PTPN23结合动力蛋白适配器BICD1，是神经营养素受体内吞分选所必需的

PTPN23与神经细胞中的BICD1相关并部分共定位

为了证实质谱法获得的结果，我们使用N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物进行了联合免疫沉淀实验，并通过共焦显微镜评估了PTPN23和BICD1在神经元细胞中的共定位。首先，通过shRNA-介导的敲除在N2A-FLAG-TrkB细胞中验证抗PTPN23抗体的特异性。通过western blotting观察到，与打乱shRNA处理的样品相比，与PTPN23特异性shRNAs孵育的细胞中PTPN23信号显著降低(图S1A)和免疫细胞化学(图S1B). BICD1免疫沉淀物中始终分离出内源性PTPN23(图1A） 尽管丰度很低，但这表明这些蛋白质之间的联系可能是暂时的，或者说，只有这两种蛋白质的特定亚库在神经元细胞中相互作用。

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图1。

PTPN23免疫共沉淀和 共同定位 运动神经元和神经元细胞系中含有BICD1。（A） 使用蛋白-G磁珠对N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物进行共免疫沉淀，蛋白-G磁珠用亲和纯化的抗BICD1多克隆抗体或兔IgG预包被作为对照。使用抗PTPN23和抗BICD1抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹显示内源性PTPN23与BICD1的特异性联合免疫沉淀(n个=5). （B） N2A-FLAG-TrkB细胞的共焦图像，使用抗BICD1和抗PTPN23抗体进行固定和免疫染色。BICD1富含细胞突起（箭头），而PTPN23在细胞表面附近富集（箭头）。BICD1和PTPN23在核周区（插图）高度丰富，免疫染色部分重叠(n个=6). 比例尺：10μm；嵌入：5μm。（C） ES-MN的共聚焦图像，固定并免疫染色BICD1、PTPN23和神经元标记物βIII-管蛋白，显示BICD1和PTPN23的部分重叠和核周富集(n个=3). 比例尺：10μm。（D） ES-MN的共焦图像。将细胞饥饿并用或不用BDNF刺激1小时，固定BICD1和PTPN23并进行免疫染色(n个=2). 比例尺：10μm。（E） 使用曼德系数量化BICD1和PTPN23共定位（来自D）。每种情况下14个神经元的分析；P（P）>0.05，学生的t吨-测试（ns，不显著）。

神经元BICD1和PTPN23主要是显示点状分布模式的细胞质蛋白(图1B、 C），表明它们与膜细胞器有关(Matanis等人，2002年;Doyotte等人，2008年). 在N2A-FLAG-TrkB细胞中，BICD1在细胞突起尖端积聚最显著(图1B、 箭头所示），而PTPN23在质膜附近最丰富(图1B、 箭头）。最高水平的共定位发生在N2A-FLAG-TrkB细胞的核周区(图1B） 和ES-MN(图1C、 D），高尔基体、MVB和溶酶体也位于此处(霍塔里和海伦尼乌斯，2011年). BDNF刺激后，BICD1和PTPN23的共定位没有发现显著变化(图1D、 E），与ES-MNs和N2A-FLAG-TrkB细胞的质谱实验中观察到的用BICD1调节PTPN23协同免疫沉淀水平相反(表S1). 对这一意外结果的一种可能解释是，NTR贩运和分类可能在这些细胞中受到时间和空间上的不同调节。

BICD1、高尔基人和反式-高尔基网络（TGN）有很好的记录。最值得注意的是，BICD1通过Golgi相关的小GTPase Rab6促进小泡向内质网（ER）的COPI非依赖性转运(Matanis等人，2002年). 相比之下，PTPN23与分泌途径的这些细胞器之间的关系尚不清楚。为此，用布雷费尔丁A（BFA）处理神经元细胞，它抑制ER-高尔基体转运，从而导致高尔基体蛋白逐渐重新分布回ER(Fujiwara等人，1988年). 正如预期的那样，BFA治疗导致BICD1、高尔基体和TGN的传播，正如它们各自的标记物GM130和TGN46的分布所示(图S2A). 然而，PTPN23的核周染色不受这种处理的影响(图S2B). 虽然在对照ES-MN中PTPN23免疫染色与TGN46部分重叠，但在TGN附近PTPN23的积累似乎与该细胞器的完整性无关(图S2B)这表明，与BICD1不同，PTPN23在实验条件下与高尔基体无关。

PTPN23和细胞质动力蛋白与BICD1的N端CC1结构域结合

为了在分子水平上确定BICD1-PTPN23结合的决定因素，我们使用了GST下拉策略。首先，我们培养不同的GST-BICD1融合蛋白(图2A） N2A-FLAG-TrkB细胞的裂解产物过度表达HA-PTPN23。基于之前的结果(Terawaki等人，2015年)，我们预计PTPN23将与BICD1的C末端CC3结构域相互作用，这是一个促进货物（如Rab6和RanBP2）结合的自身抑制区。然而，包含CC2和CC3域的GST-BICD1片段没有显示与HA-PTPN23的任何结合。与之形成鲜明对比的是，我们发现所有含有CC1结构域95–265氨基酸的GST-BICD1重组蛋白都与HA-PTPN23相互作用(图2B） ●●●●。这是出乎意料的，因为BICD1的N末端包含95-265区域，当货物与C末端结合后从其自身抑制状态释放时，已知其与细胞质动力蛋白形成高亲和力相互作用，激活其沿着微管的过程(Hoogenraad等人，2003年;Hoogenraad和Akhmanova，2016年).

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图2。

BICD1和PTPN23直接相互作用在体外.（A） BICD1结构域架构的示意图，描述其螺旋结构域（CC1–CC3），并强调dynein、dynactin、Rab6和RanBP2的已知结合区域。下面是GST-BICD1片段的示意图，带有预测的分子量（MW；kDa）。红色的GST-BICD1蛋白在GST下拉中结合HA-PTPN23。（B） 预先装载GST重组蛋白的GSH树脂与含有过表达HA-PTPN23的N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物孵育(n个=2). GST下降后，使用抗HA抗体通过免疫印迹法评估洗脱蛋白。BICD1-CC1型^95-265是沉淀HA-PTPN23的最短碎片(n个=6). （C） PTPN23域体系结构和His的示意图₆-用于GST下拉的PTPN23碎片，预测MW。他的₆-红色结合GST-BICD1中的PTPN23蛋白。（D） GST-CC1预载GSH树脂^95-265或GST与含有His的细菌细胞提取物孵育₆-PTPN23片段(n个=3). 用抗-His的免疫印迹法洗脱并评估下拉蛋白₆抗体。

为了确定BICD1和PTPN23之间的结合是否直接，我们使用纯化的GST-CC1进行GST下拉^95-265并用细菌表达他的₆-包含不同功能域的PTPN23片段(图2C） ●●●●。这些实验揭示了GST-CC1之间的直接相互作用^95-265和PTPN23的V形线圈（V/CC）域(图2D） ●●●●。GST-CC1之间的相互作用^95-265和His-V/CC^401-653当编码Bro结构域的较长PTPN23片段被表达时，其强度更强，我们检测到His的显著结合₆-Bro-V/CC控制GST。BICD1与PTPN23的Bro和V/CC结构域的关联与它们在货物分拣和MVB生物发生中的既定作用一致(Doyotte等人，2008年).

综上所述，这些实验揭示了BICD1和PTPN23之间的直接相互作用。此外，PTPN23没有结合BICD1的CC3结构域，因此它可能无法从自身抑制的构象中解锁BICD1。重要的是，PTPN23与CC1结构域的相互作用增加了它可能与细胞质动力蛋白竞争BICD1结合的可能性。

绿色荧光蛋白-BICD1^Δ95-265定位于细胞外围

为了进一步验证我们的发现，我们生成了一个缺少PTPN23-结合域（GFP-BICD1）的BICD1突变^Δ95-265) (图3A） ●●●●。如所示图3B、 绿色荧光蛋白-BICD1^Δ95-265在N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物中显示与HA-PTPN23的结合非常有限。这种残余相互作用可能是由于GFP-BICD1的形成^Δ95-265-BICD1公司^重量异二聚体(Terawaki等人，2015年)与BICD1相比，PTPN23结合减少^重量同二聚体。

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图3。

绿色荧光蛋白-BICD1^Δ95-265显示与PTPN23的关联减少。（A） 用于共同免疫沉淀和共焦显微镜的GFP-BICD1蛋白示意图。（B） 用编码HA-PTPN23和GFP-BICD1的质粒转染N2A-FLAG-TrkB细胞过夜^重量或GFP-BICD1^Δ95-265以及使用GFP-trap珠进行联合免疫沉淀的细胞提取物(n个=1). 使用抗HA和抗GFP抗体通过免疫印迹法评估洗脱蛋白，揭示突变GFP-BICD1之间的结合减少^Δ95-265和HA-PTPN23，相对于GFP-BICD1^重量（C）用表达HA-PTPN23和GFP-BICD1变体或GFP的质粒转染N2A-FLAG-TrkB细胞过夜，用抗HA抗体固定并免疫染色(n个=3). 绿色荧光蛋白-BICD1^重量和GFP-BICD1^95-265（见插图）与HA-PTPN23（箭头）共定位，而聚合型GFP-BICD1^Δ95-265转移到细胞外围（箭头）。图像显示最大强度Z轴-叠加投影，以0.5μm的间距获取；插图显示了从各自的Z轴-堆栈。比例尺：10μm，插入：5μm。

接下来，我们评估了HA-PTPN23和GFP-BICD1在N2A-FLAG-TrkB细胞中的分布(图3C） ●●●●。HA-PTPN23和GFP-BICD1的点状分布模式和核周富集^重量类似于内源性蛋白质的定位。相比之下，GFP-BICD1^Δ95-265易位到细胞外周，类似于显性负性BICD2-CC3结构(Matanis等人，2002年)，并且容易聚合(图3C） ●●●●。然而，我们没有观察到该突变体与HA-PTPN23有任何显著的共定位。相比之下，GFP-BICD1^95-265主要表现为弥散分布，与GFP相似。然而，在许多细胞中，我们检测到这种突变体的核周富集，它与HA-PTPN23重叠（见图3C、 插图）。

过度表达的BICD2-CC3已被证明具有显性负效应，导致其与Rab6阳性小泡一起在高尔基体和细胞外周积聚(Matanis等人，2002年). 由于BICD2-CC3和GFP-BICD1的定位模式相似^Δ95-265(图3C类；Matanis等人，2002年)，我们接下来询问该突变的表达是否影响Rab6的定位。在我们的实验中，GFP-BICD1^重量和GFP-BICD1^Δ95-265，但不是GFP-BICD1^95-265，与Rab6阳性囊泡共定位(图S3). 此外，GFP-BICD1^Δ95-265诱导Rab6阳性细胞器定位的改变(图S3（插图）不影响高尔基体的形态。这些结果表明GFP-BICD1的过度表达^Δ95-265缺乏一部分动力蛋白结合区的突变体可能影响内源性Rab6的定位，从而可能破坏由GTPase控制的逆行运输(Matanis等人，2002年;Wanschers等人，2007年).

PTPN23与TrkB阳性内吞囊泡相关

建立了PTPN23–BICD1互动，并考虑到BICD1在NTR贩运中的作用(Terenzio等人，2014a,b条)，我们假设PTPN23可能是NTR动力学的共同调节器。以前的研究结果支持这一假设，因为PTPN23在从ES-MN分离的信号内体的蛋白质组中被鉴定(Debaisieux等人，2016年). 有趣的是，PTPN23与含有NT-NTR复合物的信号内体的关联(Deinhardt等人，2006年)，在内体成熟和随后的轴突运输过程中增加，表明PTPN23可能在信号内体的运输和/或货物分类中发挥作用(Debaisieux等人，2016年). 此外，BICD1和PTPN23均被确定为TrkA的潜在结合伙伴(Emdal等人，2015年)，以及下一代哺乳动物细胞相互作用研究(Hein等人，2015年)发现PTPN23与220 kDa（Kidins220）激酶D相互作用底物（一种NTR-相关支架蛋白）之间的推测关联(Neubrand等人，2012年).

为了测试PTPN23和NTR贩运之间的联系，我们对N2A-FLAG-TrkB细胞中的抗NTR抗体进行了累积分析。用针对TrkB细胞外部分的抗体培养细胞，然后刺激BDNF以促进受体内化(Deinhardt等人，2006年). 重要的是，这些抗体不会干扰NTR的贩运或信号传递能力（数据未显示）。使用这种方法，我们在核周区以点状模式检测到内部化的TrkB，其部分与PTPN23重叠(图4)，这表明，与BICD1类似(Terenzio等人，2014a)，PTPN23与神经细胞内携带内化TrkB的内体相关。

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图4。

PTPN23与含有TrkB的内吞小泡相关。N2A-FLAG-TrkB细胞中抗TrkB抗体积聚试验的共焦图像。将细胞与抗体一起孵育30分钟，并用100ng/ml BDNF追赶30分钟。酸洗和固定后，使用抗PTPN23抗体和Alexa Fluor 488-共轭二级抗体对细胞进行免疫染色。Alexa Fluor 555结合二级抗体用于揭示TrkB的定位(n个=1). 比例尺：10μm；嵌入：5μm。

PTPN23-缺陷细胞积聚p75^NTR公司和TrkB在真空室中

为了确定PTPN23是否是NTR稳态所必需的，我们使用短发夹RNA（shRNA）下调其表达。首先，我们选择了两种以shRNA慢病毒为靶点的加扰（scr）和三种PTPN23，它们都以报告病毒的形式表达GFP。其中两种慢病毒（sh1和sh2）的转导显著降低了PTPN23蛋白水平，这与GFP报告基因的表达呈负相关(图S1). 由于sh2慢病毒的毒性和场外效应（数据未显示），我们选择sh1进行进一步研究。关键的是，PTPN23下调～70%并没有改变TrkB、p75的蛋白水平^NTR公司、BICD1和Kidins220(图5A、 B），表明PTPN23不影响神经细胞中这些蛋白质的水平。

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图5。

PTPN23对于保持NTR的稳态水平并不重要。（A） 用打乱或PTPN23-KD shRNAs转导N2A-FLAG-TrkB细胞72小时。对细胞裂解物进行PTPN23和NTR以及相关蛋白的免疫印迹。使用GAPDH作为负荷控制，并评估GFP慢病毒报告基因的水平(n个=3). （B） 归一化为GAPDH的A蛋白水平的密度分析(n个=3). **P（P）<0.01，未成对学生t吨-测试。

接下来，我们通过最初集中分析内源性p75来确定PTPN23下调是否改变NTRs的细胞分布^NTR公司在N2A-FLAG-TrkB细胞中高表达。N2A-FLAG-TrkB免疫染色显示p75的丰度^NTR公司在细胞表面PTPN23-敲除（KD）和对照细胞之间具有可比性(图S4A)表明PTPN23对p75的稳态排序是不必要的^NTR公司到质膜或其再循环。此外，我们在总p75中没有观察到任何明显的差异^NTR公司水平(图S4B)与我们的免疫印迹结果一致(图5A、 B）。

确定PTPN23下调是否影响p75的内吞分选^NTR公司，我们执行了抗p75^NTR公司抗体（α-p75^NTR公司)累积试验。在对照细胞中，我们检测到α-p75的点状分布^NTR公司主要在核周区域(图6A） 与TrkB的图案极为相似(图4). 然而，在PTPN23-KD细胞中，除了α-p75外^NTR公司puncta，我们观察到α-p75细胞器增大^NTR公司限制膜中的标记(图6A） ●●●●。在使用抗FLAG抗体进行累积试验后，对FLAG-TrkB进行了类似的观察(图S5A). 这种空泡表型与先前报道的PTPN23在非神经元细胞受体分选中的作用的研究一致(Doyotte等人，2008年;Ma等人，2015年)，并且具有由BICD1缺失的ES MNs显示的NTR积累表型(Terenzio等人，2014a).

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图6。

沉默PTPN23导致p75^NTR公司在液泡状腔室中积聚。（A） α-p75的共焦图像^NTR公司打乱和PTPN23 shRNA处理的N2A-FLAG-TrkB细胞中的积累分析(n个=3). 用抗p75抗体培养细胞30分钟^NTR公司抗体并用100 ng/ml BDNF追踪30分钟。酸洗和固定后，使用Alexa Fluor 555结合二级抗体发现受体定位。箭头表示内吞室扩大。图像显示最大强度Z轴-叠加投影，以0.5μm的间距采集。比例尺：10μm；插图：5μm。（B） 100个内体的直径（每个n个/条件）在三个独立实验中使用0.5μm binning进行测量和分组。内切体分为内切体（<1.5μm）或液泡（>1.5μm的）****P（P）<0.0001, χ²趋势的（双尾chi-square）检验(n个=3). （C） 含有内溶酶体或液泡样隔室的细胞的定量(n个=3); 缺乏α-p75的细胞^NTR公司计数累积（约50%的细胞），但不包括在分析中***P（P）<0.001，未成对学生t吨-测试。（D） 透射电子显微镜图像显示了三类具有代表性的含有累积α-p75的细胞器^NTR公司-金色（箭头）。打乱细胞和PTPN23-KD细胞的早期和晚期内吞室无法区分，分别从PTPN23-GD和打乱细胞上拍摄的代表性图像；仅在PTPN23-KD细胞中观察到空泡。比例尺：500 nm；插图：100纳米。

为了评估PTPN23下调对含NTR内体形态的影响，我们测量了含有α-p75的内吞细胞器的直径^NTR公司在对照组和sh1处理的细胞中。α-p75的粒度分布^NTR公司-在PTPN23-KD和对照细胞之间，标记的内溶酶体（直径<1.5µm）和液泡（直径>1.5µ(****P（P）<0.0001; χ²趋势测试；图6B） ，在PTPN23缺失的细胞中，一些液泡直径达到5μm。引人注目的是，只有20%的PTPN23-KD细胞检测到这些大的细胞隔(图6C） 从而表明残余PTPN23(图S1)或者另一种机制有助于p75^NTR公司在这些条件下进行排序。

通过透射电子显微镜进一步交叉检查含有内吞NTR的不同细胞器群(图6D、，图S5B). 与抗p75结合的金纳米粒子^NTR公司抗体（α-p75^NTR公司-金）主要在膜和管状隔室中检测到(图6D、，图S5B)使人想起早期的内体。此外，这些抗体显示p75^NTR公司在晚期内体和溶酶体中积累(图6D） 。在对照组和PTPN23-KD细胞中也检测到这些细胞器，α-p75^NTR公司-仅在PTPN23缺失的细胞中观察到直径大于1.5µm的金色标记液泡(图6D、，图S5B). 这些肿胀的小室没有与MVB中常见小泡相似的内部小泡，并且积聚了α-p75^NTR公司-金靠近其周围的膜，表明PTPN23的丢失导致NTR和与这些细胞器相关的潜在其他货物的分类缺陷。

综上所述，我们的研究结果表明，PTPN23是NTR内吞运输所必需的，其在神经元细胞中的耗竭导致内胚肿胀。至关重要的是，α-p75的积累^NTR公司PTPN23过度表达挽救了液泡(图S6)，证实观察到的表型是PTPN23缺失的直接后果。

抗体

本研究中使用了以下主要抗体（AA，蓄积试验；ICC，免疫细胞化学；WB，western blotting）：鸡抗βIII-管蛋白（#ab41489；Abcam；1:500 ICC）；兔抗BICD1（#HPA041309；阿特拉斯抗体；1:500 ICC，1:1000 WB）；小鼠抗EEA1（#E41120；转导实验室；1:50 ICC）；鼠标防FLAG（M1；#F3040；Sigma；1:500 AA）；小鼠抗GAPDH（#mab374；EMD Millipore；1:5000 WB）；小鼠抗GFP（4E12/8；CRUK；1:2000 WB）；鸡抗GFP（#1010；Aves Labs；1:1000 ICC）；小鼠抗GM130（#61082；BD Biosciences；1:1000 ICC）；大鼠抗HA（F310，#11867423001；罗氏；1:500 ICC，1:1000 WB）；鼠标反His₆（#707996-3MM；诺瓦根；1:1000 WB）；兔抗Kidins220（KNA；CRUK；1:1000 WB）；兔抗p75^NTR公司（CRD5410；1:1000 AA，1:1000 ICC；Deinhardt等人，2007年); 兔抗p75^NTR公司（poly18397，#839701；BioLegend；1:1000 WB）；小鼠抗PTPN23（F-4，#sc-398711；Santa Cruz；1:400 ICC，1:500 WB）；兔抗Rab6（#9625；细胞信号；1:400 ICC）；小鼠抗Rab7（#sc-376362；Santa Cruz；1:1000 ICC）；兔抗TGN46（#ab16059；Abcam；1:100 ICC）；兔抗TrkB（#9872；Merck Millipore；1:1000 AA）；兔抗TrkB抗体（#07-225；Merck Millipore；1:1000 WB）；小鼠抗泛素（FK2，#BLM-PW8810；酶生命科学；1:100 ICC）。

细胞培养和转染

N2A-FLAG-TrkB细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%谷氨酰胺的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）中培养。细胞保存在37°C的加湿培养箱中，并添加5%CO₂达到80%融合率后，用0.25%胰蛋白酶进行传代。如有指示，使用脂质体转染细胞过夜^®3000，根据制造商的说明。对于PTPN23敲除，用shRNA质粒转染N2A-FLAG-TrkB细胞72小时。

慢病毒的产生和细胞转导

针对PTPN23（MSH025913-LVRU6GP）和非靶向shRNA（CSHCTR001-LVRU6-GP）的shRNA是从OmicsLink™shRNA克隆集合（GeneCopoeia）中获得的。psiLVRU6GP载体中的ShRNA在U6启动子下表达，报告基因eGFP在SV40下表达。如前所述制备慢病毒颗粒(Gibbs等人，2018年). 接种后立即转导N2A-FLAG-TrkB细胞，72小时后进行检测。

免疫细胞化学和共焦显微镜

将N2A-FLAG-TrkB细胞或ES MNs分别接种到聚-L-赖氨酸或聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上，并在培养中维持2-3天。在室温下用4%多聚甲醛（PFA）清洗PBS并固定15分钟后，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透细胞10分钟，用10%山羊血清和0.5%BSA在PBS内封闭细胞1分钟h.然后用还原封闭溶液（5%山羊血清，0.5%BSA，PBS）中稀释的一级抗体在4°C下培养细胞过夜，用Alexa Fluor 488-、555或647-共轭二级抗体（1:1000；Life Technologies）和DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）核染色清洗并在室温下培养2 h。使用安装介质（#S3023；Dako）安装盖玻片。图像在LSM510倒置激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss）上拍摄，使用63×/1.40油物镜。

为了分析ES-MN中的BICD1和PTPN23共定位，使用ImageJ中的Diffraction PSF 3D插件生成了一个理论点扩散函数，然后使用并行光谱反卷积2D插件对图像进行反卷积。Co-localisation分析是使用Coloc2插件进行的，该插件提供了Mander的M1和M2系数，稍后用于统计分析。

抗受体抗体累积试验

用DMEM洗涤N2A-FLAG-TrkB细胞两次，然后将其血清饥饿3 h。用兔抗TrkB（1:1000；#9872；Millipore）、兔抗p75培养细胞^NTR公司（1:1000；CRD5410，CRUK）或小鼠抗FLAG（1:500，M1；#F3040；Sigma）抗体在37°C下保持30分钟，然后使用BDNF（100 ng/ml）保持30分钟以促进抗体受体复合物的内化。作为阴性对照，将细胞与物种匹配的IgG孵育。接下来，将细胞在冰上预冷5分钟，用冰镇0.2 M醋酸、0.5 M氯化钠、pH 2.4清洗1分钟（用于抗TrkB和抗p75^NTR公司)或添加1 mM EDTA的无镁无钙PBS（用于抗FLAG），用PBS冲洗并用4%PFA固定15分钟。在通透性和阻断后，通过与Alexa Fluor 555结合的抗兔（1:1000）或抗鼠（1:500）二级抗体孵育，显示出内部抗体。

对于内体直径分布和分类分析，使用63倍物镜通过共焦显微镜对每种情况下每个样品的五个场（PTPN23-KD或加扰）进行成像。在斐济的三个独立实验中测量了100个内体的直径（选择标准为50个“大”和50个“小点状”）。使用0.5μm binning将内切体分为内切体（直径<1.5μm）和液泡（1.51-5μm）。为了确定具有任一表型的细胞比例，在三个独立实验中，使用63倍物镜以1倍放大率对每个条件下的5–7个场进行成像，并对包含内溶体或液泡的细胞以及每个场的细胞总数（平均每个场80个细胞）进行计数。

透射电子显微镜

抗-p75^NTR公司如前所述，抗体（CRD5410，CRUK）与5 nm胶体金纳米粒子（英国生物细胞；0.9 mg/ml）结合(Terenzio等人，2014a). 血清饥饿的N2A-FLAG-TrkB细胞与抗p75孵育^NTR公司-黄金（1:500），如上所述。在用酸、PBS和DMEM清洗后，用4%PFA将细胞固定在Sorensen磷酸盐缓冲液中15分钟，然后用2.5%戊二醛和4%PFA在Sorenens磷酸盐缓冲溶液中在室温下固定20分钟，并按照前面所述进行电子显微镜处理(Terenzio等人，2014a). 扫描网格以确定金的存在，并在所有条件下获得相同数量的图像。对所有含金内部结构进行成像和分类[打乱：37张图像中有77个细胞器（52%为管状囊泡，48%为晚期内体/溶酶体）；PTPN23 KD：39张图像中76个细胞器，39%为管状囊泡，47%为晚期内体/溶菌体，13%为液泡]。

协同免疫沉淀和GFP-trap

如上所述，N2A-FLAG-TrkB细胞在10 cm培养皿中生长至80%融合，并饥饿血清3 h。接下来，用冰镇PBS在冰上清洗细胞，并在0.4%NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.4%NP40，5%甘油）中提取蛋白质（2-4 mg），补充Halt™蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（1:100；Thermo Scientific）。接下来，20μl预洗（PBS中0.02%吐温-20；PBST）磁性镝^®蛋白G（Novex）与2μG抗BICD1抗体或兔IgG在室温下孵育30–60分钟，再悬浮在200μl PBST中。去除未结合抗体后，在4°C下与新提取的细胞裂解液孵育2小时。

磁性绿色（GFP）-陷阱^®根据制造商的说明，使用M珠（Chromotek）沉淀GFP标记的重组蛋白。简言之，在GFP-珠洗缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA）和0.2%NP-40裂解缓冲液中平衡25μl珠，然后在4°C下与新制备的含有过表达GFP-标记重组蛋白的N2A-FLAT-TrkB细胞裂解液孵育2小时。

Dynabeads公司^®/GFP陷阱^®M珠用200μl 0.4%NP-40裂解缓冲液洗涤4×，转移到新鲜试管中并再次洗涤。蛋白质在20μl 1×莱姆利样品缓冲液（LSB）中于95°C下煮沸4分钟洗脱。通过SDS-PAGE和western blotting评估整个洗脱部分。对于输入和流经（FT），分别加载1/50的前或后co-IP裂解液。

协同免疫沉淀和质谱

ES-MN和N2A-FLAG-TrkB细胞分别在Neurobased和DMEM中缺血清3 h，并用/不用100 ng/ml BDNF刺激15 min。细胞提取物在1%NP40 IP缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1%NP40，1mM EDTA），补充Halt™蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（1:100；Thermo Fisher），并与预先结合到磁性蛋白G Dynabeads的抗BICD1抗体孵育^®如上所述。洗脱组分进行SDS-PAGE，所得聚丙烯酰胺凝胶固定并用胶体蓝（Thermo Fisher）染色。然后将香肠切成小块，进行过夜凝胶内消化。使用LTQ-Orbitrap-XL质谱仪分析肽混合物。使用MaxQuant 1.6.03处理原始数据肌肉分枝杆菌作为参考蛋白质组和基于强度的绝对定量（iBAQ）。进一步注释，如基因本体和CRAPome频率(Mellacheruvu等人，2013年)使用Perseus 1.4.02版添加到蛋白质组表中。

克隆

GST下拉中使用的BICD1和PTPN23片段由FastCloning生成(Li等人，2011年). 简单地说，目标DNA（“插入”）通过PCR扩增，所用的引物对包含9–15 bp的悬垂（粗体表S2)，与受体载体上的所需位点互补。使用一对不含悬垂序列且包含插入引物上悬垂序列互补区域的引物扩增受体载体。使用Phusion扩增所有片段^®高保真DNA聚合酶（变性：98°C下10 s；退火：在55–68°C下30 s；延伸率：72°C时为20 s/kb；25次循环）。接下来，将PCR产物用水（1:3）稀释，用Dpn公司I在37°C下持续2小时，混合（3:1，插入：矢量）并转化为XL-10金超活性大肠杆菌（斯特拉赫纳）。

为了表达细菌蛋白，使用pEGFPN1载体中的人类BICD1 cDNA（835 aa，Q96G01-4，NM_001003398）作为源材料，将BICD1片段亚克隆到pGEX-4T-1载体中。使用含有人类PTPN23 cDNA（1636 aa，Q9H3S7-1，NM_015466.3）的HA-PTPN23-pcDNA3.1+质粒将PTPN23片段克隆到pET28a+载体中，如Doyotte等人（2008）作为模板。对于哺乳动物蛋白表达，GFP-BICD1构建物由FastCloning生成。删除构造GFP-BICD1^Δ95-265用一对重叠引物制备(表S2)，包含生态RI限制站点（带下划线）。

重组蛋白的表达与纯化

重组GST-BICD1和His₆-PTPN23片段在SoluBL21™中表达大肠杆菌（Amsbio），在0.4 OD下用1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导₆₀₀21°C，在M9最小介质中过夜（0.6%w/v Na₂高性能操作₄0.3%w/v KH₂人事军官₄，0.05%w/v NaCl，0.1%w/v NH₄氯，100 mM CaCl₂，100万硫酸镁₄0.3%甘油）。使用ProtParam在线预测工具测定重组蛋白的分子量(https://web.expasy.org/portparam).

对于GST-BICD1片段纯化，通过在3000 RPM下离心10分钟来收集细菌。除非另有说明，否则在4°C下执行以下所有步骤。颗粒用PBST清洗两次并进行超声波处理（3×20 s脉冲，冷却间隔1 min；Soniprep 150超声波粉碎机，MSE），置于GST裂解缓冲液中（0.05%吐温20，2 mM EDTA，0.1%β-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，PBS中0.5 mM PMSF）。以14900 rpm离心20分钟，制备不溶性材料。使用谷胱甘肽（GSH）-琼脂糖亲和树脂纯化GST融合蛋白，在4°C下将末端翻转2 h。用0.05%PBST洗涤3×10珠体积的树脂，并用0.05%含有0.5 M NaCl的PBST洗涤一次。

伊斯₆-在裂解缓冲液（50 mM NaH）中通过超声提取PTPN23片段₂人事军官₄pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM咪唑，0.1%β-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，0.5 mM PMSF），如上所述。

GST-BICD1下拉菜单

将预先与GSH-树脂结合的GST-BICD1融合蛋白与新鲜N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物在0.4%NP-40裂解缓冲液中含有过度表达的HA-PTPN23，或与含有等量His₆-裂解缓冲液中的PTPN23片段。接下来，用适当的缓冲液轻轻洗涤树脂4-6次，将其制成丸状，转移到新鲜的试管中并再次洗涤。蛋白质在1×LSB中在95°C下煮沸4 min洗脱，通过SDS-PAGE和使用抗-HA或抗-His的western blotting评估整个部分₆抗体。对于输入，1/50的N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物或1/25–1/50的含有His的细菌裂解物₆-装载PTPN23片段。

蛋白质印迹

蛋白质由4–12%NuPAGE Bis-Tris（Novex）或4–15%Mini-PROTEAN分离^®TGX无污渍™（Bio-Rad）凝胶，并按照制造商的说明转移到甲醇活化的聚偏氟乙烯（PVDF，Bio-Rad）膜上。在室温下，将膜封闭在5%无脂干乳中，在PBST中溶解1小时，并在室温下与一级抗体孵育1小时，在封闭溶液中稀释，或在4°C下过夜。用PBST清洗后，在室温下用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:1000；Dako）培养膜1小时。接下来，用增强化学发光底物（Millipore）培养印迹，并使用ChemiDoc™（Bio-Rad）进行培养。在ImageLab（版本5.2.1，构建11，Bio-Read）中测量密度。

我们感谢Schiavo实验室成员的讨论和建设性意见，感谢David Frith为蛋白质组学实验提供的技术援助。BICD1-pEGFPN1是Casper Hoogenraad教授（荷兰乌得勒支大学）赠送的一份礼物。HA-PTPN23-pcDNA3.1+是菲利普·伍德曼教授（英国曼彻斯特大学）赠送的一份礼物。