受伤后24小时	100 ± 4%	115 ± 7%	75 ± 21%	132 ± 13%
受伤后1周	100 ± 11%	102 ± 19%	37 ± 7%*	133 ± 21%
受伤后2周	100 ± 3%	100 ± 7%	33 ± 3%#	88 ± 14%
受伤后4周	100 ± 9%	100 ± 8%	55 ± 9%*	101 ± 13%
受伤后8周	100 ± 5%	84 ± 7%	56 ± 11%*	76 ± 10%

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通过平均像素强度分析α-突触核蛋白免疫反应性。平均像素值表示为假同侧半球测量值的百分比值。所有量化截面均在−3.24mm和−3.60mm角位置范围内。对每个时间点进行单因素方差分析的统计比较。

适当时，完成事后Sidak多重校正t检验，并描述显著性（与假同侧相比，*p<0.05或#p<0.001）。N=每组6个。

讨论

本研究的目的是确定单侧TBI对CCI损伤后6小时至8周内可溶性单体α-突触核蛋白丰度的影响。虽然聚集的α-突触核蛋白是TBI后的主要关注焦点，但对于在神经传递中起重要作用的单体α-突触核蛋白形式的变化，以及寡聚物和纤维病理聚集物的前体，人们知之甚少。本文的研究结果为同侧皮层、海马和纹状体区域的可溶性单体α-突触核蛋白缺陷提供了新的证据，这些区域在TBI后8周存活期间受到不同程度的影响。

在损伤后1周和2周，CCI导致同侧皮层α-突触核蛋白丰度较低，而在损伤后6小时和8周，同侧海马的α-突触核蛋白丰量较低。只有少数研究评估了TBI对损伤后海马和皮层α-突触核蛋白的影响。Uryu等人（2003年）在24个月大时受到CCI影响的野生型小鼠中，报告了损伤后1周和9周CA3和伞中α-突触核蛋白免疫反应随年龄的增长而短暂增加。Liu等人[38]据报道，CCI大鼠海马单体α-突触核蛋白水平早在1小时就降低，在1、3、5和7天持续降低。此外，Liu等人表示，α-突触核蛋白的翻译后调节物mR-153在损伤后1小时到7天的每个测试点都升高，这表明mR-153s可能影响翻译后修饰或α-突触核蛋白的表达。在一小群退役拳击手尸检后的额叶皮质组织中，通过酶联免疫吸附测定法测定灰质中α-突触核蛋白浓度的降低[39]. 目前的免疫组织化学分析显示，整个同侧海马的α-突触核蛋白和突触素免疫反应性较低，尤其是CA3。这项研究的发现证实并扩大了以往报告的时间评估，显示伤后1周和2周皮质α-突触核蛋白丰度较低，而在TBI后数小时至8周，海马的蛋白质损失时间更长。有趣的是，Western blot分析显示，损伤后4周海马α-突触核蛋白丰度出现短暂恢复。虽然需要做更多的工作来更好地理解导致单体α-突触核蛋白减少的机制，但这一发现可能代表了一条双相曲线，以及通过在当前研究中评估的时间点完成的超微结构分析显示，海马中发生的突触丢失和突触发生的组合[54]. 我们目前的研究结果也显示，同侧纹状体的α-突触核蛋白丰度较低，但这种变化仅限于测量的最急性时间点（损伤后6小时）。目前的研究设计没有明确阐明α-突触核蛋白短暂纹状体减少的机制；然而，这种减少可能是α-synuclein物种从单体翻译到另一种未被所用抗体检测到的状态的结果。可能还需要利用富含突触体的裂解物来增强对纹状体α-突触核蛋白丰度变化的检测，因为我们之前已经证明这种方法对损伤后1周的突触蛋白变化敏感[56]. 先前使用CCI模型的研究报告称，成年野生型CD1小鼠损伤后1个月和2个月，黑质和组织匀浆中包含多个中脑区域的α-突触核蛋白丰度增加[40]和成年Sprague-Dawley大鼠[41]. 目前的研究并未关注黑质，但与之前的报告一起，我们在纹状体的发现表明，黑质纹状体通路的组成部分可能对TBI有不同的反应。

可溶性单体α-突触核蛋白丰度的降低对神经元功能具有重要意义，因为越来越多的文献支持α-突触核蛋白在突触前神经递质释放以及突触小泡池的维持和运输中的生理作用[19,18,42,23,43,44]. α-突触核蛋白促进突触小泡聚集并限制小泡的运动，从而影响小泡对接动力学和神经递质释放[45,19,18]. α-突触核蛋白还可以促进SNARE复合体的形成，SNARE是突触间隙小泡对接的关键蛋白质机制[18]通过与synaptobrevin-2的结合[46,18,47]. 强调了α-突触核蛋白的复杂作用，对于α-突触核蛋白在神经递质释放中的直接作用存在一些争议，因为已发表的研究利用多种在体外和体内模型表明，α-突触核蛋白水平的遗传调节导致释放减少[42,48–50]，增强版[44,43,51,52]，或版本没有变化[19,18,23,53]. 鉴于α-突触核蛋白在囊泡对接和神经递质释放中起着复杂的作用，对可溶性单体α-突触核蛋白的时间和区域变化的更好理解对于理解和靶向神经退行性变背景下的α-突觉核蛋白相关神经递质损伤至关重要。

我们之前已经证明，较低的可溶性单体α-突触核蛋白水平与CCI或液压冲击损伤后海马SNARE复合物形成的减少有关[24,25]. 结合我们目前的研究，这些发现表明突触蛋白的变化发生在多个大脑区域和多个实验性TBI模型中，这突出表明需要进行额外的工作来了解整个损伤谱中α-突触核蛋白的变化。我们以前曾报道过背海马CA3区是SNARE蛋白丰度显著变化的区域[26]. 在目前的研究中，在损伤后1周，背海马CA3中α-突触核蛋白免疫反应性的降低比突触素的丢失更为显著。与之前关于大鼠CCI模型的报告相比，该模型详细描述了整个海马突触素蛋白水平的时间变化[24,25]和CA1突触密度的时程超微结构评估[54]与突触密度的减少相比，CCI后几天α-突触核蛋白的减少更大，这表明神经元和突触的丢失可能不能完全解释CCI后α-突触核蛋白的急剧减少。然而，除了突触素强度评估外，可能还需要其他更直接的方法来确定细胞丢失对α-突触核蛋白丰度变化的贡献。虽然我们没有按照Scheff等人（2005年）的研究专门评估CA1，但观察到的海马α-突触核蛋白免疫反应性的变化可能是由于CA3和其他海马亚区的神经元丢失，以及CCI后Schaffer侧支或海马三突触回路的其他部分的随后变化所致。另外，考虑到急性突触素免疫反应性丢失的程度小于α-突触核蛋白，目前的研究结果表明α-突触素蛋白可能更脆弱，或者它反映了其构象和聚集状态的变化[32,55]. α-突触核蛋白丰度的急性降低可能通过治疗干预减弱，目的是改善神经传递。我们之前已经证明，与溶媒治疗相比，每天创伤后服用1.0mmol/kg/d锂可增加海马和纹状体单体α-突触核蛋白的丰度，这与CCI后几周纹状体多巴胺神经传递和认知能力的改善有关[56,25]. 需要进行更多的工作，以扩大我们对TBI后α-突触核蛋白减少的机制的理解，并确定可以恢复α-突触素丰度以促进突触和神经行为功能恢复的治疗干预措施。

病理改变的突触核蛋白在几种慢性神经退行性疾病的发病机制中的作用越来越被人们所认识。与α-突触核蛋白聚集相关的神经退行性疾病谱，包括但不限于PD、路易体痴呆（DLB）和阿尔茨海默病路易体变体，统称为突触核细胞病[57–60]. 家族性帕金森病（PD）患者α-突触核蛋白基因突变导致α-突触核蛋白不溶聚集[61,62]在散发性PD和DLB中作为路易小体和路易神经节的主要成分起致病作用[63–68].

在被诊断为慢性创伤性脑病（CTE）的尸检大脑中，约20%的大脑中也存在α-突触核蛋白阳性的路易小体[69]诊断为CTE的职业运动员中缝背核α-突触核蛋白免疫反应性慢性增加[70]. 在严重TBI后急性切除颞叶皮质活检组织（数小时至数天）的一组病例中，除轴突积聚aβ前体蛋白（APP）和弥漫性aβ斑块外，还观察到氧化α-突触核蛋白免疫反应和α，β，γ亚型免疫反应增强[32,27]. TBI患者在存活时间最早为4小时和最长为4周的受损神经元中也观察到氧化α-突触核蛋白免疫反应增强[33,31]. 在小鼠CCI损伤后1周，在老年动物纹状体和胼胝体的皮层和轴突轨迹中观察到硝化、氧化和构象改变的α-突触核蛋白的病理形式，但在年轻小鼠中存在有限的免疫反应性[55]. 虽然当前的研究重点是检测TBI诱导的α-突触核蛋白可溶单体形式的变化，但之前关于翻译后修饰的α-联核蛋白形式的报告表明，α-突触核蛋白的急性和持续变化发生在人类TBI中，并在实验性TBI模型中进行了重述。对TBI诱导的单体α-突触核蛋白以及β、γ-突触核苷亚型变化的进一步了解，可能有助于阐明导致α-突触素病理形态形成的途径及其在TBI后慢性神经退行性变中的作用。

结论

我们的结果表明，在实验性TBI的大鼠控制性皮层撞击模型中，海马、皮层和纹状体的可溶性单体α-突触核蛋白水平在损伤后数天到数月内发生了不同的变化。这些变化可能有助于突触生理过程的中断，损伤神经元传递，并导致TBI后的慢性神经变性。

致谢

脚注

参考文献