CCL14通过调节细胞周期和促进细胞凋亡，成为HCC的一种新的预后因子和肿瘤抑制因子

免疫组织化学（IHC）

如前所述，在TMA进行IHC^13,14免疫染色强度半定量评分为：0表示阴性；1表示较弱；2为中度；由两名观察员独立进行3次评估。组0和1被归类为低表达，而组2和3被归类为高表达。

细胞培养

肝癌细胞株Huh7、SMMC-7721和HepG2购自中国科学院（上海生物科学研究院细胞库）。逐步转移的HCC细胞系包括MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3，由中山医院肝癌研究所建立。所有细胞系均常规培养。

蛋白质印迹分析

如前所述进行Western blot¹⁵ECL系统（NCM Biotech）用于可视化信号。GAPDH被用作负荷控制。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

为了检测分泌的CCL14水平，在48小时后收集细胞培养上清液，并根据制造商的协议使用HCC-1/CCL14人类ELISA试剂盒（Raybiotech）进行分析。

CCL14过度表达和下调

通过编码CCL14的重组慢病毒构建了CCL14在LM3中的稳定过表达。空白慢病毒作为载体控制。根据制造商的说明，通过用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染特定siRNA，构建了Huh7细胞中CCL14的敲除。siRNA靶序列如下：siRNA-1：CCAUCGCCUAGGGACCAATT；siRNA-2：CCAACAGCC AGUGCUCAATT。

CCK-8集落形成试验和BrdU试验

如前所述进行CCK8分析¹⁶.BrdU分析是根据制造商的说明进行的。

流式细胞术分析

如前所述，流式细胞仪分析用于检测细胞周期和凋亡¹⁷。根据制造商的说明，使用FITC-AnnexinV凋亡检测系统（BD Bioscience）测量细胞凋亡。

裸鼠荷瘤动物模型

采集具有不同CCL14表达水平的LM3或Huh7细胞，并将其悬浮在无血清DMEM中。裸鼠（4-6周龄）缺氧分为四组：（1）CCL14组(n个 = 5） ，每只小鼠下背部注射2×10⁶CCL14过表达LM3细胞；（2） 矢量组(n个 = 5） ，每只小鼠注射2×10⁶空白载体感染LM3细胞；（3） si-NC基团(n个 = 5） ，每只小鼠用3×10注射到下背部⁶用siRNA控制处理Huh7细胞；（3） siRNA2组(n个 = 5） ，每只小鼠用3×10注射到下背部⁶用CCL14 siRNA对Huh7细胞进行处理。每6天对肿瘤进行监测和测量。42岁^第第天，处死小鼠并检测肿瘤重量。

CCL14过表达抑制肝癌细胞体外增殖

通过western blot检测CCL14在不同人类肝癌细胞系中的表达，包括SMMC-7721、Huh-7、HepG2、Hep3B、MHCC-97L、MHCC-77H和HCCLM3。这表明CCL14在Huh-7细胞中高表达，而在LM3细胞中低表达（图。​（图2a）。2a个). 重组慢病毒在LM3细胞中成功地增强了CCL14的表达和分泌，而在Huh7细胞中通过siRNA敲除CCL14（图。​（图2b，2亿，补充图。1). 由于siRNA2序列发挥了更具体的功能，我们选择siRNA2进行以下测试。CCL14的过度表达显著降低了LM3细胞的生长速度，CCK8分析显示了这一点（图。​（图2c）。2厘米). 相反，siRNA2下调CCL14可显著提高Huh7细胞的生长速度（图。​（图2d）。第2天). 同时，LM3细胞中CCL14的过度表达减少了菌落，而Huh7细胞中CCL14的下调增加了菌落（图。​（图2e）。第二版). 此外，LM3中CCL14的过度表达降低了BrdU掺入细胞的比例，而Huh7中CCL15的敲除增加了BrdU-掺入细胞比例（图。​（图2f第2页).

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图2

CCL14在体外抑制肝癌细胞的增殖。

一采用Western blot方法检测6种肝癌细胞系（包括SMMC-7721、Huh-7、HepG2、Hep3B、MHCC-97L、MHCC-77H和HCCLM3）的CCL14。b条CCL14通过编码CCL14的重组慢病毒在LM3细胞中过度表达（CCL14组），并被Huh7细胞（siRNA1，siRNA2组）中针对CCL14靶向的两个siRNA-特异性序列敲除，这已被Western blot证实。siRNA2序列发挥了更特殊的功能。载体组是指LM3细胞感染空白慢病毒作为对照组。si-NC组是指Huh7细胞感染CCL14非特异性siRNA作为正常对照组。c（c）通过CCK8分析，CCL14的过度表达显著降低了LM3细胞的生长速度。d日通过CCK8分析，siRNA下调CCL14可显著提高Huh7细胞的生长速度。e（电子）LM3细胞中CCL14的过度表达增加了菌落数，而Huh7细胞中CCL14的下调减少了菌落。（f）指示细胞中BrdU掺入的代表性显微照片和量化*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001, ****P（P） < 0.0001

CCL14在体外调节细胞周期并促进凋亡

通过流式细胞术分析，观察CCL14介导的细胞周期进展和凋亡变化。LM3中CCL14的过度表达增加了G0/G1期细胞的百分比和细胞凋亡率（图。​（图3a，3a年, *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01). Huh7中CCL14的敲除降低了G0/G1期细胞的百分比和凋亡细胞的比率（图。​（图3b，3亿, *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01). 这些数据表明，CCL14通过抑制HCC细胞的细胞周期进程和促进细胞凋亡来抑制HCC的增殖。

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图3

CCL14调节细胞周期并促进凋亡。

一通过流式细胞术分析，LM3中CCL14的过度表达增加了G0/G1期细胞的百分比和凋亡细胞的比率。b条流式细胞术分析显示，敲除Huh7中CCL14可降低G0/G1期细胞百分比和凋亡细胞率*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01

CCL14过表达抑制裸鼠体内肿瘤生长

在荷瘤动物模型中，我们发现CCL14过度表达组的肿瘤生长速度慢于对照组（图。​（图4a）。4a类). 肿瘤体积和重量同时减少（图。4b、c). 与si-NC组相比，siRNA2组的肿瘤生长更快、更大（图。第4天–第5天). 此外，IHC分析证实CCL14过表达的肿瘤PCNA和BCL2染色较低（图。​（图4g）。4克). 我们的结果表明CCL14抑制体内肝癌的生长。

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图4

CCL14在裸鼠体内抑制肝癌的肿瘤生长。

一42天时五只裸鼠切除肿瘤的图像。与对照载体组相比，CCL14组肿瘤较小。b条荷瘤动物模型(n个 = 5） 建造完成。每6天测量肿瘤体积。CCL14组肿瘤生长速度慢于对照载体组。c（c）CCL14组肿瘤重量减轻。d日42天时si-NC组和siRNA2组肿瘤的图像。与si-NC组相比，siRNA2组的肿瘤更大。e（电子）siRNA2组肿瘤生长速度快于si-NC组。（f）siRNA2组肿瘤重量增加。克切片中PCNA和BCL2的H&E染色和免疫组织化学染色的代表图。CCL14组肿瘤切片PCNA和BCL2染色较低**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001, ****P（P） < 0.0001

本研究得到了国家自然科学基金（3147114731971111）的资助。