介绍
最初有反应或部分有反应的肿瘤出现耐药表型被建模为一个多步骤过程1–4最初，在药物攻击后，只有一组持久性细胞（也称为药物耐受性持久性细胞）能够耐受癌症治疗并存活下来。这些细胞构成了一个细胞库，在癌症治疗下积极生长的耐药细胞最终可以从中产生三,5,6在三阴性乳腺癌（TNBC）中，遗传和转录组学机制都被提出，通过结合选择性和适应性进化模式，推动癌症向化疗耐药进化7患者衍生异种移植物（PDX）新辅助化疗后多克隆可逆药物耐受状态的最新鉴定8提示TNBC化疗耐药的最早步骤不是由遗传改变驱动的，而是由多个癌细胞的非遗传可塑性驱动的。同样，在其他类型的癌症中，药物耐受状态仅以靶向治疗或化疗引起的转录组学和表观基因组特征的变化为特征9–11.
由于大量和单细胞方法，许多癌症类型的遗传史已被广泛建模7,12相反，对于表观遗传异质性和表观遗传改变获得的动力学知之甚少。虽然最近的研究集中在DNA甲基化的进化上13,14在对基因表达最稳定的表观遗传锁中，更通用的表观基因修饰对肿瘤进化的贡献仍知之甚少。细胞可塑性的关键因素——组蛋白修饰的抑制性和允许性的单细胞方法，最近才出现15,16从而能够研究生物系统内的表观基因组多样性。用单细胞染色质分析法研究PDX内腔癌和三阴性癌获得性耐药病例，我们已经确定了肿瘤内表观基因克隆的例子，仅由H3K27me3景观定义15。我们在最初未经治疗的肿瘤中检测到抗药性样H3K27me3景观，提出组蛋白修饰是肿瘤进化过程中的一个分子角色。在这里，我们关注耐药人群出现之前癌症治疗的最早步骤，以确定驱动药物耐受的最初表观遗传学机制。由于单细胞分辨率化疗下的表观基因组和转录组进化特征，我们表明H3K27me3景观，而不是H3K4me3，是初始化疗损伤后癌细胞进化的代表。我们发现，在未经处理的细胞中，持久表达程序处于双价染色质结构，并被H3K27me3锁定。通过追踪细胞谱系和转录组学，我们进一步揭示了H3K27me3是TNBC初始化疗暴露后细胞命运的关键决定因素：剥夺H3K17me3细胞可增强每个肿瘤细胞耐受化疗的潜力。最后，防止细胞受到去甲基化H3K27me3的化疗损伤会抑制其耐受化疗的潜力，并延缓肿瘤复发体内.
结果
从患者肿瘤模型中提取持续细胞
我们重点关注残留TNBC中的药物耐受机制，对于残留TNBC，患者的预后最差。由于疾病进展时不定期进行活检，因此不容易研究辅助化疗的耐药性(). 为了规避这些限制，我们建模，体内和在体外患者的药物反应表型。体内，我们首先治疗了三种PDX模型——PDX_95、PDX_39和PDX_172，这三种模型是由残留TNBC患者建立的15,17与卡培他滨合用，这是治疗残留乳腺肿瘤的标准(,). 在第一轮化疗后，小鼠表现出病理学完全反应（pCR），但肿瘤最终复发（“复发”），小鼠再次接受化疗，肿瘤对化疗有不同程度的反应，一些肿瘤在治疗中保持恒定体积（“抵抗”）(). 这些复发性肿瘤可能是由持续存在的细胞引起的，这些细胞在最初的化疗治疗中存活下来5我们通过将小鼠的脂肪垫与pCR（从4到14，). 为了对部分反应的临床情况进行表型分析，我们还为一个模型生成了“残留”肿瘤（PDX_95，n=2）()服用一半剂量的卡培他滨。
体内外TNBC中基底细胞池的鉴定。a.TNBC患者护理标准示意图和患者衍生异种移植模型的生成。b.随时间（天）变化的相对肿瘤体积（RTV）图。彩色生长曲线对应于scRNA-seq进一步研究的肿瘤。黑色箭头表示对相应的小鼠开始第二轮卡培他滨治疗。c.（Up）显示表型和细胞数，括号中显示用于采集样本的小鼠数量。PDX scRNA-seq数据集的（向下）UMAP表示，根据原始样本着色（显示第一个面板-集群ID）或日志2持久性细胞和未处理肿瘤细胞之间差异表达基因的基因表达信号（剩余面板），log2FC和调整P（P）值显示在图表上方。d.（左）维恩图显示了3种PDX模型中持久性细胞激活的通路的交叉点，在MSigDB c2_促乳/哺乳和c7_Hallmark通路之间。P（P）与交叉点相关的值如下所示（多组交叉点的精确测试）（右）条形图显示了持久性细胞中激活的前5条路径（每种类型）。x轴对应-log10调整后的P（P）PDX_95型的值。e.用5-FU（绿色代表持久细胞，橙色代表耐药细胞）或DMSO（未经处理的灰色线）处理的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468（MM468）的细胞增殖的图形表示。f.（上）实验设计的示意图。显示了D0处细胞的实验编号和相应通道。MDA-MB-468细胞scRNA-seq数据集的（向下）UMAP表示，根据原始样本（显示第一个面板-集群ID）或日志着色2持久细胞（簇R2）和未处理细胞（簇R10，14韩元和TGFB1型面板）或两个持久性集群之间差异表达的基因，即集群R4 vs R2(CDH2公司面板）。未经处理的人群（灰色）对应于DMSO-D0-#1。g.（左）scRNA-seq的UMAP表示，如1f所示，仅限于检测到谱系条形码的细胞。单元格根据沿袭条形码着色，并指示集群成员身份(). R1、R2对应于RNA-inferred clusters。（右）scRNA-seq数据中检测到的谱系条码多样性在集群和样本之间的散点图。颜色与样品ID对应，如1f所示。（持久性聚类R2和R4的平均值，双侧Wilcoxon秩检验）。
体外，我们用氟尿嘧啶（5-FU）治疗一个最初对化疗敏感的TNBC细胞系（MDA-MB-468）18，卡培他滨的活性代谢物，未转化在体外我们通过延长5-FU治疗（>15周，). 3周后，只有少数细胞存活下来（占初始人群的0.01%，)其中少数民族（36%）在10-15天后分裂(); 这组细胞在最初的化疗中存活下来，被称为“持久性”细胞。15周后，出现了耐药细胞群，与未经处理的细胞和IC相比，耐药细胞的数量增加了一倍50比未经治疗的人群高4倍以上().
基底细胞池的鉴定
为了描述未经处理的细胞向化疗耐受和随后的化疗耐药的转录组进化，我们在细胞系和PDX模型中进行了单细胞RNA-seq(,&).体内scRNA-seq是鉴定绝大多数间质小鼠细胞中罕见的人类持续性细胞的关键。从脂肪垫中，我们通常每个小鼠分离出数百个持久性细胞。体内，来自不同小鼠的持久性细胞分为一个或两个表达簇().体外，具有不同表达程序的不同细胞群（res#1、2和3），来源于持久性细胞池，所有这些细胞在实验中都分组在共同的簇内（基于scRNA的簇R2/R4，).体内和在体外与未经处理的细胞相比，持久性细胞反复激活一组共同的通路(,,). 起源于韩元5-在表达癌细胞的情况下，持续存在的细胞会反复激活一系列基因，从而进一步确定基底细胞的身份，例如14韩元(,). 与未经处理的细胞相比，持久性细胞体内和在体外还显示与上皮-间充质转化（EMT）相关的基因激活(,,)–例如TAGLN公司，它编码一种肌动蛋白结合蛋白，以前的研究表明它可以通过EMT促进转移19、和NNMT公司EMT伴随的代谢变化特征20–22持久细胞还激活了参与TNFα/NF-κB通路的基因。部分持续表达程序仍具有患者特异性：PDX_95和在体外例如，persister细胞表现出TGF-β通路的激活，包括配体和受体在内的多种参与者的表达(，补充表1-4）。
体内，我们发现肿瘤细胞的存留和残留实际上聚集在一起(，簇R4），因此具有共同的表达特征，表明了与残留负荷无关的类似的化疗耐受机制。然而，我们在持续生存的人群中检测到G0/G1中的细胞数量高于残留或未治疗的肿瘤()，概括了一个特征在体外()并与之前的报告保持一致1,9,10,23.体外，我们鉴定了两组持久性细胞（R2和R4簇），它们在其他EMT标记的表达上有所不同，如CDH2公司()和扭转1。早期个体非循环坚持者（第33天）仅属于集群R2/CDH2-而分割持久器可能属于R2/CDH2公司-或R4/鼎晖2+(). 总的来说，我们确定了体内和在体外具有EMT标记和活化NF-κB通路的持久性基底细胞库。NF-κB信号通路和EMT相关基因被认为是各种肿瘤类型（包括肺）化疗耐药性的潜在驱动因素24,25，胰腺26，胸部27,28在这里，我们指出NF-κB和EMT途径激活是TNBC化疗耐受开始时最早的常见分子事件，定义了在化疗耐受细胞表型多样化之前靶向化疗耐受细胞的共同弱点。
化疗对细胞命运的影响
为了跟踪治疗应激下的克隆进化，我们在实验之前在未经处理的MDA-MB-468细胞中引入了独特的遗传条形码(). 我们利用了以前的条形码方法29允许对scRNA-seq数据中的条形码进行稳健检测()，如检测到沿袭条形码的细胞数量所示(). 此外，我们验证了在scRNA-seq数据中检测到的条形码频率与批量检测到的频率相同，从而证实了在scRNA-seq数据中条形码检测的敏感性(). 通过以单细胞分辨率联合检测谱系条形码和表达程序，我们能够监测治疗过程中和每个表达簇内的克隆进化(). 如果非循环坚持者（第33天）是多克隆的（62%的唯一条形码），则R6和R8耐药簇由少数克隆组成（分别为3和4个）。根据批量数据()在5-FU和DMSO暴露下，细胞群中的条形码多样性均随时间而降低。通过实验和时间点CDH2公司-/R2持续簇显著高于CDH2公司+/R4集群（平均41%对8%的唯一条码，P（P）= 1.6 × 10-2,)，表明如果药物耐受状态是多克隆的，那么只有罕见的持久性细胞会切换到CDH2公司+状态。
为了测试在未处理的群体中是否选择了持续存在的谱系，我们接下来使用额外的批量实验比较了起始群体和5-FU-或DMSO处理的细胞之间的条形码频率（实验#3，). 如果存活的细胞没有特定的倾向性，那么它们应该类似于最初未经治疗的人群（第0天，). 与DMSO处理的细胞相比，5-FU处理的细胞的条形码频率偏离了这种随机情况(，r=0.68和r=0.29），表明未治疗人群中存在的一部分谱系具有耐受化疗的倾向。使用我们的单细胞条形码数据集，我们能够在未经治疗的人群中识别出未来的持续性细胞（n=143，在持续性细胞和未经治疗细胞中都发现了谱系条形码），并将其与“非持续性”细胞（n=201，). 这两个细胞群之间唯一的转录组差异是S100A2型，编码钙结合蛋白，以及低密度血红蛋白，它编码一个乳酸脱氢酶，用于治疗前的未来持久细胞。这些结果表明，代谢差异可能是持久性的潜在指标。
基因组和表观基因组特征的动力学
为了阻碍化疗驱动的癌细胞克隆进化，我们接下来研究了这种快速表型进化的分子基础。使用全基因组测序()，我们首先分析了5-FU治疗开始以来持续和耐药细胞群体获得的突变、拷贝数改变（CNA）和相关突变特征。我们无法在实验中发现任何复发突变()或任何CNA（扩增或纯合缺失）或影响任何人群中已知乳腺癌驱动基因的复发突变12只有一小部分在持续细胞中发现的突变归因于5-FU暴露（突变特征1730)与耐药细胞相比，50%以上的获得性突变与5-FU相关(P（P）< 10-10,). 这些结果表明，化疗相关的突变是在一段时间内获得的，这与在持续性细胞中看到的快速表型进化不相容。最后，通过计算每个突变的癌细胞分数，我们确认了持续存在的人群是广泛的多克隆人群()，与沿袭条形码结果一致。
接下来我们研究了化疗期间表观基因组的变化。使用单细胞分析（scChIP-seq），我们观察到H3K27me3动力学捕捉到化疗时细胞状态的演变(,和补充表4）。持久性细胞共享一个常见的H3K27me3模式（簇E1，,)与之相反，耐药细胞分裂成E1和E3簇。与未处理的细胞相比，来自簇E1的细胞显示出H3K27me3水平的反复重新分布，最高的变化（|log2FC |>2并调整P（P）值<10-1)特异发生于转录起始位点（TSS）和基因体()与H3K27me3富集损失相对应（75个区域的对数2FC<-2，2个区域具有日志2FC>2）。这种缺失与scRNA-seq观察到的基因表达的最高变化有关(和)以及22%的坚持者基因-定义为在持久性细胞与未经处理的细胞中过度表达的基因-例如TGFB1型,福克斯Q1，编码驱动EMT的转录因子(，补充表4）。这些表观遗传学变化不一定在耐药细胞群中保持()这表明持久性细胞中存在短暂的表观遗传学特征。
H3K27me3在化疗前抑制持续表达程序。所有实验均在MDA-MB-468细胞中进行。a.scChIP-seq H3K27me3数据集的UMAP表示，单元格根据来源样本着色。持久性和耐药性样本对应于5-FU处理的细胞，表示处理天数。b.与a.中相同，单元格根据簇成员身份着色。E1、E2对应于表观基因组簇。c.通过Fisher精确测试，H3K27me3的富集显著耗尽了持久性细胞中的峰值，而不同基因注释类别中的所有峰值均与之相比（见方法）。完整条表示P（P）值<1.0×10-2空条表示无意义P（P）值。“PC”表示蛋白质编码基因。d.对数中H3K27me3缺失峰的重新划分2表达折叠改变scRNA-seq实验的分位数。e.累计H3K27me3配置文件超过TGFB1型和福克斯Q1在未经治疗和持续性细胞中（D33）。日志2FC和调整P（P）值对应于来自簇E1的细胞与来自簇E2+E4的细胞的差异分析。f.组别E1、E2或E4的细胞与E1的细胞之间的细胞间相互关联得分的小提琴图表示。使用双侧Wilcoxon秩检验比较Pearson的相关得分，P（P）值显示在图的上方。g.代表对数的点图25-FU或EZH2i-1在D33与D0诱导的表达折叠变化。皮尔逊相关分数和相关P（P）显示值。h.批量H3K27me3染色质剖面TGFB1型和福克斯Q1在D33用二甲基亚砜、5-FU或EZH2i-1处理的细胞中。
在未经处理的细胞中，两个表观基因组亚克隆（E2和E4簇，)反复鉴定表明该人群存在表观遗传异质性（n=3个实验）。与来自E4簇的细胞相比（中值相关得分r=-0.34），E2簇内的一部分细胞与来自E1的细胞具有表观遗传学相似性(，49/381个单元格超过r=0.20，P（P）< 2.2 × 10-16). 然而，这些相似性并不影响持久性基因()和细胞仍然可以从持久性细胞池中辨认出来（E2中没有细胞的r得分超过E1中位r，P（P）< 2.2 × 10-16). 这表明，当暴露于化疗时，E2细胞可以为持久性群体提供燃料，需要化疗诱导的染色质变化来实现耐受。此外，我们还检测到具有持久表观遗传学特征的罕见细胞，但仅在我们的三个实验中的一个实验中（60/976细胞-)这表明在没有化疗的情况下很少发生自发过渡到H3K27me3耐药状态。
持久表达式程序被H3K27me3锁定
为了测试H3K27me3的富集是否锁定了未经处理细胞的持续表达程序，我们用EZH2抑制剂（EZH2i-1）UNC1999处理癌细胞31，在没有化疗的情况下，从细胞中耗尽H3K27me3。EZH2i-1治疗现象表现出一种药物耐受状态，因为EZH2i-1诱导的表达fold-changes与早期化疗暴露诱导的持久性细胞的表达fold变化具有特异性相关(,r=0.71，r=0.31，耐药细胞发生变化）。此外，我们观察到EZH2i-1足以激活62%的坚持者5-FU处理后H3K27me3缺失的基因（23/37个基因），表明H3K17me3是其激活的主要锁(和). EZH2i-1也足以导致60%的坚持者不依赖于未经处理细胞中任何H3K27me3富集的基因（78/131基因），例如14韩元表明这些基因可能是H3K27me3调节的靶基因坚持者基因。为了进一步验证这一假设，我们探索了细胞内潜在的“主”转录因子（TF）的存在坚持者基因。使用CheA332，我们鉴定了三种转录因子，福克斯Q1,FOSL1公司和N2RF2气体分别针对34%、42%和29%的坚持者基因(). 所有3个均受H3K27me3调节坚持者基因，5-FU后H3K27me3缺失()并通过EZH2i-1治疗重新表达，指定这些H3K27me3调节的TF为持续表达程序的潜在驱动因素。
持久表达式程序的启动
由于我们在TSS精确观察到5-FU处理后H3K27me3的变化，我们进一步探索了TSS染色质修饰的进化，重点关注H3K4me3，这是一个允许的组蛋白标记，显示在TSS上积累并具有活性转录。与单细胞H3K27me3景观相比，其足以在治疗过程中分离细胞状态()未经处理和持续存在的细胞的单个H3K4me3景观难以辨认(). 在未处理的细胞中已经在TSS处观察到稀疏H3K4me3富集坚持者基因(P（P）< 10-15与一组未表达的基因相比，). 在单个持久性细胞中，H3K4me3的富集在坚持者与未经处理的细胞相比，同一细胞中同时标记有更多H3K4me3持久性基因的基因(P（P）= 4.0 × 10-2,). 基于这些结果，我们推断，在未经处理的细胞中，H3K4me3和H3K27me3既可以在相同的TSS上积累，也可以在不同的细胞中积累，或者H3K4me3可以与H3K17me3一起在相同TSS上的细胞子集中积累。
未经处理的细胞的表观基因组由H3K27me3和H3K4me3的共同积累引发。a.scChIP-seq H3K4me3数据集的UMAP表示，细胞根据原始样本-未处理细胞（D0）和持续细胞（D60）着色。b.（Up）H3K4me3累积富集剖面福克斯Q1在未处理细胞（D0）和持续细胞（D60）中。”ns'代表未经处理和持续存在细胞的差异测试后不显著。（向下）H3K27me3→H3K4me3和H3K17me3→IgG序列ChIP-seq剖面福克斯Q1在未经治疗的人群中。比较轨迹显示，与IgG对照相比，IgG的富集与相关的奇数比和调整P（P）Fisher精确测试的值，针对多次测试进行了调整。c.显示5-FU处理后H3K27me3缺失或未处理细胞TSS处双价染色质缺失的持久基因分数（n=168）的圆环图。候选主TF（持久性基因中的主TF）用括号中相应TF潜在调节的持久性基因数量表示。d.（左）候选主TF（患者39、患者95和患者172）的人类肿瘤样本的H3K27me3和H3K4me3染色质图谱。每个样本都显示了肿瘤细胞的百分比。（右）H3K4me3→H3K27me3和H3K4me3→三个衍生PDX_模型（PDX_39、PDX_95和PDX_172）未处理人群的IgG序列ChIP-seq图谱。比较轨迹显示，与IgG对照相比，IgG的富集程度与相关比值比和调整P（P）Fisher精确测试的值，经多次测试调整。e.H3K27me3和H3K4me3染色质剖面福克斯Q1另外6个人类肿瘤样本。每个样本都显示了肿瘤细胞的百分比。f.显示人类肿瘤样本中富含H3K27me3和H3K4me3双重富集基因的顶部通路的点图。点的颜色与调整后的颜色相对应P（P）数值是通过超几何检验计算出来的，并经过多次检验调整，点的大小与基因比率相对应，即属于该途径的二价基因的比例。星星表示用于建立PDX模型的人类肿瘤样本。
为了测试H3K4me3是否可以在化疗暴露前与H3K27me3在相同的单个细胞中共存，我们在单核小体染色质上连续进行H3K27me3与H3K4me3（或反之亦然）或H3K27me3（或H3K4me3）与同种型对照（IgG）的免疫沉淀。在MDA-MB-468细胞中，与对照组（H3K27me3/IgG）沉淀部分（峰比值>0.15，q值<10）相比，我们检测到1547个TSS显著富集H3K17me3和H3K4me3免疫沉淀的DNA-3,). 我们发现，未经处理的细胞中的二价染色质在与乳腺干细胞和EMT途径相关的基因的TSS中检测到，以及各种发育途径（例如Hedgehog途径、，). 大多数H3K27me3受调节坚持者在未经处理的细胞群中，在双价染色质结构中发现了包括3个候选主TF在内的基因（26个，共37个）。TGF公司-β1、FOXQ1、FOSL1,,和补充表4）。接下来，我们研究了其他TNBC细胞系（HCC38和BT20，)，在我们的3个PDX模型中，n=9个患者样本–其中3个对应于用于PDX衍生的肿瘤（patient_95、patient_39和patient_172）(,). 我们确认所有患者肿瘤中都存在二价程序，并表明配对PDX模型概括了患者样本的二价性(). 在与EMT、乳腺干细胞特性和发育途径相关的基因中也发现了双价染色质(,)以及持久化程序的候选主TF–狐狸q1,KLF4型或TFCP2L1型– (,). 通过从患者到PDX的连续表观基因组数据集，我们证明癌细胞显示出一组二价TSS，这可能导致治疗应激时整个持续表达程序的快速激活。
去除H3K27me3细胞增强化疗耐受性
为了进一步测试H3K27me3是否阻止化疗暴露下的持续细胞出现，我们接下来在三个TNBC细胞系（MDA-MB-468、BT20和HCC38，). 除非活性异构体（UNC2400）外，使用EZH2i-133)和第二个EZH2i（GSK12634我们发现，在不影响EZH2蛋白水平的情况下，清除H3K27me3会增加使用EZH2-抑制剂的持久性细胞数量，而非活性异构体则没有影响(,). 通过比较不同条件下的大量谱系条形码频率，我们进一步证明EZH2抑制剂通过挽救5-FU治疗引起的偏倚谱系频率，实际上影响了化疗暴露下的细胞命运(,). 我们观察到，在5-FU或DMSO处理的人群中，与EZH2i-1或EZH2i-2的联合处理增加了谱系频率之间的相关分数，而与非活性异构体的联合处理对谱系频率没有影响(,). 执行联合单细胞转录组学和谱系追踪，如然后，我们比较了在有或没有EZH2i-1（分别称为“EZH2i-1持久器”和“持久器”）的5-FU暴露下表达簇中唯一条形码的比例(). 我们观察到，用EZH2i-1共同处理细胞显著增加了细胞中独特谱系条形码的比例CDH2公司+持久性种群，在（R3集群，P（P）< 10-4增加2倍以上，). 总之，我们的结果表明，EZH2抑制剂耗尽H3K27me3可以挽救化疗治疗中观察到的偏倚谱系频率，并使更多种类的细胞转换为CDH2公司+药物耐受状态。总的来说，从未经处理的细胞中耗尽H3K27me3不仅启动了一个持久性表达程序，而且还增强了每个癌细胞耐受化疗的潜力。
EZH2抑制可挽救化疗暴露后的细胞命运偏见。所有实验均在MDA-MB-468细胞中进行。a.表示单用5-FU或5-FU和EZH2i治疗21天后细胞数量的直方图，相对于D0时的细胞数量。化疗前用EZH2i-1、非活性EZH2i-1或EZH2l-2预处理细胞10天。（n=3，平均值±标准差，方差分析测试）。b.根据血统条形码频率，使用Spearman相关分数，通过批量分析检测到的样本聚类。c.scRNA-seq数据集的UMAP表示，根据来源样本着色。用二甲基亚砜（未经处理）或单用5-FU（持续）或用5-FU+EZH2i-1（持续）处理细胞。d.scRNA-seq数据集的UMAP表示，条形码细胞根据层次聚类进行选择和着色。e.（左）scRNA-sq数据集UMAP表示。条形码细胞根据谱系条形码进行选择和染色。（右）层级簇内和样本间scRNA-seq数据中检测到的谱系条形码多样性直方图。颜色对应4c中的样品ID。唯一条形码/总条形码的比率P（P）显示值（双侧费希尔检验）。
防止H3K27me3去甲基化抑制化学耐受性
最后，我们使用KDM6A/B抑制剂（KDM6A/Bi–GSK-J435)同时进行化疗。我们测试了在体外和体内GSK-J4在化疗暴露后减少持续细胞池的能力，这说明持续细胞数量减少会增加复发延迟。体外与EZH2i相反，与KDM6A/Bi联合治疗导致第21天的持续细胞数量减少，并在第60天进一步抑制5-FU下的持续细胞生长，而对未治疗的癌细胞没有影响(,). 有趣的是，一旦出现持久性细胞，而不是与化疗联合使用KDM6i是无效的(,)，表明从未治疗状态转变为药物耐受状态，而不是药物耐受状态本身，对KDM6i敏感。这些结果在另外两个TNBC细胞系BT20和HCC38中得到证实().体内，我们的目的是测试KDM6i在化疗同时给药时限制持久性细胞出现的潜力。我们比较了单用卡培他滨（n=25）或联合KDM6i（n=25i）治疗的小鼠的无病生存时间。在没有化疗的情况下，服用KDM6i不会抑制肿瘤进展，也不会对小鼠产生毒性(). 然而，联合化疗后，它显著增加了复发的延迟(,P（P）= 4.0 × 10-2)与单纯化疗相比。我们的在体外和体内这些结果共同表明，一部分癌细胞可能需要主动去甲基化H3K27me3才能耐受化疗。这些结果与未经处理的细胞中的H3K27me3抑制持久性基因，并在细胞子集中用随机H3K4me3启动的机制一致，H3K17me3的丢失解除了向耐受的过渡。
KDM6i和化疗同时抑制体外化疗耐受性并延迟体内复发。a.在第60天对5-FU处理的MDA-MB-468细胞与DMSO或KDM6i GSK-J4的指示浓度进行集落形成分析。b.在第60天对5-FU处理的MDA-MB-468细胞进行集落形成分析，该细胞与1µM GSK-J4或其非活性异构体GSK-J5结合或不结合，或者在D0时同时添加，或者在化疗第39天添加。c.使用二甲基亚砜、GSK-J4、卡培他滨或卡培他滨和GSK-J4.联合治疗的n=60只小鼠的相对肿瘤体积。虚线表示检测复发肿瘤的阈值，RTV=3。d.自病理完全缓解pCR至初始治疗（肿瘤体积<20 mm）以来的总无病生存概率的Kaplan-Meier图三)、治疗的小鼠数量和P（P）指示值（对数-秩检验）。
讨论
我们的研究表明，H3K27me3景观是TNBC化疗暴露后细胞命运的决定因素。我们证明，在治疗前，细胞显示出双价染色质景观，用H3K4me3和H3K27me3启动持续表达程序。换句话说，基因已经准备好被H3K4me3激活，但被H3K27me3抑制，这仍然是激活持久表达程序的锁。使用EZH2抑制剂和谱系追踪策略，我们进一步证明，从表观基因组中耗尽H3K27me3可以挽救化疗损伤时通常观察到的细胞命运偏见；细胞在最初的化疗损伤中存活的概率相等。持久性细胞可以是没有H3K27me3的细胞，也可以是释放H3K17me3锁的细胞，或者是这两种现象的混合，如图所示：用H3K26me3脱甲基酶抑制剂和5-FU共同处理细胞，我们减少了，但并没有完全消除持久性细胞的数量。我们提出，在化疗暴露开始时将化疗与组蛋白去甲基化酶抑制剂相结合，可以通过减少持久细胞库来延缓复发。一些研究已经开始探讨哪些表观遗传修饰物可以调节持久性或抗性细胞的表达程序10,34,36,37在这里，我们表明，即使在治疗之前，表观基因组就已经是一个关键因素，启动了持久程序。我们的发现突出了染色质景观如何影响癌细胞的化疗耐受潜能。
我们的发现是，在治疗开始时使用EZH2抑制剂耗尽H3K27me3，会增强化疗耐受性，这就对H3K17me3景观在癌症进化中的作用以及EZH2i在癌症治疗中的使用提出了疑问。根据给药的背景和时间，EZH2i可能具有截然不同的效果，在联合治疗之前，应仔细考虑这些微妙之处。与我们在治疗开始时的观察结果相反，具有长期获得性化疗耐药的TNBC癌细胞显示DNA低甲基化和转座元件上的大H3K27me3结构域，因此易受EZH2i的影响38最近还发现EZH2i可导致肿瘤细胞中MHC I类上调，从而显示出有益的免疫治疗效果39,40如果这种细胞可塑性代表了一个治疗机会，我们的结果还表明，在某些情况下，EZH2i也可能导致一组驱动药物持久性的基因的激活。
在肿瘤细胞中发现了分离的二价启动子实例41,42在这里，我们详尽地绘制了全基因组的二价启动子，揭示了乳腺干细胞基因的表观基因启动和TNBC中已知耐药途径的信号通路43包括Hedgehog、WNT、TGF-β和ATP-结合盒药物转运途径。这种表观基因启动让人联想到发育双价启动机制44在分化前的干细胞中发现，似乎是治疗应激时基因快速激活的关键。目前尚不清楚为什么只有少数二价基因在化疗暴露后通过基因重新激活而成为靶点，这可能与治疗本身的性质有关，以及这种启动机制是否可以在不同的癌症类型中共享。确定针对H3K27me3和H3K4me3作者和读者针对治疗应激下癌症类型特异性二价基因的TSS的确切机制，将有助于确定可能作为治疗靶点的共因子，以进一步限制持久性细胞的出现。
方法
我们的研究符合所有相关的道德规范。老鼠护理和饲养符合机构指南和法国道德委员会的规则（项目授权号：02163.02）。在居里研究所的机构审查委员会批准后，对患者样本进行了研究。
患者样本和PDX模型
本研究中使用的患者样本（n=9）来自居里研究所治疗的新辅助化疗后残留三阴性乳腺癌患者，他们对分析表示知情同意。在本研究中，我们使用了三种新辅助化疗后三种不同残留三阴性乳腺癌的异种移植模型（HBCx95称为PDX_95，HBCx39称为PDX_39，HBCx172在原稿中称为PDX _172，见补充表5），这三种模型是先前在居里研究所建立的，并得到患者的知情同意45,46。本研究中使用的所有雌性瑞士裸鼠（所有实验开始时为6-7周龄）均购自Charles River Laboratories，并在特定无色素条件下保存。老鼠护理和饲养符合机构指南和法国道德委员会的规则（项目授权号：02163.02）。伦理委员会允许的最大肿瘤尺寸为2000 mm三对于所有小鼠，最大肿瘤大小不超过1500 mm三.
：五只小鼠未接受治疗，并作为对照（称为“未经处理的”），27只小鼠口服卡培他滨（希罗达；罗氏实验室），剂量为540 mg/kg，每周5天，持续6-14周。相对肿瘤体积（mm三)如前所述进行测量17.在第一轮化疗后处死8只小鼠以进行研究”残留物“肿瘤（2只小鼠）或”坚持者“（6只小鼠）人类肿瘤细胞。七只老鼠经常性的“肿瘤（肿瘤体积在200到600毫米之间三)接受第二轮卡培他滨治疗，无论是否有效。“抗性“指在第二轮治疗中保持恒定体积的肿瘤。
：三只小鼠未接受治疗，并作为对照（称为“未经处理的），14只小鼠以540 mg/kg、5天/周的剂量口服卡培他滨治疗7周，并处死进行研究坚持者“人类肿瘤细胞。
：六只小鼠未接受治疗，并作为对照（称为“未经处理的“），四只小鼠口服卡培他滨7周，然后处死进行研究”坚持者“人类肿瘤细胞。
：5只小鼠用二甲基亚砜腹腔注射，5只小鼠单独用GSK-J4腹腔注射，剂量为50 mg/kg，每周5天，共25天。25只小鼠以540 mg/kg的剂量口服卡培他滨，每周5天，共治疗36天，25只小鼠与卡培他宾和GSK-J4联合治疗36天。肿瘤体积（mm三)随访复发情况。：无病生存期定义为观察到完全缓解（相对肿瘤体积）之间的天数实时电视与第一轮卡培他滨治疗后开始治疗时的体积<0.2）和复发肿瘤的出现（RTV>3）相比。使用对数秩检验进行统计分析。
在下游分析（scChIP-seq、scRNA-seq或序列ChIP-seq）之前，用胶原酶I（Roche，参考号：11088793001）和透明质酸酶（Sigma-Aldrich，参考号：H3506）的混合物在37°C下消化对照和治疗的肿瘤2小时。然后使用0.25%胰蛋白酶-Versen（Thermo Fisher Scientific，参考号15040-033）、Dispase II（Sigma-Aldrich，参考号D4693）和DNase I（Roche，参考号11284932001）的混合物在37°C下对细胞进行个体化，如前所述47然后，将eBioscience红细胞裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，参考号：00-4333-57）添加到细胞悬浮液中，以去除红细胞。为了提高最终细胞悬浮液的活性，使用死细胞去除试剂盒（Miltenyi Biotec，参考号：130-090-101）去除死细胞。
细胞系、培养条件和药物治疗
MDA-MB-468细胞（ATCC，HTB-132）在DMEM（Gibco-BRL，参考号：11966025）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（Gibco-BRL，参考号10270-106）。HCC38（ATCC，CRL-2314）和BT20（ATCC、HTB-19）细胞系在RPMI 1640（Gibco-BRL，参考号：11875085）中培养，补充10%热灭活胎牛血清。所有细胞系均在加湿的5%CO中培养2在37°C的大气中，支原体检测为阴性。GSK-J4（KDM6A/B抑制剂，Sigma，参考号：SML0701）、GSK-J5（GSK-J4-非活性异构体，Abcam，参考编号：ab144397）、UNC1999（EZH2抑制剂，Abcam-参考号：ab146152）、UNC2400。用5μM的5-FU（Sigma，参考号：F6627）单独或与KDM6A/Bi或EZH2i联合处理细胞，持续指定的天数。对于EZH2i，用UNC1999、UNC2400或GSK126预处理细胞10天，然后再添加5-FU 21天(和).
集落形成分析
将TBNC细胞以每孔200000个细胞的密度放置在6个多孔板中，并用指定的药物处理60天（MDA-MB-468，和)或56天（BT20）或50天（HCC38）(). 培养物在含5%CO的潮湿37°C培养箱中培养2在空气中，用显微镜监测处理板的生长情况。在最大病灶形成时，用0.5%结晶紫（Sigma，参考号：C3886）染色后评估菌落形成。
细胞增殖、倍增时间和IC50
用台盼蓝（Invitrogen，参考号：T10282）排除试验对MDA-MB-468、HCC38和BT20细胞进行染色，并在指定的治疗时间使用Countess自动细胞计数器（Invitrogen，参考号：C10228）进行计数(和).
加倍时间()使用以下公式计算：加倍时间=持续时间×log（2）/（log（最终浓度）-log（初始浓度））。
对于未治疗状态和耐药状态，在10天内对细胞群的细胞数量进行评估（n=3）。对于持续状态，在治疗的第13天和第30天在显微镜下手动计数细胞。通过27天内每4天测定一次细胞数（n=9个单细胞），研究了5-FU分裂持续细胞从单个细胞到融合集落的倍增时间。
将MDA-MB-468未经处理和耐药细胞以每孔10000个细胞的密度放置在96个多孔板中，并用增加浓度的5-FU（1μM至0.5 M）处理72小时。使用XTT试剂盒（Sigma，参考号：1146501501）和IC检测细胞毒活性50计算为获得50%细胞活力所需的5-FU浓度().
根据两种生物标记物的组合，将细胞分为“持久性”、“生长持久性”或“抗性”：（i）5-FU下加倍时间，（ii）IC50至5-FU(,):
值得注意的是，由于持续细胞数量较少（初始群体的0.01%），我们无法测量IC50至这两种状态中的5-FU。
对于用5µM的5-FU处理细胞，并显示GSK-J4或GSK-J5的浓度（D-5表示在5-FU治疗（D0）之前用GSK-J3或GSK-J预处理5天，D0表示5-FU和GSK-J或GSK-J5共同治疗，D10和D30表明，GSK-J4或GSK-J5分别在5-FU治疗开始后10天或30天开始治疗（D0）。在第42天在显微镜下手动计数持续细胞数（n=3）。
GraphPad PRISM 9用于统计，结果表示三个独立实验的平均值±s.d。使用Bonferroni检验进行统计分析，以对样本进行多重比较(,,和-右）或单侧Wilcoxon秩检验，用于比较两种情况(-左）。
蛋白质印迹
在、DMSO和EZH2i处理的细胞在95°C的Laemmli缓冲液中溶解10分钟（50 mM Tris-HCl[pH6.8]，2%SDS，5%甘油，2 mM DTT，2.5 mM EDTA，2.5 mM-EGTA，4 mM原钒酸钠，20 mM氟化钠，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂）使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，参考号：23225/23227）测量蛋白质浓度。然后在4-15%Mini-PROTEAN TGX无染色凝胶（Bio-Rad，参考号：4568085）上以160V分离10µg蛋白质。转移后，在室温下将膜在含有0.1%吐温-20和1%牛奶（Regilait）的PBS（pH 7.4）中封闭1小时。将抗H3K27me3（1/2000，Cell Signaling，参考号：9733）或EZH2（1/1000，Cell信号，参考号5246）或Tubulin（1/100，Thermo Fisher Scientific，参考号31460）的一级抗体稀释在pH 7.4、0.1%吐温-20的PBS中，在4°C下过夜。在室温下用稀释在PBS pH 7.4、0.1%吐温-20中的抗兔或小鼠过氧化物酶偶联二级抗体（1/10000，Thermo Fisher Scientific，参考号31460或参考号31430）孵育2小时后，发现了抗体特异性标记带（Bio-Rad、ChemiDoc MP）使用SuperSignal West Pico PLUS化学发光基板（Thermo Fisher Scientific，参考号：34579）。
慢病毒包装与细胞转导
慢病毒是通过将条形码质粒pRRL-CMV-GFP-BCv2AscI和p8.9-QV和pVSVG转染到HEK293T细胞中产生的，如前所述30在第11代用条形码库（pRRL-CMV-GFP-BCv2AscI）产生的慢病毒感染来自ATCC的MDA-MB-468细胞，该条形码库包含18206个随机延伸20 bp的不同条形码，感染的多重性较低（MOI 0.1），以最小化多个条形码标记的细胞数。转导三周后，对细胞进行GFP表达分类，以选择插入条形码的细胞，并用于药物治疗。
单细胞RNA-seq
对于每个单细胞悬浮液（DMSO-D0-#1、5-FU-D33-#1、5-FU-D214-#1，5-FU-C67-#2、5-FY-D171-#2、5-FU-D50-#3、5-FU-D77-#3和5-FU-D202-#3）或PDX分离细胞（PDX_95、PDX_39或PDX_172，未处理和持续细胞），根据制造商的说明，在铬单细胞控制器仪器（铬单细胞3'v3，10X基因组学，参考号：PN-1000075）上加载了大约3000个细胞。样品和文库是根据制造商的说明准备的。在PE 28-8-91中的NovaSeq 6000（Illumina）上对库进行测序，覆盖率为50000读/单元。
批量沿袭条形码库准备和排序
通过从感兴趣的细胞中分离基因组DNA来恢复世系条形码（NucleoSpin Tissue，细胞和组织DNA迷你试剂盒，Macherey Nagel，参考号：740952.50）。从分离的基因组DNA中，通过三个嵌套PCR步骤扩增条形码，如29（底漆顺序见补充表6）。简而言之，在对谱系条形码的共同区域进行第一次特异PCR后，通过添加Illumina测序适配器、索引和纯化，准备扩增材料进行测序。为了平均每个条形码单元获得50次读取，进行了测序。
批量ChIP-seq
如前所述进行ChIP实验15在3x10上6使用抗H3K27me3抗体（1/50，细胞信号技术，参考文献：9733-C36B11）的MDA-MB-468细胞（DMSO-D67-#2，DMSO-D77-#3，DMSO_D113-#4，5-FU-D67-#3和5-FU-D113-#4）。根据制造商的说明，使用NEBNext Ultra II DNA文库准备试剂盒（NEB，参考号：E7645S）准备测序文库。在NovaSeq 6000（Illumina）上以SE50模式对库进行测序。
单细胞ChIP-seq
用1μM CFSE（CellTrace CFSE，Thermo Fisher Scientific，参考号：C34554）培养15分钟，标记细胞（DMSO-D60-#1，DMSO-D77-#3，DMSO_D131-#5，5-FU-D33-#1、5-FU-C67-#2、5-FY-D171-#2、5-FU-D147-#3和5-FU-D131-#6）。然后将细胞重新悬浮在添加了30%Percoll、0.1%Pluronic F68、25 mM HEPES（pH 7.4）和50 mM NaCl的PBS中。如前所述进行细胞封装、珠封装和1:1熔滴融合15，珠条形码的顺序见补充表6。用H3K27me3抗体（1/200，Cell signaling，参考号：9733-C36B11）或H3K4me3抗体（1/2 00，Cell信号，参考号9751-C42D8）进行免疫沉淀，DNA扩增和文库如15.在PE100中的NovaSeq 6000（Illumina）上对库进行测序，在Read 2上有4个暗周期，覆盖率为100000个/细胞。
利用染色质索引进行染色质定量分析
染色质分离、索引、免疫沉淀和文库制备改编自48简单地说，50000 MDA-MB-468在37°C下用MNase在以下缓冲液中溶解并消化20分钟：46 mM Tris-HCl pH 7.4，0.154 M NaCl，0.1%Triton，0.1%NaDoc，4.65 mM CaCl2，0.47×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，参考号：11873580001）和0.09 U/µl MNase（Thermo Scientific，参考编号：EN0181）。然后在16°C下将片段化核小体连接到包含8-bp条形码的双链条形码适配器上至少24小时，以合并样本：Pac1-T7-Read2-8bpBarcode-linker-Pac1（扩展表1）。接下来，收集5个索引染色质样本（DMSO、5-FU、UNC、5-FU+UNC、GSK-J4），每个样本包含不同的8-bp条形码，对每个样本池中总共250000个细胞进行抗H3K27me3 ChIP（1/50，Cell Signaling，参考号：9733-C36B11）。对scChIP-seq进行了ChIP和DNA扩增15为IP和输入池生成测序库，并在NovaSeq 6000（Illumina）上以PE100模式测序。
顺序ChIP-seq
如前所述进行初级ChIP实验15在10×10上6使用抗H3K27me3抗体（1/50，细胞信号传导，参考号9733-C36B11–MDA-MB-468）或抗H3K4me3抗体（1/50，细胞信号传导，参考号9751-C42D8–MDA-MB-468-bis，BT20，HCC38和PDX模型），未经处理的MDA-MB-468、BT20或HCC38细胞或未经处理的PDX_95、PDX_39或PDX_172肿瘤解离细胞。洗涤后，将样品在37°C下在洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8，5 mM EDTA，20 mM DTT，1%SDS）中搅拌洗脱两次，持续15分钟，如中所示。将样品稀释10倍，以降低SDS和DTT浓度。10%洗脱的染色质保留为初级ChIP。使用抗H3K4me3抗体（MDA-MB-468）或抗H3K27me3（MDA-MB-468-bis、BT20、HCC38和PDX模型）或使用抗IgG抗体（1/250，细胞信号，参考：3900–所有样本）作为对照，对剩余的一级免疫沉淀染色质进行二级ChIP（re-ChIP），确定re-ChIP实验的背景水平。清洗后，样品在65°C下在0.1 M NaHCO中搅拌洗脱两次15分钟三和1%十二烷基硫酸钠49在反向交联和DNA清理后，根据制造商的说明，使用NEB Next Ultra II DNA文库准备试剂盒（NEB，参考号：E7645S），使用3至15 ng免疫沉淀DNA制备测序文库。在NovaSeq 6000（Illumina）上以SE100模式对库进行测序。对于MDA-MB-468，我们验证了两种方法（H3K27me3→H3K4me3和H3K4me3→H3G27me3）产生了相似的结果。我们发现通过两种方法获得的1547和2490个二价基因有显著重叠(P（P）= 2.2 × 10-16,)并发现富集途径密切相关（皮尔逊r=0.81，).
冷冻肿瘤样本的切割和标记
切割和标记按照16在50000到100000个细胞核上用指示抗体进行轻微修饰（1/50，细胞信号抗体：抗-H3K27me3，参考号：9733-C36B11，抗-H3K 4me3，参考编号：9751-C42D8）16,50。所有清洗均在500µl的体积内进行，所有离心均使用摆动式离心机在1300g，4 min，4°C下进行核制备，在600g，8 min，4℃下进行后续步骤。机械解离后，通过在6 ml冰镇NE1缓冲液（20 mM HEPES pH7.2，10 mM KCl，0.5 mM亚精胺，20%甘油，1%BSA，1%NP-40，0.01%洋地黄素，1×蛋白酶抑制剂）中冰上培养样品10 min，从10-20 mg冷冻肿瘤组织中提取细胞核并使其渗透。抗体孵育和标记后，样品在55°C下用3µl 10%SDS和2.5µl 20 mg/ml蛋白酶K以最大速度搅拌培养1 h。DNA提取（Qiagen，参考号：139046 MaXtract高密度）后，PCR扩增（17个循环，63°C下20 s联合退火/延伸步骤）使用高灵敏度D1000试剂，在安捷伦TapeStation上对测序文库进行了检测。在PE50模式下，在NovaSeq 6000（Illumina）上对CUT和Tag库进行测序。
全外显子组测序
使用NucleoSpin Tissue，细胞和组织DNA迷你试剂盒（Macherey Nagel，参考号：740952.50）提取样品中的基因组DNA（DMSO-D0、DMSO-D147-#3、DMSO_D171-#5和5-FU-D131-#5，DMSO-D131-#6，5-FU-D67-#2，5-FY-D153-#2、5-FU-D 50-#3，5-FH-D147-#5），并在100×深度的NovaSeq 6000（Illumina）上测序。
