结果
生理盐中染色质的液液相分离
我们首先重建由重组纯化的荧光标记组蛋白八聚体和一个定义的DNA模板组成的染色质，该模板包含Widom 601核小体定位序列的12个重复序列(,第1部分、和S1B级). 使用共焦荧光显微镜，我们发现将生理相关浓度的单价或二价阳离子添加到染色质的其他均匀溶液中，会导致形成相分离染色质的圆形液滴(,). 这些液滴依赖于DNA和组蛋白八聚体组装成染色质，形成时没有拥挤剂，与荧光标记的存在或类型、来源的组蛋白八聚体种类以及显微镜玻璃的处理无关(图S1C——E类). 经历相分离的分子的一个特征是它们在定义的阈值浓度下从均匀溶液到不混溶相的急剧可逆转变，这取决于缓冲条件，并受到更高分子价的青睐(Banani等人，2017). 在这方面，我们滴定了单价（KOAc）和二价（Mg[OAc]2)盐，并改变每个阵列中核小体的数量以及阵列浓度。这揭示了与相分离相一致的行为：随着盐或染色质浓度的增加，液滴急剧出现，并且由于阵列中核小体数量的增加而受到青睐(,、和S2AF公司). 为了确保染色质的相分离不是组装过程的特点，我们设计了一种替代方法，其中通过连接预先组装的单核小体来产生核小体阵列(图S2D和S2E公司). T4 DNA连接酶对单核小体的连接酶产生的阳离子依赖性相分离液滴与十二烷基核小体阵列类似(图S2F)。
生理盐中重组染色质的相分离。（A） 用荧光团（品红色）标记的十二聚核糖体阵列（染色质，除非另有说明）的组装。（B） 添加阳离子盐后，组蛋白H2A上用Atto565（品红色）标记的染色质和用YOYO-1（绿色）染色的dsDNA的荧光显微镜图像。（C） 不同条件下染色质相图（46碱基对核小体间连接体长度）。洋红色圆圈表示LLPS。每个圆圈中的灰度表示在滴定醋酸钾（KOAc）和镁（OAc）后根据代表性图像计算的变异系数（CV）值2（顶部）或染色质（底部）。（D） Alexa Fluor 594（AF594）标记的染色质的荧光显微镜图像，具有相同核小体总浓度（100 nM）下不同数量的核小体。（E）(左边)分别具有和不具有N末端组蛋白尾部的“完整”和“无尾”核小体核心颗粒（PDBID:1AOI）的结构。(正确的)胰蛋白酶消化30分钟后AF594标记染色质的荧光显微镜图像。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
核小体通过多种机制相互联系，包括组蛋白尾-DNA相互作用和核小体“酸性”和“碱性”斑块之间的接触(Davey等人，2002年;Kan等人，2009年). 我们询问这些机制是否也有助于LLPS。与之前的染色质沉淀观察结果类似(弗莱彻和汉森，1995年)，我们发现无组蛋白尾的染色质是由胰蛋白酶的部分蛋白水解产生的(图S2G)，不要在有生理盐的情况下进行LLPS(). 此外，组蛋白H4碱性补丁（H4K16、R17、R19和K20）的中和突变，而H2A/H2B酸性补丁（H2A E61、E64、D90和E92）的中和变异，导致染色质在液滴形成中缺陷(图S3A)表明组蛋白H4碱性补丁与DNA之间的相互作用是染色质LLPS的重要决定因素。
相分离聚合物可以表现出多种材料特性，从刚性固体到动态液相结构(Shin和Brangwyne，2017年). EDTA超静态添加法对游离镁的螯合作用导致镁相关染色质液滴的快速分散(图S3B)表明液滴是动态的，与溶液快速交换阳离子。然而，相比之下，整个染色质液滴中标记组蛋白的光漂白导致荧光恢复非常缓慢(图S3C,D类)这是一种常见于产生类固相的生物分子中的观察结果。我们想知道，荧光恢复缓慢是否不是由于固体性质，而是由于散装溶液中缺少可用于恢复的物质。对染色质液滴（~340μM）和整体溶液（~30 nM）中核小体浓度的定量显示，LLPS后浓度增加了10000倍以上，表明光漂白后无法恢复整个液滴的荧光可能是由于溶液中缺乏游离物质所致(和S3E系列——G公司). 部分染色质液滴光漂白后荧光的短时间恢复证实了相分离染色质的动力学和类液体性质(,). 内部液滴动力学驱动这种荧光恢复，因为在以相同和相反的初始速率对液滴荧光进行部分光漂白后，荧光在照射体积外消失，在照射体积内获得(). 由于荧光与体溶液的交换速度很慢，我们可以通过共同孵育差异标记的染色质液滴直接成像液滴融合和随后的材料内部混合(,、和电影S1). 这表明融合发生得很快，液滴在约30秒内从最初的沙漏形状变为球形。然而，内部混合要慢得多，时间尺度为10-20分钟。总之，这些行为表明染色质液滴具有高表面张力和高粘度。
染色质液滴高度浓缩，呈液体状。（A） 核小体浓度在染色质滴内的图示，染色质滴由46个碱基对的核小体间连接物长度形成。请参见图S3E——G公司了解详细信息。（B） AF594标记染色质液滴部分光漂白后荧光恢复的显微图像。（C） 平均相对荧光强度及其内部初始变化率的量化（黑色，k个在里面)和外部（灰色，k个外面的)6个染色质液滴的光漂白面积。误差条和±误差是标准偏差。（D） 双色液滴混合分析的实验工作流程。（E） 用Alexa Fluor 488（AF488）或AF594融合标记的染色质滴的荧光显微镜图像。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
Linker组蛋白H1促进相分离，减缓动力学并增加液滴浓度
大多数真核生物中最丰富的染色质结合蛋白是一般结构蛋白连接蛋白组蛋白H1。组蛋白H1在核小体的二元轴上结合，并调节基因组通路、基因调节和细胞中基因组的浓缩(Bednar等人，2017年;Carruthers等人，1998年;Hergeth和Schneider，2015年;Shen等人，1995年). 鉴于最近的报道，组蛋白H1富含赖氨酸的C末端尾部与DNA混合时可以发生相分离(Turner等人，2018年)，我们想知道组蛋白H1如何结合()可能会影响染色质的相分离以及由此产生的液滴的材料特性。在染色质中添加纯化的小牛胸腺组蛋白H1可促进相分离，其浓度为单价盐浓度的一半（与单独染色质相比）(). 组蛋白H1结合染色质滴的成像显示存在未解决的融合中间产物()光漂白没有明显的恢复()表明连接蛋白组蛋白结合导致染色质滴内动力学降低。
组蛋白H1的C末端结构域促进染色质的相分离，并改变材料属性。（A） 考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，在含有牛连接蛋白组蛋白的染色质滴沉淀后，在上清液（sup.）或颗粒中形成蛋白质。（B） AF594标记染色质的荧光显微镜，在用（底部）或不使用（顶部）牛连接蛋白组蛋白的醋酸钾滴定后进行。像素强度的计数显示在每个缓冲条件的下方，橙色箭头表示暂停的熔滴融合中间产物。（C） AF594标记染色质在部分液滴光漂白后在牛连接蛋白组蛋白存在下荧光恢复的显微图像。（D） 描述LANA肽（teal）和组蛋白H1（蓝色）相对于核小体核心颗粒（PDBID:1AOI）的近似核小体结合位点的示意图。（E） 部分液滴光漂白前后人类组蛋白H1.4、LANA肽和H1.4片段与AF594标记的染色质液滴结合的GFP融合蛋白的显微图像。针对每个实验条件分别处理图像。因此，与面板G的数据不同，相对亮度在不同条件下是不可比较的。（F） 部分液滴光漂白后GFP融合蛋白（上图）和AF594标记H2B（下图）的相对荧光恢复定量。（G） 量化染色质液滴的相对荧光强度，单独存在牛连接蛋白组蛋白或未标记的重组人组蛋白H1.4、LANA肽或H1.4碎片。误差条表示标准偏差（每种情况下N=6个液滴）。比例尺为10米。
为了更好地理解这些作用的机制，我们独立检测了组蛋白H1的主要球状N末端区域和无序富含赖氨酸的C末端结构域（CTD）(). 我们纯化了含有或不含单体绿色荧光蛋白（GFP）的重组蛋白，融合到：人类组蛋白H1.4（GFPH1.4），缺乏CTD的H1.4（H1.4ΔCTD），一种来自卡波西肉瘤相关疱疹病毒蛋白LANA（GFP-LANA）N末端的核小体靶向肽，以及LANA肽和H1.4的CTD（GFP-LANA-CTD）之间的融合蛋白(图S3H,我). 组蛋白H1-核小体复合物的结构分析表明，N末端结构域的球状部分在核小体二联轴处排列有序，其中连接体DNA从核小体核心颗粒中发出。组蛋白H1的CTD与连接子DNA结合得更远，但可能不采用离散的结合构象(Bednar等人，2017年)。
小牛胸腺组蛋白H1和未标记的重组人H1.4均导致染色质液滴浓度增加（约1.4倍）和动力学下降，与荧光标记策略无关(,——,S3J系列). H1.4ΔCTD导致染色质液滴浓度适度增加（约1.2倍），但不影响其光漂白回收率。相反，LANA-CTD融合蛋白（而不仅仅是LANA肽）增加了生成液滴的密度，并大大降低了光漂白后液滴的恢复速度(——). 因此，组蛋白H1的作用似乎主要来自无序的CTD，在这种情况下，折叠结构域主要用于将分子中富含赖氨酸的区域补充到核小体表面。请注意，我们还不了解组蛋白H1结合如何诱导单个核小体的结构和动态变化(Bednar等人，2017年)假设它们发生在相分离环境中，则转化为此处观察到的染色质液滴宏观性质的变化。
总之，这些数据表明组蛋白H1促进染色质的相分离，材料浓度增加，液滴中的动力学降低。我们的生化数据与真核细胞组蛋白H1缺失导致染色质内聚力丧失和核体积增加的细胞观察结果类似(Shen等人，1995年)。
核小体间距控制相分离和染色质凝聚
核小体在基因组中的准确位置是序列依赖性沉积、ATP依赖性重塑酶的运动以及相邻DNA结合因子施加的空间限制的综合结果(斯特鲁尔和西格尔，2013年). 虽然还不清楚这些不同的机制是如何起作用的，但40年前的研究表明，在各种真核生物中，核小体间距离偏向于10n+5（例如5、15、25）碱基对间距，并耗尽10n（例如10、20、30）间距(Lohr和Van Holde，1979年)。显示酵母和小鼠中核小体间连接子长度的频率(Brogaard等人，2012年;Voong等人，2016年)。显示了LOALY Estimated Scatterplot Smoothing（LOESS）归一化后的相同数据(图S4A)，强调了10n+5偏差的程度，而不考虑这些生物体之间平均连接子长度的差异。结构分析表明，10n连接子长度使阵列中的其他核小体相互定向，从而参与面对面的核小体“堆叠”相互作用(Schalch等人，2005年;Song等人，2014年). 这种取向导致形成一个两段螺旋线，该螺旋线与提出的标准30nm光纤一致(汉森，2002). 由于双链DNA每约10.4个碱基对旋转360°，10n+5间距导致DNA末端的取向相差约180°，从而导致核小体的取向(). 因此，10n+5连接器长度间距不利于在30 nm类结构中发现的两段螺旋排列(Bass等人，2019年;Nikitina等人，2017年;Schalch等人，2005年;Song等人，2014年)这表明，细胞中首选的连接子长度可能会产生不同的分子关联。
核小体的生理间距驱动染色质的LLPS并调节染色质液滴密度。（A） 以碱基对分辨率对酵母（黑色）和小鼠ES细胞（灰色）中的核小体间连接子长度进行全基因组分析。（B） LOESS归一化后（A）中的数据，以量化链接器长度偏差的程度。（C） 具有10n+5或10n碱基对距离的理想化B型DNA的末端取向轨迹（末端磷酸盐的5'至3'）。（D） 添加150 mM KOAc后，AF594标记的染色质（0.5μM核小体）的荧光显微镜图像，具有指示的核小体间连接长度（10n+5系列以上，10n系列以下）。（E） 小鼠和酵母之间核小体间连接蛋白长度和连接蛋白组蛋白表达差异的图示。（F） 由10n+5间隔的染色质组成的液滴（n=6）内的荧光强度，该染色质具有不同的核小体间连接体长度，无论是否与牛连接体组蛋白H1结合。用于分析的核小体长度假定为147 bp，标尺为10μm。
为了了解染色体间连接体长度如何影响染色质的LLPS，我们比较了具有10n+5或10n核小体间距的染色质的相分离倾向。我们发现10n+5染色质在比10n染色质低得多的盐度下形成液滴(和S4B系列). 因此，10n+5间距有利于相分离，而10n间距则不利于相分离。10n+5-间距染色质形成的液滴的荧光强度也比10n染色质高约1.8倍（15对20 bp连接子长度；,S4B系列,C类)表明10n+5核小体间距导致不同的分子间排列和明显较高的固有缩合活性。这些观察结果表明，核小体的10n和10n+5间距（后者在细胞中更受青睐）编码染色质聚合物固有的高阶核小体组织的不同原型。
在许多生物体、细胞类型和生化重建中，连接体组蛋白的表达水平和核小体间连接体长度呈线性相关(Woodcock等人，2006年). 例如，酵母表达的连接蛋白组蛋白很少，核小体间距较短，而哺乳动物如小鼠表达的连接基因组蛋白与核小体的化学计量水平接近，并且具有较长的核小体间连接蛋白(,), (Hergeth和Schneider，2015年). 我们询问在相分离的背景下，连接子长度和组蛋白H1之间是否存在生化关系，这可能与这些生物学关系有关。在10n+5连接体系列中，我们发现较短的连接体在相分离液滴中产生较高浓度的染色质(). 以上，我们发现连接蛋白组蛋白H1也增加了46个碱基对连接蛋白长度形成的染色质液滴浓度(). 我们检测了连接蛋白组蛋白H1对连接蛋白长度较短的染色质是否具有相同的作用。我们发现，将组蛋白H1添加到具有不同核小体间连接子长度的染色质中，会导致所有液滴的密度增加到一个共同的值(和S4D系列)15个碱基对连接体的染色质凝集度没有显著增加，45个碱基配对连接体的凝集度增加了约1.5倍。这些结果表明，具有短连接体的细胞类型或生物体可能需要较少的连接体组蛋白，因为通过核小体间距以内在方式实现高水平的浓缩。然而，具有较长连接子的高等真核生物可能更多地依赖组蛋白H1来实现高染色质浓缩并适当调节致密。这种模型也可以解释组蛋白H1缺失导致连接体长度全球缩短和核体积扩大的观察结果(Fan等人，2005年;Shen等人，1995年)。
组蛋白乙酰化对染色质滴的破坏
核小体组蛋白尾部乙酰化体内，通常由组蛋白乙酰转移酶被转录因子招募到特定位点，以调节基因表达(Brownell等人，1996年;格伦斯坦，1997年). 这些修饰损害了染色质在体外的自相互作用和沉淀(Allahverdi等人，2011年;Shogren-Knaak等人，2006年)类似于基本的补丁突变。为了研究乙酰化如何改变染色质滴的形成和材料特性，我们设计了一个模型系统来模拟转录因子驱动的组蛋白乙酰化。我们从基因上将模型联系在一起大肠杆菌转录因子，Tet抑制因子（TetR），到相对杂乱的组蛋白乙酰转移酶p300（p300）的催化域帽子)和GFP，并结合该融合蛋白（GFP-TetR-p300帽子)染色质含有一个中心Tet算子(子序列)(). 在这个系统中，四环素类似物多西环素（Dox）抑制与染色质结合的转录因子，乙酰辅酶A是p300组蛋白乙酰化所必需的帽子.GFP-TetR和GFP-Tet R-p300帽子都被强烈招募到含有TetO的染色质液滴中，这种效应被Dox阻断(). 添加乙酰-CoA导致含有GFP-TetR-p300的染色质液滴溶解帽子，伴随着H3K27乙酰化以及可能的其他位点(). 这种作用需要募集GFP-TrR-p300帽子乙酰化和液滴溶解都被Dox阻止(,). 通过比较GFPTetR-p300帽子-介导的相分离野生型染色质和非相分离碱性斑块突变染色质的组蛋白乙酰化我们发现野生型既增加了转录因子依赖性乙酰化（-Dox），又减少了转录因子非依赖性乙酰化（+Dox）。虽然我们不能排除基本斑块突变导致组蛋白乙酰化过程中相分离诱导的依赖性改变，或者其他组蛋白赖氨酸可能表现出不同的乙酰化模式，但这些结果表明LLPS的缩合增强了该信号通路的保真度(). 乙酰化介导染色质液滴溶解的时间分辨成像(和电影S2)结果表明，在反应开始后的短暂延迟后，液滴密度（通过荧光强度评估）逐渐降低，直到结构消失。在该过程的早期阶段，液滴保持其大小和近似形状，直到密度（即荧光强度）降低到其初始值的大约一半，此时液滴开始起皱并失去圆度(). 这些行为表明，组蛋白尾部的乙酰化可以在体外调节染色质滴的密度和材料特性，说明了细胞中可能形成“开放”染色质的潜在物理机制（有关溴化酶蛋白的作用，另见下文）。目前尚不清楚哪些尾部位点对这些效应最重要，以及更特异的组蛋白乙酰转移酶对染色质LLPS的影响是否更大或更小。
组蛋白乙酰化溶解染色质滴。（A） A类子序列-含有染色质和小分子调制模型反式激活蛋白GFP-TetR-p300帽子（B）AF594标记的染色质（洋红）和GFP融合到模型转录因子TetR（GFP-TetR）或融合到p300催化域的TetR的荧光显微镜图像帽子)（均为绿色）包括强力霉素（Dox）和/或乙酰辅酶A。（C）(顶部）添加强力霉素和/或乙酰辅酶A后组蛋白H3K27乙酰化的Western blot子序列-在GFP-TetR-p300存在下，含有由野生型或碱性斑突变体组蛋白组成的染色质帽子和150 mM KOAC。(底部)考马斯亮蓝染色的核心组蛋白SDS-PAGE凝胶。（D） AF594标记染色质（洋红）和GFPTetR-p300的荧光显微镜帽子（绿色）添加乙酰辅酶A后。（E） GFP-TetR-p300存在下AF594标记染色质液滴的平均液滴圆度和像素强度帽子添加乙酰辅酶A后。误差条表示标准误差。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
接下来我们研究了核小体阵列的液相分离如何与细胞中的染色质组织相关。将分别携带不同荧光标记的未修饰和预乙酰化核小体阵列共注入活HeLa细胞的细胞核()导致未经修饰的核小体阵列在核仁和核膜附近的DNA密集区积聚(,,5安,B类). 乙酰化核小体阵列在整个细胞核中分布得更加均匀，仅在DNA密集区略有富集(,). 因此，非乙酰化核小体阵列比乙酰化阵列更能粘附细胞内的染色质，这与它们在体外更容易自我结合和相分离相一致。
核小体阵列在细胞核中形成凝聚物。（A） 将荧光标记的核糖体阵列核微注射到培养细胞中。（B）(左边)Hoechst 33342 DNA染色HeLa细胞核共聚焦活细胞荧光显微镜(中间的)未修饰核糖体阵列（绿色）和乙酰化核糖体数组（品红色）。(正确的)共焦荧光显微镜图像橙色虚线框中DNA、未修饰阵列和乙酰化核小体阵列的特写视图。（C） Hoechst 33342 DNA染色和未修饰AF488标记阵列或乙酰化AF594标记阵列之间两个生物复制品中31个细胞的平均荧光强度的空间相关性。（D） 用曲古菌素A治疗3小时后，将未修饰的核小体阵列和乙酰化的核小体阵列注射到Hoechst 33342染色的HeLa细胞核中的共焦活细胞荧光显微镜。两个生物复制品中42个细胞的定量（平均荧光>0.5 AU）（E）核内注射未修饰和乙酰化核小体阵列的平均核荧光和变异系数（CV）（F）。
将核小体阵列注射到未经处理的细胞的细胞核中，不会自动结合成可检测的液滴。我们怀疑这可能是由于它们快速吸附到现有的染色质结构中。如果是这样，那么抑制内源性染色质致密化的相互作用和结构可能会使注入的核小体阵列自结合成单独的液滴。为了验证这一点，我们在曲古抑菌素A中培养细胞，以诱导组蛋白超乙酰化和染色质去凝聚(Toth等人，2004年)注射核小体阵列之前(图S5C,D类). 在这些条件下，未经修饰的核小体阵列形成具有低水平可溶性背景的浓缩焦点(——). 注射前乙酰化的核小体阵列更均匀地分布在细胞核内，形成少量暗淡的浓缩物。曲古菌素A治疗后，微注射未修饰核小体阵列与核DNA的相关性比乙酰化阵列更显著，尽管程度低于未处理细胞(图S5E,F类). 这与我们的解释一致，即组蛋白尾部赖氨酸的乙酰化修饰了染色质在体外和细胞中的粘附特性。因此，核小体阵列在核的复杂环境中以乙酰化依赖的方式保持其固有的相分离能力。
多溴主蛋白可诱导乙酰化染色质的新液相
乙酰赖氨酸修饰的组蛋白尾部可被溴代多巴胺特异性识别，溴代多巴是一种由四个α螺旋组成的模块化~12kDa束，存在于许多具有不同功能的染色质相关蛋白中(Fujisawa和Filippakopoulos，2017年). 许多这样的蛋白质含有多个溴结构域和/或低聚物，表明它们可以以多价形式与乙酰化染色质相互作用。由于多价大分子之间的相互作用通常驱动LLPS，我们询问多溴结构域蛋白是否可以诱导乙酰化染色质的LLPS。我们检测了一种由五个BRD4第一个溴代腺苷拷贝组成的工程蛋白，这些溴代腺苷酶是由柔性连接物bromo5和BRD4，一种含有两个溴代腺体的蛋白质，在组织染色质和调节转录中起重要作用(,S6A系列,B类)(Fujisawa和Filippakopoulos，2017年). 添加溴5或BRD4到生理缓冲液中的乙酰化染色质（不能自行分离相位）确实诱导LLPS(,). 这种效应取决于溴代腺苷与乙酰赖氨酸的结合，因为溴代腺苷酸突变5不能结合这一部分不会导致相分离()BRD4诱导的相分离被溴代多巴胺抑制剂JQ1阻断(Filippakopoulos等人，2010年)(). LLPS也依赖于多价性，因为单溴蛋白不会诱导LLPS(). 由此产生的液滴呈液态，显示融合(图S6C,D类)和FRAP回收(图S6E,F类)，但与未乙酰化染色质液滴相比，染色质密度更低，FRAP回收率发生改变(,第6页). 因此，多价溴代主要蛋白可以诱导乙酰化染色质的LLPS，产生不同组成和动力学的液相，从而实现不同的功能。
BRD4促进乙酰化染色质的新液相。（A） BRD4和bromo的域组织示意图5以及它们与乙酰赖氨酸的JQ-1敏感性相互作用。（B） 和（C）AF594标记的染色质（品红色）在p300催化域未乙酰化和乙酰化的荧光显微镜图像帽子和（B）含有合成GFP标记的溴代多巴胺蛋白，（C）含有BRD4，无JQ-1和JQ-1。（D） BRD4对非乙酰化和乙酰化染色质的影响示意图。（E） 单独由染色质和BRD4或溴组成的染色质液滴的相对H2B荧光强度5和乙酰化染色质。（F） 荧光显微镜观察未经修饰的AF594标记染色质与化学计量数量的未经修饰或乙酰化的AF488标记染色质混合后的荧光显微镜5。比例尺为10μm。（G） 基于相分离的细胞核染色质组织模型。
接下来，我们问这些溴代多巴胺诱导的乙酰化染色质液滴与未修饰染色质产生的液滴之间的关系。当bromo5将其添加到乙酰化和非乙酰化染色质的溶液中，用不同的荧光团标记，形成两个不同的相(). 一个阶段在乙酰化染色质中富集，另一个阶段则在非乙酰化染色素中富集。这些不同的液滴相互粘附，但不结合。用BRD4进行的类似实验仅产生含有乙酰化和非乙酰化染色质的单个液滴相(图S6G). 这种差异可能是由于BRD4能够溶解非乙酰化染色质的液滴(). 虽然我们还没有完全理解这些差异的分子基础，但是关于溴的数据5根据染色质的固有特性、组蛋白尾部的共价修饰和组蛋白尾部读取器蛋白的作用，演示LLPS如何在体内创建空间和功能不同的染色质区域。
讨论
我们已经证明，在生理盐存在下，重组染色质具有形成高度致密但动态液相的内在能力。染色质滴的密度（46个碱基对连接体的核小体浓度约340μM）与细胞中核小体密度的估计值（约80-520μM）相似(Hihara等人，2012年)，表明LLPS足以产生组织细胞核中基因组所需的紧密程度。已知影响细胞染色质特性的因素对液滴的特性也有类似的影响。组蛋白H1增加液滴的密度并降低其动力学，反映了其在细胞中的染色质致密活性(Hergeth和Schneider，2015年). 10n+5碱基对的核小体间距，在细胞中占主导地位(Brogaard等人，2012年;洛尔和范霍尔德，1979年;Voong等人，2016年)，有利于染色质LLPS，并产生密度随连接体长度减少的液滴。组蛋白H1的添加将所有液滴增加到一个共同的密度，对具有较长连接物的液滴的影响更大。这些数据表明，在许多真核生物中，核小体连接子长度和组蛋白H1表达水平之间的相关性(Fan等人，2005年;Woodcock等人，2006年)，可能反映了细胞努力维持基因组致密化的内稳态。最后，组蛋白尾部的乙酰化会导致细胞内染色质的失活，并与“开放”染色质相关，从而降低液滴密度并在较高水平上消除LLPS。多溴主要蛋白可以诱导乙酰化染色质形成一个独特的液滴相，这与乙酰化增强子的转录调控因子形成一个对基因表达很重要的相分离结构的报道一致(Boija等人，2018年;Cho等人，2018年;Sabari等人，2018年). 总之，这些观察结果表明真核细胞可能利用LLPS来动态控制基因组的压缩、空间组织和功能。这个想法与基因组的液相组织的各种模型是一致的(Dubochet等人，1986年;Maeshima等人，2016a;Mirny等人，2019;Nozaki等人，2017年)，并建议之前关于体外染色质聚集的报道(Maeshima等人，2016年b;Shogren-Knaak等人，2006年)现在可以描述为动态液-液相分离液滴。
在不同长度尺度上的划分是真核生物基因组的一个特征。而染色质纤维内的长程相互作用和ATP依赖性环挤压的短程相互作用已成为基因组的关键组织原则(Di Pierro等人，2016;Mirny等人，2019年)染色质的固有物理性质是如何控制细胞分区的，目前尚不清楚。我们已经证明，液态染色质液滴融合迅速，但内容混合速度非常慢。随着相分离聚合物长度的增加，其溶液的特性粘度也增加(鲁宾斯坦和科尔比，2003年). 这表明，长度尺度长于此处使用的12核小体阵列的染色质在融合后会在较长时间内占据彼此不同的区域。染色质相的缓慢融合可以使表观遗传学过程（如共价修饰和染色质结合蛋白）加强它们之间的组织/动力学等差异，从而建立和维持染色质状态。在较短的长度尺度上，液态染色质状态可能有助于染色质纤维在内聚素介导的环形成过程中的横向迁移，从而有助于形成拓扑相关的染色质亚结构域(Bintu等人，2018年;Mirny等人，2019年;施瓦泽等人，2017年;乌尔曼，2016). 在染色体的长度范围内，一个高度粘稠的液相组织可能有助于维持细胞核内单个染色体的区域(Meaburn和Misteli，2007年). 这样，基因组的区域在较短的长度尺度上保持动态，而在细胞核内较长的长度尺度下保持空间完整性。
核小体间距和染色质滴密度之间的关系，以及核小体间隔调节染色质凝聚的模型，对真核生物的基因组组织和序列含量具有意义。TA:AT:TT:AA二核苷酸碱基对中的DNA序列在体内外定位核小体(卡普兰等人，2009年;Lowary和Widom，1998年;斯特鲁尔和西格尔，2013年). 在较简单的真核生物如酵母中，在较高等的真核细胞中，这种模式是核小体在细胞中位置的基础(Brogaard等人，2012年;卡普兰等人，2009年;Voong等人，2016年). 我们关于10n+5与10n间距所提供的生化行为的数据，加上全基因组对10n+5间距的偏好，表明染色质凝聚也可能编码到基因组序列中，特别是在较简单的生物体中。因此，基因组中的核小体定位序列很可能处于进化选择和限制基因组序列的状态，这些序列产生和调节长度相关的缩合。此外，我们的数据强调需要了解基因组序列和ATP依赖过程如何协调以产生10n+5间隔的核小体间距，以及这种组织的破坏如何影响细胞中的染色质调节和结构。
在存在多价溴多巴胺读取器蛋白BRD4或工程蛋白溴多巴胺的情况下5组蛋白乙酰化可产生不同于未修饰染色质的分相液体。这些数据对乙酰化依赖过程（如转录）具有特定意义，并对基因组的功能组织具有一般意义（见下文）。在前者中，高水平的赖氨酸乙酰化是活性转录基因组位点的标志(Brownell等人，1996年;联合体，2012年;Whyte等人，2013年). 这些位点在细胞核中形成100-500nm的病灶，转录机制集中在这里，包括RNA聚合酶II、介体、转录因子和BRD4。较小的病灶形成并迅速溶解，平均寿命约为10秒。更大的病灶寿命延长10倍以上，似乎是超级增强剂。尽管解释各不相同(Chong等人，2018年)最近的数据表明，在转录因子和辅激活蛋白之间弱关联网络的驱动下，通过LLPS构建转录焦点组装模型(Cho等人，2016年;Cho等人，2018年;Sabari等人，2018年). 这些模型将染色质本身打造成一个基本上被动的平台，相分离的点在其上组装。我们的研究结果表明，乙酰化染色质也可能通过与BRD4等含溴蛋白相分离，在转录缩合物的急剧形成和溶解中发挥直接作用。目前尚不清楚活性基因座染色质的乙酰化和脱乙酰化是否与转录灶的形成和溶解在同一时间尺度上发生，或者活性基因座是否在转录器组装和溶解时持续乙酰化。在这两种情况下，我们的数据表明，基因组的结构组织可能通过基于染色质的LLPS在转录位点发生动态变化。
基于相位分离的染色质组织和调节细胞控制模型()基因组的紧密性和相分离的驱动力可以通过诸如连接蛋白-组蛋白结合、组蛋白乙酰化、与组蛋白尾部读取器的相互作用以及核小体间距等细胞因子的参与来调节。在细胞中，有明确的功能性染色质亚型（如启动子、增强子、绝缘体、多梳群区等），富含特定的信号分子和染色质结合蛋白(联合体，2012年;Filion等人，2010年). 全基因组数据集的分析揭示了10n+5核小体定位偏差、组蛋白H1结合和组蛋白乙酰化在这些区域的不同程度(图S7). 这表明，这些染色质亚型可能采用不同的相分离状态，其结构和动力学特性对其在细胞中的独特功能至关重要。我们的结果表明，基于不同的尾部修饰和结合伙伴，染色质可以形成粘附但不凝聚的染色质相，并说明了这些不同的相是如何在细胞核中形成的。不同类别的组蛋白修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化等），无论有无同源读取器蛋白，以及众多组蛋白变体，都可能产生具有独特物理性质、组成和后续功能的不同液相。这种染色质相分离可以与最近证明的不同染色质亚型特有的蛋白质相分离一起作用(Larson等人，2017年;Plys等人，2019年;Sabari等人，2018年;Strom等人，2017年)发挥这些地区的全部监管能力和功能。与这一概念框架相一致，最近在硅片中重述全基因组染色质相互作用图的工作调用了相分离，由染色质和相关因子微弱但差异的相互作用驱动，以解释染色质亚结构域的形成和分离(Di Pierro等人，2016年;Falk等人，2019年). 因此，相分离是一种机制，可以产生紧凑但动态的染色质“基态”，并通过共价修饰和调节因子生成大量“激发”结构状态，从而提供基因组的功能多样性。
STAR方法
实验模型和主题细节
细菌菌株
DH5α（Invitrogen）和MACH1（Invit罗gen）大肠杆菌质粒DNA克隆过程中使用菌株传代。用于分离核小体组装序列的大规模质粒DNA制备在ER2925中进行传递和规模化生长(水坝-/分布式控制模块-)大肠杆菌应变（NEB）。
昆虫细胞系
Sf9细胞在SF-900 II无血清培养基（GIBCO）中传代，该培养基在病毒扩增和重组蛋白表达过程中添加10%FBS和青霉素/链霉素。
哺乳动物细胞系
这些实验使用了HeLa-Kyoto细胞系，该细胞系定期进行支原体污染阴性检测。HeLa细胞在Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，由IMP/IMBA媒体厨房内部生产）中培养，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）、1%（v/v）青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich）和1%（v/v）谷氨酸MAX™补充剂（Thermo Fisher Scientific）。对于显微注射，细胞在35 mmμ-培养皿（IBIDI）中培养至80%汇合。在微量注射和成像之前，将细胞转移到成像介质中（Gibco，定制：不含酚红和核黄素的DMEM，补充如上所述）。成像前2小时，用1.6μM Hoechst 33342（Invitrogen）和或不加1μM曲古抑菌素A（Sigma）处理细胞。
方法详细信息
分子生物学与克隆
细菌蛋白表达载体的构建。
智人核心组蛋白：
合成开放阅读帧（ORF）编码智人利用聚合酶链反应（PCR）和添加5’近端NcoI限制性内切酶识别位点和3’近端终止密码子和BamHI限制性内切酶识别位点的引物，从集成DNA技术（IDT）合成的dsDNA中扩增组蛋白H3C111A和H2BT116C。利用新英格兰生物实验室（NEB）的NcoI和BamHI限制性内切酶将H3C111A和H2BT116C ORF定向克隆到pET19b（Novagen）中。通过Sanger测序证实了蛋白表达载体pET19b_H3C111A和pET19b_H2BT116C的序列含量。
X.薰衣草核心组蛋白：
基于pET的蛋白表达构建用于表达野生型、H3T33C和H2AK120C组蛋白X·莱维斯是Geeta Narlikar博士慷慨的礼物。基于pET的酸性斑块突变体蛋白表达载体的构建X·莱维斯组蛋白H2A（H2A E61A、E64A、D90A和E92A）和基本斑片突变体X。金盏花组蛋白H4（H4 K16A、R17A、R19A、K20A）是宋丹博士慷慨赠送的礼物。
ySIR2：
一种合成ORF，编码酿酒酵母用PCR和引物从IDT合成的dsDNA中扩增出SIR2蛋白，引物添加了5’-近端翻译起始密码子和3’-近侧翻译终止密码子以及XhoI限制性内切酶识别位点。使用XhoI和钝化NdeI限制性内切酶消化位点（NEB）将编码野生型SIR2氨基酸87–562的XhoI限制性核酸内切酶酶切PCR产物克隆到pETduet-1表达载体（Novagen）中。通过sanger测序证实了蛋白表达载体pETduet_ySIR2的序列含量。
300页帽子、GFP-TetR和GFP-Tet R-p300帽子以下为：
300页帽子、GFP-TetR和GFP TetR-p300帽子使用一步或两步PCR方法从（1）pEB1-sfGFP（Addgene#103983），（2）合成序列编码大肠杆菌由IDT合成的TetR，以及（3）编码649–1026个氨基酸的自然序列智人第300页（第300页帽子)IDT合成(Balleza等人，2018年). 用于编码GFP-TetR和GFP-Tet R-p300的ORF PCR扩增的引物帽子融合蛋白添加了（1）一个5’-近端BamHI限制性内切酶识别位点，（2）一个3’-近端基翻译终止密码子，其后是一个NotI限制性内切酶识别位点和（3）一个柔性序列编码（GGS）三融合蛋白结构域之间的连接子。使用BamHI-HF和NotI-HF限制性内切酶（NEB）定向克隆限制性内切酶消化的PCR产物到pETduet_ySIR2表达载体（新英格兰生物实验室）中编码p300帽子、GFP-TetR和GFP-TetR-p300帽子带有N端HHHHH HHH ENLYFQGS序列。蛋白表达载体pETduet_p300的序列含量帽子、pETduet_GFPTetR和pETduent_GFP-TetR-p300帽子经Sanger测序证实。
基于mEGFP标记和未标记的组蛋白H1.4的表达构建体：
天然序列编码的dsDNA智人组蛋白H1.4和编码卡波西肉瘤疱疹病毒蛋白LANA的前22个氨基酸的合成序列被作为IDT的基因块排序。采用一步或两步PCR方法扩增编码组蛋白H1.4、不含氨基酸112-219的组蛋白H1.4%（H1Δ4 CTD）、LANA肽（1-22）和LANA H1.4的dsDNACTD公司含有11个氨基酸的甘氨酸和富含丝氨酸连接物的嵌合体。使用PCR将单体eGFP亚克隆到基于pMAL的载体（pMTTH）中，该载体产生重组产物，产生包含N端MBP标记和C端His6标记的重组蛋白，每个重组蛋白由TEV蛋白酶识别序列（ENLYFQG）分离。将H1.4衍生序列（H1.4、H1.4ΔCTD、LANA和LANA-CTD）亚克隆到pMTTH和pMTTH+mEGFP中，并进行sanger测序以确认序列内容正确。
EGFP标记和未标记的合成溴代多巴胺表达结构：
dsDNA的合成序列编码1或5个野生型或乙酰赖氨酸结合缺陷序列（N140A）的拷贝智人BRD4，每个由（集气站）隔开5连接子作为IDT的基因块排序。溴1，溴5和bromo5通过PCR从基因块序列中扩增（N140A）编码序列，并将其克隆到pMTTH载体（如上所述）中，无论是否带有N末端EGFP蛋白标签，并进行sanger测序以确认正确的序列内容。
昆虫细胞蛋白表达载体的构建。
BRD4：
编码“long”自然序列的ORF智人BRD4通过PCR扩增并克隆到pFastbac1-derived vector（pAV5B）中，该载体编码N末端His6标签和TEV蛋白酶识别序列。
12×601 dsDNA阵列产生菌载体的构建。
193bp重复长度TetO，含12×601：
p601质粒(Larson等人，2017年)，包含一个12×601阵列，Tet运算符（TetO）插入pCR-Blunt II-TOPO载体背景中克隆的601序列6和7之间，通过（1）添加一个EcoRV位点3'-靠近12×601-序列和（2）进行修改使用SpeI限制性内切酶识别位点，在12×601序列的近端添加来自pMD2.G5'-的3697 bp SpeI释放片段。该质粒被称为p12×601。
10n和10n+5 NRL 12×601阵列：
Widom的601序列DNA使用中概述的引物进行PCR扩增表S1最初的3×601 DNA阵列被克隆到pUC19的BamHI和HindIII位点，包含601-1至601-2之间的NheI位点和601-2至601-3之间的XbaI位点。使用等裂殖体NheI和XbaI限制位点，通过反复的消化、连接、转化和质粒分离，生成了较大的重复序列阵列（4×601、6×601，10×601和12×601）。然后将12×601阵列的15、20、25、30、35或45 bp连接子DNA长度从pUC19亚克隆到WM530质粒（这是Tom Muir博士的慷慨馈赠）。用于生产12×601 DNA的最终质粒命名为pWM_12×601_15bpLinker、pWM_112×601_20bpLinker，pWM_12x601_25bpLinkerpWM_12-x601_30bpLinkerp、pWM_ 12x601_35bpLinkers和pWM_ 12×601_45bpLinker。
重组蛋白的表达与纯化
纯化在大肠杆菌中表达的X染色体核心组蛋白。
净化：
重组组蛋白十、莱维斯纯化自大肠杆菌如前所述(Luger等人，1999年)，进行了一些修改。简单地说，清洗过的包涵体含有大肠杆菌-表达的组蛋白用XL展开缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 7.5，7 M胍•HCl和5 mM巯基乙醇）溶解，并透析到XL透析缓冲液（20mM Tris·HCl，PH7.5，6 M尿素，5 mM硫醇）中。使用TSKgelSP-5PW（TOROH）柱，通过变性阳离子交换色谱法从XL透析缓冲液中的可溶性透析液中纯化组蛋白，以0-1M NaCl的线性梯度洗脱组蛋白。将含有组蛋白的组分透析至>18 MΩH2O并在组蛋白八聚体重建之前冻干。
在大肠杆菌中表达的H.sapiens组蛋白H3C111A、H4和H2A的纯化。
表达式：
Rosetta 2（pLysS）的过夜培养大肠杆菌用编码野生型的pET19b_H3C111A、pET28a_H4（Addgene#42633）或pET28a_H2A.1（Addgene#42634）质粒转化（Novagen）智人组蛋白H4或H2A或突变智人组蛋白H3C111A在琼脂平板上生长，方法是在添加100 ng/μL氨苄西林（pET19b_H3C111A）或35μg/mL卡那霉素（pET28a基表达）和25 ng/μL氯霉素的LB上重新涂布单个转化子，37℃(Wilson等人，2016年). 细菌草坪悬浮在LB中，补充适当的抗生素，如上所述，并生长到一定密度（OD600纳米），0.4。然后通过在37°C下向1 mM中添加IPTG 3小时来诱导重组蛋白表达。通过离心收集细胞，将其重新悬浮在组蛋白溶解缓冲液中（50 mM Tris•HCl，pH 8，150 mM NaCl，5 mMß-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素），并将细胞悬浮液快速冷冻在液体N中2,并储存在−80°C。
净化：
组蛋白基本上如前所述进行了纯化(Luger等人，1999年)，进行了一些修改。大肠杆菌在组蛋白溶解缓冲液中重新悬浮的表达组蛋白H4、H2A或H3C111A在湿冰上解冻，并在约10000 PSI的条件下通过Avestin乳胶-C5高压均质器进行多次传代溶解。通过Beckman Avanti J-26 XPI离心机在JA25.5转子中以19500 RPM的转速离心，从可溶性细菌裂解物中分离出含组蛋白的包涵体。丢弃可溶性细菌裂解物，通过再悬浮和25 mL包涵体洗涤缓冲液（50 mM Tris•HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，1%Triton X-100，1 mM EDTA，1 mM-苯甲脒，5 mM巯基乙醇）洗涤包涵体每升细菌表达，然后在Beckman Avanti J-26 XPI离心机中以19500 RPM的转速在JA25.5转子中离心造粒。用Inclusion Body Wash Buffer再次清洗包涵体，用Includion Body Wash Buffe器再清洗两次，省略Triton X-100。将包涵体用每升细菌表达167μL二甲基亚砜浸泡30分钟，用抹刀切碎，并通过在每升细菌表达5mL组蛋白展开缓冲液（20mM Tris•HCl，pH 7.5，7M胍鎓HCl，10mM DTT）中搅拌提取蛋白质1小时。提取的未折叠蛋白通过Beckman Avanti 6 XPI离心机在JA25.5转子中以19500 RPM的转速从沉淀物中分离。再次提取包涵体蛋白40分钟，搅拌每升细菌表达1.7 mL组蛋白展开缓冲液。通过Beckman Avanti J-26 XPI离心机在JA25.5转子中以19500 RPM的转速再次从沉淀物中分离提取的未折叠蛋白。
汇集的未折叠可溶性包涵体蛋白通过0.45μm膜（GE Healthcare）过滤，并在HiLoad 26/60 Superdex 200 pg大小的排除柱上的组蛋白展开缓冲液中运行。含有组蛋白的级分在>18MΩH2O中对5mMß-巯基乙醇透析两次，在50%[w/v]甘油中透析一次。沉淀的蛋白质在Beckman Avanti J-26离心机中以19500 RPM的转速在JA25.5转子中离心造粒。组蛋白储存缓冲液中的组蛋白（50%[w/v]甘油，5 mMß-巯基乙醇）在3000道尔顿分子量截止值（MWCO）的离心浓缩器（Amicon）中浓缩，并储存在−20°C下。
通过Amberlite MB-20树脂（SIGMA）对8 M尿素进行3次去离子，并用于制备SAU200（20 mM NaOAc，pH 5.2，7 M尿素，200 mM NaCl，1 mM EDTA，5 mMß-巯基乙醇）和SAU600（20 mM-NaOAc、pH 5.2，7M尿素，600 mM NaC1，1 mM-EDTA，5-巯基酒精）缓冲液。将储存在−20°C下的组蛋白存储缓冲液中的组蛋白稀释到20体积以上的SAU200中，通过0.45μm膜过滤（GE Healthcare），并应用于SAU200平衡的源15S色谱树脂（GE Hearthcare。用SAU200和0–30%SAU600的5柱体积梯度洗涤后，组蛋白在30–100%SAU600 35柱体积梯度上洗脱。将含有组蛋白的组分混合，并在>18 MΩH2O中用5 mMß-巯基乙醇透析三次。组蛋白在离心浓缩器中用3000道尔顿MWCO浓缩至小于500μL/L的细菌表达和浓度，通过测量280nm处组蛋白的吸光度和计算出的摩尔消光系数进行量化(https://web.expasy.org/portparam/)组蛋白H3C111A、H4和H2A分别为4470/M•cm、5960/M•cm和4470/M.cm。纯化的组蛋白以200（组蛋白H3C111A或H4）或240 nmol（组蛋白H2A）的数量进行校准，用液体N快速冷冻2，并在−80°C下储存。
在大肠杆菌中表达的荧光标记的H.sapiens组蛋白H2B的纯化。
表达式：
Rosetta 2（pLysS）的过夜培养大肠杆菌用编码pET19b_H2BT116C质粒转化（Novagen）智人组蛋白H2B带有一个引入苏氨酸116位的非天然半胱氨酸，通过在37°C下添加100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素的LB上重新涂覆单个转化子，在琼脂平板上生长。细菌草坪悬浮在LB补充抗生素中，如上所述，并生长到一定密度（OD600纳米），0.4。然后通过在37°C下向1 mM中添加IPTG 3小时来诱导重组蛋白表达。通过离心收集细胞，将其重新悬浮在组蛋白溶解缓冲液中（50 mM Tris•HCl，pH 8，150 mM NaCl，5 mMß-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素），并将细胞悬液在液态N中快速冷冻2,并储存在−80°C。
净化：
组蛋白H2B的纯化与之前描述的方案类似(Klinker等人，2014年)，有修改。大肠杆菌将重悬于组蛋白裂解缓冲液中的表达组蛋白H2BT116C在湿冰上解冻，并在约10000PSI下通过Avestin Emulsiflex-C5高压匀浆器多次传代裂解。通过Beckman Avanti J-26 XPI离心机中细胞碎片的离心分离，在JA25.5转子中以19500 RPM分离可溶性细菌裂解物。将尿素添加到可溶细菌裂解液中，直到达到7M的浓度，并将pH 5.2的3M NaOAc添加到裂解液中直到将裂解液酸化至pH 5.2。通过通过0.45μm膜（GE Healthcare）过滤裂解液，并将其应用于在SAU200中平衡的源15S色谱树脂（GE Hearthcare。用SAU200和0–30%SAU600的5柱体积梯度洗涤后，组蛋白H2BT116C在30–100%SAU600 35柱体积梯度上洗脱。将含有组蛋白的组分混合，并在>18 MΩH的条件下用5 mMß-巯基乙醇透析两次2O，并针对组蛋白存储缓冲区进行一次。组蛋白H2BT116C在具有3000道尔顿MWCO的离心浓缩器中浓缩，通过测量组蛋白在280nm处的吸光度和计算的摩尔消光系数来定量(https://web.expasy.org/portparam/)组蛋白H2BT116C为7450/M•cm。纯化的组蛋白H2BT116C在标记之前在−20°C的组蛋白存储缓冲液中保存。
标记：
将Tris中和的TCEP（500mM Tris•HCl，pH 8，100mM TCEP）添加到组蛋白存储缓冲液中的组蛋白H2BT116C的1mM终浓度，并在室温下孵育1小时。将含有完全还原半胱氨酸的组蛋白H2BT116C移入磷酸盐缓冲盐（8 mM Na2高性能操作4，2 mM KH2人事军官4，pH 7.4，137 mM NaCl，2.7 mM KCl），使用2×5 mL HiTrap脱盐柱（GE Healthcare），并通过添加1.5摩尔过量Alexa Fluor 488（AF488）-C进行标记5-马来酰亚胺或Alexa Fluor 594（AF594）-C5-马来酰亚胺，然后在室温下黑暗中培养4小时。添加DMSO单独用于生成未标记的H2BT116C蛋白。通过添加10 mM DTT来猝灭共轭反应。通过将未标记、AF488标记或AF594标记的组蛋白H2B通过2×5mL脱盐柱流动，并在组蛋白清理缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）中平衡源15Q树脂（GE Healthcare），可去除游离荧光团和任何游离dsDNA。将含有未标记、AF488标记或AF594标记组蛋白H2B蛋白的组分混合，并在>18 MΩH中用5 mMß-巯基乙醇透析三次2O.不同的荧光标记或未标记蛋白质在离心浓缩器中浓缩，使用3000道尔顿MWCO，每升细菌表达量小于500μL，通过测量280、495、，和590以及摩尔消光系数的吸光度和计算值(https://web.expasy.org/portparam/组蛋白H2BT116C、AF488和AF594分别为4470/M•cm、73000/M•厘米和92000/M·厘米。100%的标记得到确认，纯化和差异标记的组蛋白H2B蛋白以240 nmol的量进行aliquoted，用液态N快速冷冻2，并在−80°C下储存。
非洲爪蟾组蛋白H2A和H3在大肠杆菌中表达的荧光标记。
冻干纯化X·莱维斯组蛋白H2A和H3分别与120和33位的工程半胱氨酸一起被重新悬浮在XL标记缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 7.5，6 M胍•HCl、5 mM EDTA，0.7 mM TCEP）和Atto565-C中5-马来酰亚胺（SIGMA）或Cy5-C5-以组蛋白与马来酰亚胺染料的1:5摩尔比添加马来酰胺（GE）。在室温、黑暗条件下进行12小时的共轭反应。用5mL HiTrap脱盐柱（GE）从标记组蛋白中去除游离的未共轭染料，然后透析到水中。量化透析组蛋白的结合百分比和蛋白浓度后，将组蛋白进行脂化和冻干，以进行组蛋白八聚体的重建。
大肠杆菌中表达的H1.4和H1.4基蛋白质的纯化。
表达式：
Rosetta 2（pLysS）的过夜培养大肠杆菌用编码mEGFP标记或未标记的pMTTH质粒转化（Novagen）智人在37°C下，通过在添加100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素的LB上重新涂覆单个转化子，在琼脂平板上生长H1.4和H1.4基（H1.4ΔCTD和LANA-CTD）重组蛋白。细菌草坪悬浮在LB补充抗生素中，如上所述，并生长到一定密度（OD6000.4 nm），冷却1小时至18°C，并通过在18°C下向0.5 mM添加IPTG 18小时诱导重组蛋白表达。通过离心收集细胞，将其重新悬浮在NiNTA裂解缓冲液中（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，150 mM NaCl，10%[w/v]甘油，5 mM咪唑，5 mM-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素），将细胞悬液快速冷冻在液体N中2,并在−80°C下储存。
净化：
mEGFP标记或未标记智人将NiNTA裂解缓冲液中的H1.4和H1.4基（H1.4ΔCTD和LANA-CTD）重组蛋白在水浴中解冻，并在约10000 PSI的压力下通过Avestin乳化剂-C5高压均质器多次进行裂解。向裂解液中添加等体积的NiNTA稀释缓冲液（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，1.85 M NaCl，10%[w/v]甘油，5 mM咪唑，5 mM-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素），以将NaCl浓度增加至1 M。可溶性细菌裂解物通过在Beckman Avanti J-26 XPI离心机中在JA25.5转子中以19500RPM离心分离细胞碎片而分离。将可溶性裂解物与NiNTA洗涤缓冲液NiNTA稀释缓冲液（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，1 M NaCl，10%[w/v]甘油，10 mM咪唑，5 mM巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗疼痛药，1μM胃蛋白酶抑制剂）中平衡的NiNTA树脂（Qiagen）培养2小时，并进行端到端混合。将NiNTA树脂倒入BioRad Econo柱中，并在NiNTA洗脱缓冲液中洗脱之前用至少20个柱体积的NiNTA洗涤缓冲液对树脂进行洗涤（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，1.85 M NaCl，10%[w/v]甘油，350 mM咪唑，5 mM巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM肽抑制素）。将含有感兴趣重组蛋白的组分应用于在NiNTA洗脱缓冲液中平衡1小时的直链淀粉树脂中，分批进行端到端混合。将淀粉树脂倒入BioRad Econo柱中，用至少20个柱体积的淀粉洗涤缓冲液（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，150 mM NaCl，10%[w/v]甘油，1 mM二硫苏糖醇，1 mM-苯甲脒，100μM亮肽，100μM-抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素）洗涤树脂，然后在含有1%麦芽糖的淀粉洗涤缓冲器中洗脱。在4°C下用TEV蛋白酶隔夜裂解含有感兴趣重组蛋白的组分。
用9体积的缓冲液SA（20 mM HEPES•NaOH，pH 7，10%[w/v]甘油，1 mM DTT）稀释TEV-裂解的重组H1.4基蛋白，并将其应用于在98.5%缓冲液SA和1.5%缓冲液SB（20 mM HEPES·NaOH、pH 7，1 M NaCl，10%[w/v]丙三醇，1 mM DTT）中平衡的Source15S树脂（GE Healthcare）中并以线性梯度洗脱至100%缓冲液SB。含有TEV-裂解的重组H1.4基蛋白的组分在带有3000道尔顿MWCO的离心浓缩器中浓缩，并使用Superdex 75 10/300 GL凝胶过滤柱通过尺寸排除色谱进一步纯化，该凝胶过滤柱与凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 8，150 mM NaCl，10%[w/v]平衡甘油，1 mM DTT）。通过测量280 nm处的蛋白质吸光度及其计算出的摩尔消光系数，浓缩并量化感兴趣蛋白质的峰分数(https://web.expasy.org/portparam/). 纯化的蛋白质在液态N中快速冷冻2并在−80°C下储存在一次性等分样品中。
大肠杆菌中表达的bromo5、eGFP-bromo1、eGFP-bromo6和mEGFP标记的LANA肽融合蛋白的纯化。
表达式：
Rosetta 2（pLysS）的过夜培养大肠杆菌用基于pMTTH的编码溴的质粒转化（Novagen）5，EGFP标记溴1，溴5，溴5（N140A）或mEGFP标记的LANA肽重组蛋白通过在37°C下添加100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素的LB上重新涂覆单个转化子在琼脂平板上生长。细菌草坪悬浮在LB补充抗生素中，如上所述，并生长到一定密度（OD6000.4 nm），冷却1小时至18°C，并通过在18°C下向0.5 mM添加IPTG 18小时诱导重组蛋白表达。通过离心收集细胞，将其重新悬浮在NiNTA裂解缓冲液中（50 mM HEPES•NaOH，pH 7，150 mM NaCl，10%[w/v]甘油，5 mM咪唑，5 mM-巯基乙醇，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素），细胞悬浮液快速冷冻在液体N中2,并储存在−80°C。
净化：
NiNTA裂解缓冲液中的重组蛋白在水浴中解冻、裂解，并使用NiNTA和直链淀粉树脂进行亲和纯化，与上述H1.4基重组蛋白完全相同。在4°C下用TEV蛋白酶隔夜裂解含有重组蛋白的直链淀粉洗脱组分。用9体积的缓冲液QA（20 mM Tris•HCl，pH 8，10%[w/v]甘油，1 mM DTT）稀释TEV-裂解重组蛋白，并将其应用于Source15Q树脂（GE Healthcare），该树脂在98.5%缓冲液QA和1.5%缓冲液QB（20 mM-Tris•HCl，pH值8，1 M NaCl，10%[w/v]丙三醇，1 mM-DTT）中平衡，并以线性梯度洗脱至100%缓冲液SB。含有TEV裂解蛋白的组分在离心浓缩器中浓缩，并使用Superdex 75 10/300 GL（EGFP-bromo1）、Superdex-200 10/300 GL（EGFP-bromo5和EGFP-bromo）通过尺寸排除色谱进一步纯化5[N140A]）或HiLoad 26/60 superdex 75 pg（mEGFP-LANA）凝胶过滤柱，与凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 8，150 mM NaCl，10%[w/v]甘油，1 mM DTT）平衡。通过测量280 nm处的蛋白质吸光度及其计算的摩尔消光系数，浓缩并量化感兴趣的蛋白质的峰分数(https://web.expasy.org/protparam网站/). 纯化的蛋白质在液态N中快速冷冻2并在−80°C下储存在一次性等分样品中。
小牛胸腺组蛋白H1的纯化。
将小牛胸腺组蛋白H1（14–155；EMD Millipore）稀释在20体积的组蛋白H1-缓冲液A（25 mM K+警察−4pH6.8，100 mM NaCl，1 mM DTT），并流经Source 15Q柱以去除任何游离DNA，并应用于在组蛋白H1缓冲液a中平衡的Source 15S柱。用2个柱体积的组蛋白H1-缓冲液a和0–20%的组蛋白H2-缓冲液B（25 mM K+人事军官−4pH 6.8，2 M NaCl，1 mM DTT），超过5个柱体积。使用3000道尔顿MWCO离心浓缩器浓缩含有组蛋白H1缓冲液B的线性洗脱梯度的组蛋白H2组分，并将其应用于在组蛋白H1-缓冲液a中平衡的Superdex 75 Increase 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）。使用3000道尔顿MWCO离心浓缩器浓缩含有纯化组蛋白H1的组分，并通过在280 nm处测量组蛋白H1-蛋白吸光度和计算出的摩尔消光系数进行量化(https://web.expasy.org/portparam/)组蛋白H1.5为1490/M•cm。纯化组蛋白H1按单次使用量进行校准，用液体N快速冷冻2，并在−80°C下储存。
p300HAT、GFP-TetR和GFP-Tet R-p300的纯化帽子在大肠杆菌中表达。
表达式：
罗塞塔2（pLysS）大肠杆菌（Novagen）被pETduet+p300转化帽子、pETduet+sfGFP-TetR或pETduet+sfGFP-TetR-p300帽子编码p300（p300）组蛋白乙酰转移酶结构域的质粒帽子)和由超文件夹GFP、大肠杆菌四环素受体（TetR）和GFPTetR-p300帽子使用N末端烟草蚀刻病毒蛋白酶可裂解10xHIS标签，在琼脂平板上过夜，LB培养基中添加100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素。使用单个菌落接种LB与氨苄西林和氯霉素的液体预培养物，如上所述，在37°C下生长约8小时。液体预培养物在台式离心机中以4000 RPM的转速离心10分钟，然后再悬浮在小体积LB培养基中，接种3 L含有100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素的特瑞肉汤（Difco），其生长位置为116，在琼脂平板上，通过在LB上重新涂敷一个转化子来生长，LB补充有Antifoam 204、100 ng/μL氨苄西林和25 ng/μL氯霉素，在37°C下生长到一定密度（OD600纳米)第1.0页。将细菌培养物冷却1小时至18摄氏度，并通过添加1 mM IPTG诱导重组蛋白表达，并在18°C下培养18小时。离心收集细胞，重悬于IMAC裂解缓冲液（50mM HEPES，pH 7，150mM NaCl，5mMß-巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1mM苄脒，100μM Leupeptin，100μM Antipain，1μM Pepstatin）中，细胞悬浮液在液体N中快速冷冻2,并储存在−80°C。
净化：
大肠杆菌将重新悬浮在IMAC裂解缓冲液中的表达重组蛋白在湿冰上解冻，并用等体积的IMAC稀释缓冲液稀释（50 mM HEPES，pH 7，1.85 M NaCl，10 mM咪唑，5 mM巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗疼痛，1μM胃蛋白酶抑制剂），并在约10000 PSI的压力下通过Avestin乳胶-C5高压均质器进行多通道裂解。通过Beckman Avanti J-26 XPI离心机中的细胞碎片在4°C、19500 RPM、JA25.5转子中离心40分钟，分离出可溶性细菌裂解物。将澄清的可溶性细菌裂解液分批应用于15 mL NiNTA树脂（Qiagen）中2小时，并进行端到端混合，然后在玻璃Econo-Column（BioRad）中用500 mL IMAC洗涤缓冲液a洗涤（50 mM HEPES，pH 7，1 M NaCl，25 mM咪唑，5 mM巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒）和100mL IMAC洗涤缓冲液B（50mM HEPES，pH 7，150mM NaCl，30mM咪唑，5mMß-巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1mM苄脒）。用100 mL IMAC洗脱缓冲液（50 mM HEPES，pH 7，150 mM NaCl，300 mM咪唑，5 mM巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒）从NiNTA树脂中洗脱重组蛋白。NiNTA洗脱液在4°C下用烟草蚀刻病毒蛋白酶隔夜（≥16小时）裂解，用9体积的离子交换缓冲液A（20 mM Tris•HCl，pH 8，1 mM DTT）稀释，并应用于Source 15Q树脂（GE Healthcare）。用5–60%离子交换缓冲液B从Source 15Q树脂中洗脱重组蛋白，洗脱量超过40个柱体积（20 mM Tris•HCl，pH 8，1 M NaCl，1 mM DTT）。对于GFP-TetR-p300帽子，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测定的含有融合蛋白的级分，合并，用9体积的离子交换缓冲液A稀释，应用于Source 15S树脂（GE Healthcare），并用5-55%的离子交换缓冲液B在50个柱体积上洗脱。300页帽子使用HiLoad SD200 26/60 pg柱（GFP-TetR和p300帽子)或在凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris•HCl，pH 8，150 mM NaCl，10%[w/v]甘油，1 mM DTT）中增加一个Superdex 200 10/300 GL柱（GFP-TetR-p300）。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测定每种蛋白质的最纯峰分数，并使用计算出的p300消光系数和280 nm吸光度进行汇总、浓缩和量化帽子以及已知的sfGFP在485 nm（83300/M•cm）处的摩尔消光系数。净化p300帽子、GFP-TetR和GFP-Tet R-p300帽子用液态氮快速冷冻2，并在−80°C下储存。
昆虫细胞表达的Cy5-标记BRD4的纯化。
表达式：
使用Bac-to-Bac方法生产用于BRD4杆状病毒生成的杆状病毒培养基，其中用pAV5B+BRD4质粒转化DH10bac细胞，然后进行蓝/白菌落筛选。将杆状病毒转化为Sf9细胞生成杆状病毒。通过多次感染和培养基收集产生高滴度杆状病毒。用高滴度病毒感染Sf9细胞，并辅以10%FBS和青霉素/链霉素诱导BRD4大规模表达。2天后，通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在Sf9 Harvest缓冲液中（50 mM Tris，pH 8，150 mM NaCl，5 mM巯基乙醇，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗蛋白酶，1μM胃蛋白酶抑制素）。
净化：
在水浴中解冻2升表达再次悬浮在Sf9收获缓冲液中BRD4的Sf9细胞，并用等量的Sf9-稀释缓冲液稀释（50 mM HEPES，pH 7，1.85 M NaCl，10 mM咪唑，20 mM NaPPi，0.01%NP-40，10 mmM巯基乙醇，10%[w/v]甘油、1 mM苯甲脒、100μM亮氨酸、100μM抗痛药、1μM胃蛋白酶抑制素、100ng/mL抑肽酶、不含EDTA-的完整蛋白酶抑制剂[Roche]），并用Branson数字声波发生器超声溶解3分钟。通过Beckman Avanti J-26 XPI离心机中的细胞碎片在JA25.5转子中以19500 RPM在4°C下离心1小时，分离出可溶性昆虫细胞裂解物。通过0.22μm注射器过滤器将澄清的裂解液过滤两次，分批应用于5 mL泰龙树脂（Clontech）中2小时，并进行端到端混合，然后在玻璃Econo-Column（BioRad）中用250 mL泰龙洗涤缓冲液（50 mM HEPES，pH 7，1 m NaCl，10 mM咪唑，15 mM NaPPi，0.01%NP-40，10 mmM巯基乙醇，10%[w/v]洗涤甘油、1 mM苯甲脒、100μM亮肽、100μM止痛药、1μM胃蛋白酶抑制素、100ng/mL抑肽酶、完全无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏））。使用泰龙洗脱缓冲液（50 mM HEPES，pH 7，150 mM NaCl，500 mM咪唑，10 mM巯基乙醇，10%[w/v]甘油，0.01%NP-40，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM抗痛药，1μM胃蛋白酶抑制素，100ng/mL抑肽酶，完全无EDTA-蛋白酶抑制剂[Roche]）从泰龙树脂中用3个柱体积分馏BRD4。用9体积的肝素缓冲液A（20 mM Bis-Tris，pH 6，2 mM DTT，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM止痛药，1μM胃蛋白酶抑制素，100 ng/mL抑肽酶）稀释含有BRD4的组分并应用于在95%肝素缓冲液a和5%肝素缓冲溶液B中平衡的HiTrap肝素色谱柱（20 mM Bis-Tris，pH 6，1 M NaCl，2 mM DTT，10%[w/v]甘油，1 mM苯甲脒，100μM亮肽，100μM止痛药，1μM Pepstatin，100ng/mL抑肽酶）。加载BRD4后，用5%肝素缓冲液B在肝素缓冲区A中清洗肝素柱，并用5-100%肝素缓冲溶液B的线性梯度洗脱。含有BRD4的馏分在4°C下用烟草蚀刻病毒蛋白酶隔夜（≥16小时）裂解，用离心浓缩器浓缩，并使用Superdex 200 Increase 10/300 GL柱在凝胶过滤缓冲液（20mM Tris•HCl，pH 8，150mM NaCl，10%[w/v]甘油，1mM DTT）中通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测定的最纯净的峰组分被合并、浓缩，并使用BRD4的摩尔消光系数在280nm处的吸光度进行量化。未用于标签的纯化BRD4已验证，用N液体快速冷冻2，并在−80°C下储存在一次性等分样品中。
标记：
至22μM纯化的BRD4，50μM Cy5标记的脱肽分拣酶识别序列（GenScript）(Williamson等人，2014年)和3μM eSrtA(Chen等人，2011年)已添加。通过添加10 mM CaCl启动排序酶介导的Cy5标记肽的连接2反应。在4°C下用Cy5-共轭肽标记BRD4过夜后，将反应产物稀释在9体积的MonoQ缓冲液A（10 mM TRIS，pH 8，10%[w/v]甘油，1 mM DTT）中，并将其应用于0.5 mL MonoQ色谱柱（GE Healthcare），该色谱柱在98.5%MonoQ缓冲器A和1.5%MonoQ缓冲剂B（10 mM-TRIS，pH8，1 M NaCl，10%[w/v]中平衡甘油、1mM DTT）。将Cy5标记的BRD4从未反应的脱肽类和eSrtA中分离出来，并在1.5-100%MonoQ缓冲液B的线性梯度上进行分离。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法测定BRD4的最纯部分，在280nm处使用BRD4摩尔消光系数的吸光度进行合并、浓缩和定量。经SDS-PAGE分离后，BRD4凝胶内荧光证实标记。对纯化的Cy5-BRD4进行校准，用液体N快速冷冻2，并在−80°C下储存在一次性等分样品中。
组蛋白八聚体的重组
将组蛋白H4和H3或组蛋白H2A和荧光标记或未标记H2B的等分样品分别以200或240 nmol的量在湿冰上解冻，并在组蛋白展开缓冲液中分别稀释至3 mL体积，总体积为12 mL。组蛋白混合物在1000道尔顿MWCO透析管（Spectra/Por）中与2升回流缓冲液（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，2 M NaCl，1 mM EDTA，5 mM巯基乙醇）进行三次透析，第二和/或第三次透析步骤持续过夜。透析液通过0.45μm Whatman GD/XP注射器过滤器过滤。使用HiLoad SD200 26/60 pg色谱柱，通过透析液的尺寸排除色谱分离折叠组蛋白八聚体。通过15%PAGE-SDS分析对峰分数进行分析，以确定核心组蛋白的化学计量比，并将具有清晰组蛋白八聚体的峰分数合并，使用10000道尔顿MWCO离心浓缩器浓缩，并通过测量280、495、，和590以及摩尔消光系数的吸光度和计算值(https://web.expasy.org/portparam/或Thermo Scientific），组蛋白八聚体、AF488和AF594分别为44700/M•cm、73000/M•厘米和92000/M·厘米。100%标记的组蛋白八聚体通过荧光与组蛋白八聚体的化学计量比2:1过量得到证实。对纯化和差异标记的组蛋白八聚体进行鉴定，用液体N快速冷冻2，并在−80°C下储存。
12×601、6×601和4×601阵列DNA的分离纯化。
p12×601改造为大坝−/分布式控制模块−
大肠杆菌菌株ER2925，并将其置于添加了20 ng/μL Zeocin的LB琼脂平板上过夜生长。6升LB和20 ng/μL Zeocin在37°C下摇晃过夜，然后接种8小时液体LB和从LB琼脂平板上的单个菌落开始的20 ng/微升Zeocin预培养。第二天早上，在Sorvall RC3C Plus离心机中通过离心收集6升混浊培养物，并根据制造商说明使用Qiagen plasmid Giga Kit纯化质粒DNA。通过与5000单位EcoRV-HF限制性内切酶（新英格兰生物实验室）在1x CutSmart缓冲液（20 mM Tris•OAc，pH 7.9，50 mM KOAc，10 mM Mg[OAc]）中培养过夜（≥16小时），从载体质粒DNA中切取12×601阵列DNA2，0.1 mg/mL BSA）。通过添加20 mM EDTA停止反应，并通过苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）萃取和乙醇沉淀纯化DNA。将DNA重悬于TE500（10mM Tris•HCl，pH 7.5，1mM EDTA，500mM NaCl）中，并通过PEG沉淀对12×601进行分级，在TE500中逐滴加入30%PEG-8000，并在涡流下加入DNA溶液。在用于核小体组装之前，通过1xTAE（40 mM Tris•OAc，pH 8.6，20 mM OAc，1 mM EDTA）中1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（Bio-Rad）染色，确认12×601 DNA阵列纯度>99%。用SacI或NcoI和KpnI限制性内切酶在1x CutSmart缓冲液中消化12×601阵列DNA，制备6×601或4×601序列DNA。通过苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）萃取和乙醇沉淀纯化DNA通过1xTAE（40 mM Tris•OAc，pH 8.6，20 mM OAc，1 mM EDTA）中1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（Bio-Rad）染色，确认6×601或4×601 DNA阵列的99%纯度。用SacI或NcoI和KpnI限制性内切酶在1x CutSmart缓冲液中消化12×601阵列DNA，制备6×601或4×601序列DNA。通过苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）萃取和乙醇沉淀纯化DNA在1xTAE（40mM Tris•OAc，pH 8.6，20mM OAc，1mM EDTA）中进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭（Bio-Rad）染色，确认6×601或4×601 DNA阵列的99%纯度。
如上所述，为制备p12×601，生成了具有不同重复长度的pWM_12×601阵列，省略了12×601DNA的PEG纯化。EcoRV消化的pWM主干在组装过程中作为“载体”DNA的来源。
配体相容性601 DNA的制备
98×102μL聚合酶链反应（20 mM Tris•HCl，pH 8.8，10 mM[NH4]2个4，10 mM KCl，2 mM MgSO40.1%Triton®-X-100，500 nM寡核苷酸，25 pg/μL 601模板，25 mU/μL TAQ DNA聚合酶[NEB]，250μM每个dNTPs，1%DMSO），（1）在95℃下2分钟，（2）在95°C下40个周期，30秒，60°C下30秒，72°C下1分钟，（3）在72°C时2分钟，以及（4）冷却到4°C。在3000道尔顿MWCO离心浓缩器（Amicon）中合并单独的反应，并通过添加400μL 0.5 M EDTA停止10 mL PCR反应。去除未结合的dNTPS和寡核苷酸，通过重复离心浓缩和随后用1xTE（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA）稀释PCR反应洗涤PCR扩增的DNA。浓缩和1xTE-水洗PCR产物通过苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）萃取和乙醇沉淀纯化。用1000单位限制性内切酶BstXI（NEB）隔夜（≥16小时）消化扩增的DNA。切割PCR产物通过苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）萃取和乙醇沉淀纯化，并在TE50（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，50 mM NaCl）中重新悬浮。用Superdex 200 Increase 10/300GL柱对TE50中的BstXI消化DNA进行大小排阻层析，分离出具有配体相容性的dsDNA，并用3000道尔顿MWCO离心浓缩器（Amicon）浓缩用于核小体组装。
多核小体阵列和单核小体的制备
核小体组装的设置。
定量DNA模板和组蛋白八聚体在湿冰上解冻。将溶解在1xTE中的601序列DNA和等体积的4M组装缓冲液（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，4 M NaCl，2 mM DTT）在冰上彻底混合，然后添加等摩尔量的组蛋白八聚体比率（相对于模板中601核小体定位序列）。八聚体/601的最终浓度在1-5μM之间变化，荧光标记到未标记组蛋白八聚体的百分比在1-100%标记核小体之间变化，组装效率没有明显差异。突变体的组装X·莱维斯通过添加0.2摩尔比的组蛋白H2A/H2B二聚体，组蛋白八聚体进入核小体。将组蛋白八聚体和含601的DNA模板移入在高盐组装缓冲液（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M KCl，1 mM DTT）中平衡的<8000 Dalton MWCO透析室中。
盐透析介导的核小体组装。
首先，将透析室放置在2 L高盐组装缓冲液中，使用蠕动泵以0.8 mL/min的速度持续稀释2 L低盐组装缓冲溶液（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，200 mM KCl，1 mM DTT），并在4°C下剧烈搅拌，从而降低盐浓度。第二，在耗尽低盐装配缓冲液后，透析体积减少到500 mL液体，并通过在4°C下以0.8 mL/min的速度连续稀释1 L无盐装配缓冲溶液（10 mM Tris•HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM DTT），持续剧烈搅拌，进一步降低盐浓度。最后，在4°C的温度下，用无盐装配缓冲液对透析室进行透析，透析时间至少为小时。
蔗糖梯度介导的核小体纯化。
在盐介导透析后，将组装好的多核小体阵列或无盐组装缓冲液中的单核小体应用于无盐组装缓冲器中的线性15-40%或5-20%蔗糖梯度。含有组装核小体的蔗糖梯度组分在10000道尔顿MWCO离心浓缩器（Amicon）中浓缩。对于NRL系列12×601阵列，在蔗糖梯度介导的核小体纯化后，从核小体组件中去除所有“载体”DNA。
核小体浓度的定量。
为了量化最终染色质浓度，将1μL组装好的多核小体阵列或单核小体或其已知DNA浓度的DNA模板添加到99μL SDS/PK缓冲液（45 mM Tris•HCl，pH 7.5，9 mM EDTA，1%SDS）中，并在室温下孵育30分钟。DNA通过苯酚：氯仿：异戊醇提取和乙醇沉淀或使用Qiagen PCR纯化试剂盒处理样品进行纯化。组装的单核小体中的DNA数量根据从未组装模板中纯化的DNA的连续稀释产生的标准曲线进行测定。
核小体组装的质量保证。
通过电泳迁移率变化分析评估单核小体组装体和连接体DNA消化的多核小体组件的质量。此外，在1x CutSmart缓冲液中使用EcoRI-HF（连接DNA位点）或BsiWI-HF（核小体DNA位点）对纯化的未组装12×601 DNA进行差异消化，以评估多核小体组装的质量。对于该测定，用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化DNA片段，并在1xTAE中的1%琼脂糖凝胶上进行分析。
384孔显微镜板的制备
二氧化硅的聚乙二醇化。
384孔显微镜板（Brooks Life Science Systems Matriplate）在37°C下用5%Hellmanex清洗4小时，然后用≥18 MΩH充分冲洗2在室温下用1 M NaOH蚀刻O二氧化硅1小时，然后用≥18 MΩH充分冲洗2O.将脱聚二氧化硅在室温下共价键合至悬浮在95%乙醇中的25 mg/mL 5K mPEG硅烷（PEGWorks）过夜（≥18小时）。用95%乙醇清洗一次平板，用大量≥18 MΩH的水冲洗2O、 并在化学罩中完全干燥3-4小时。将聚乙二醇化显微镜板密封，直到个别微孔使用粘性PCR板箔（Thermo）。
用牛血清白蛋白钝化微孔。
聚乙二醇化后，在使用之前在各个孔上方切割箔，塑料和聚乙二醇化玻璃均通过与新制备的100 mg/mL BSA孵育30分钟来钝化。用≥18 MΩH冲洗一次微孔2O去除多余的BSA，并立即将显微镜样品（15–40μL体积）添加到空孔中。显微镜样品加入平板后，通过透明透明胶带密封，限制了显微镜样品的干燥。
多核糖体阵列的相位分离
值得注意的是，我们观察到，质粒DNA或六核小体污染数量消失的核小体阵列可能会导致盐的绝对数量（例如±25 mM KOAC，±1 mM MgOAc）和核小体数组（例如±50 nM）的适度差异，从而导致可观察到的相分离。尽管这些适度的数量差异在数量上与我们对数据的解释无关，但质的差异（如与连接蛋白组蛋白或10n+5连接蛋白DNA长度的更多相分离）仍然不受核小体阵列产生的微小差异的影响。
多核糖体阵列的相分离。
首先在染色质稀释缓冲液（25 mM Tris•OAc，pH 7.5，5 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1 mg/mL BSA，5%[w/v]甘油）中平衡核小体阵列，其中有1/100组蛋白H2B蛋白用荧光标记，并在室温下培养5分钟。除非另有说明，否则通过添加1体积的相分离缓冲液（25 mM Tris•OAc，pH 7.5，0.1 mM EDTA，5 mM DTT，0.1 mg/mL BSA，5%[w/v]甘油，300 mM KOAc，1 mM mg[OAc]）诱导相分离2，2μg/mL葡萄糖氧化酶[SIGMA分类号G2133]，350 ng/mL过氧化氢酶[SIGMA-分类号C1345]，4 mM葡萄糖）至750 nM染色质，在染色质稀释缓冲液中平衡。在添加相分离30分钟后，轻轻混合缓冲反应，并将其添加到聚乙二醇化和BSA钝化显微镜板的孔中。
同相染色质结合和显微镜。
小牛胸腺组蛋白H1和基于H1.4的重组蛋白质：
在添加相分离缓冲液后的30分钟孵育期后，将组蛋白H1缓冲液a中的10x浓缩组蛋白H1、10x浓缩H1.4基重组蛋白或其凝胶过滤缓冲液单独以相对于核小体的1:1化学计量比添加到相分离染色质中。立即将样品添加到聚乙二醇化和BSA钝化的显微镜板中。在384孔显微镜板中孵育1小时后，获得旋转盘共焦显微镜图像。
GFP-TetR和GFP-Tet-R-p300融合蛋白：
添加添加或不添加2μg/mL多西环素、4μM GFP-TetR或GFP-Tet R-p300的相分离缓冲液后，经过30分钟的培养期帽子在凝胶过滤缓冲液中稀释，以0.333反应体积加入相分离染色质，并在室温下培养30分钟。然后将样品移到聚乙二醇化和BSA钝化的显微镜板上。在384孔显微镜板中培养1小时后获得旋转盘共聚焦显微镜图像。用于GFP-TetR-p300的时间分辨显微镜帽子-依赖组蛋白乙酰化和液滴溶解，向显微镜中加入1μL 10 mM乙酰辅酶A，并通过扩散混合。
核心组蛋白尾的胰蛋白酶化
测序级胰蛋白酶（Promega）在50 mM醋酸中以100 ng/μL的浓度溶解，快速冷冻，并在使用前储存在−80°C。就在蛋白水解之前，将胰蛋白酶稀释在9体积的25 mM Tris•HCl中，pH值为8，以中和50 mM乙酸。核小体在胰蛋白酶消化缓冲液（25mM Tris•OAc，pH 7.5，0.1mM EDTA，5mM DTT，5%[w/v]甘油，0.25ng/mL胰蛋白酶）中在室温下进行30分钟的胰蛋白酶消化，并通过添加最终浓度分别为50ng/mL和0.25mg/mL的抑肽酶和BSA来停止反应。通过核心组蛋白的15%PAGE-SDS和考马斯亮蓝染色确认消化，并将停止的反应添加到相分离测定中，完全如上所述。
单核小体核小体阵列的配体依赖性组装。
在连接组装缓冲液（50 mM Tris•OAc，pH 7.5，5 mM DTT，200μM ATP，3 mM Mg[OAc]2，100 mM KOAc，0.1 mg/mL BSA，5%[w/v]甘油，1 U/μL T4 DNA连接酶（酶学）），在室温下保持30分钟，通过添加0.2反应体积的6x反应停止缓冲液（60 mM EDTA，pH 8，400 mM KOAc）停止反应。在通过游离镁螯合进行淬灭结扎后，将结扎反应转移到mPEG化和BSA钝化显微镜板的孔中。通过将SDS/PK缓冲液添加到100μL的最终体积中提取DNA，并根据制造商的说明使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化。用BsiWI-HF消化结扎产物中601个DNA序列作为T4 DNA连接酶结扎程度的定量测量。
冷凝液和溶液中核小体浓度的绝对定量
同相定量。
如上所述，使用盐透析法和蔗糖梯度纯化法组装未标记和8.3%（1:12）AF594标记的12×601多核糖体阵列。结合核小体阵列以获得0.1%AF594或AF488标记的八聚体，并如上所述触发染色质的相分离，省略Mg（OAc）2在相位分离缓冲器中。将添加或不添加相对于核小体的等摩尔组蛋白H1的液滴移至mPEG化和BSA钝化的显微镜下。相对于游离AF594或AF488染料的标准曲线，在孵育1小时后测量液滴内的平均荧光强度。
溶解定量。
采用上述盐透析法和蔗糖梯度纯化，用100%AF594标记的组蛋白八聚体组装12×601多核糖体阵列。如上所述触发相分离，液滴在微型离心机中以最大速度造粒10×1分钟。在室温下平衡10分钟后，将液滴上方的上清液移入mPEG化和BSA钝化的显微镜井中，并相对于游离AF594染料的标准曲线测量荧光强度。
电泳迁移率测定
在最终浓度分别为40%w/v和5 mM的纯化DNA、单核小体或BstXI消化的12×601阵列中添加甘油和NaCl，并将其装入用0.5x TAE缓冲的6%聚丙烯酰胺凝胶孔中。在使用ChemiDoc成像站（BioRad）对标记核小体的荧光成像和使用溴化乙锭对DNA染色之前，通过100伏电泳分离含核酸样品40分钟。
组蛋白乙酰化（通过GFP-TetR-p300）帽子
12×601野生型核糖体阵列组装X·莱维斯用Atto565荧光团或碱性斑突变体标记的组蛋白八聚体X·莱维斯用Cy5荧光标记的组蛋白八聚体在染色质稀释缓冲液（25 mM Tris•OAc，pH 7.5，5 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1 mg/mL BSA，5%[w/v]甘油）中平衡，并在室温下培养5分钟。通过添加1体积的相分离缓冲液（25 mM Tris•OAc，pH 7.5，0.1 mM EDTA，5 mM DTT，0.1 mg/mL BSA，5%[w/v]甘油，300 mM KOAc，1 mM mg[OAc]）诱导相分离2，2μg/mL葡萄糖氧化酶[SIGMA分类号G2133]，350 ng/mL过氧化氢酶[SIGMA-分类号C1345]，4 mM葡萄糖，±2μg/mL多西环素）到染色质（1μM核小体）在染色质稀释缓冲液中平衡。添加相分离缓冲液GFP-TetR-p300后30分钟帽子以250 nM的最终浓度添加，并在室温下培养30分钟。体外乙酰化通过添加400μM乙酰辅酶A触发，反应在室温下进行30分钟，然后通过添加1反应体积的2x SDS-PAGE样品缓冲液（65.8mM Tris•HCl，pH 6.8，0.71mMß-巯基乙醇，26.3%[w/v]甘油，2.1%[w/v]十二烷基硫酸钠，0.01%溴酚蓝）停止
体外乙酰化反应的反应产物在15%PAGE-SDS凝胶上运行，并转移到PVDF膜上，以通过western印迹进行分析。在TBST中用5%牛奶（20 mM Tris•HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05%吐温）封闭PVDF膜，并用1:5000稀释的兔抗组蛋白H3K27乙酰化多克隆抗体（Abcam ab4729）在TBST的1%牛奶中在4°C过夜进行印迹。用TBST多次冲洗，从膜上洗去一级抗体，并在室温下将1:10000小鼠抗兔HRP与膜在TBST中1%牛奶中孵育1小时。从膜上清除多余的二级抗体，并使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad），利用Millipore Immobilon HRP底物开发western印迹信号。
组蛋白乙酰化和微量注射。
对于十二聚核小体阵列的微量注射，阵列在注射前在体外进行乙酰化。用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594标记的浓度为5.5μM的核小体阵列与2.3μM重组p300组蛋白乙酰转移酶结构域在0.8mM乙酰辅酶a存在下孵育。仅使用不含酶的缓冲液和添加到相同数量核小体阵列中的辅酶A进行控制反应。在室温下2小时后，通过添加A-485（10%二甲基亚砜中的100μM，Tocris）至10μM最终浓度，使反应停止。直接注射或乙酰化的核小体阵列，将带有不同荧光标记的非乙酰化阵列以1:1混合进行微量注射。使用Eppendorf InjectMan®4控制器和FemtoJet®4i执行微注射，该控制器安装在蔡司LSM780上。核小体阵列的核注射使用商业Femtotips™微注射毛细管。注射参数为150hPa、0.7~1s、20hPa，用于向细胞核输送中到高容量。
组蛋白与溴代多巴胺蛋白质的乙酰化反应。
12×601核小体阵列（2μM核小体浓度）与1μM重组p300组蛋白乙酰转移酶域在乙酰化缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5，13.6 mM KOAc，5%[w/v]甘油，5 mM二硫苏糖醇，0.1 mM EDTA，0.1 mg/mL BSA，700μM乙酰辅酶A）中孵育。仅使用不含p300的缓冲液进行对照反应帽子酶。室温下1小时后5.5μM溴5，EGFP-溴5，EGFP-溴5N140A，27.5μM EGFP-溴1或向核小体阵列中添加10μM BRD4，以获得最终浓度的1μM核小体和溴化缓冲液（25 mM Tris，pH 7.5，150 mM KOAc，1 mM MgOAc，5%[w/v]甘油，5 mM二硫苏糖醇，0.1 mM EDTA，0.1 mg/mL BSA）组成。通过添加40μM JQ-1对BRD4-和乙酰赖氨酸驱动的相分离进行化学抑制。对于合成的含有溴代多巴胺的蛋白质，添加10μM C646抑制剂（sigma）以通过p300抑制乙酰化帽子。
显微镜
染色质滴。
共焦荧光显微镜图像是在配备横河CSU-X1旋转圆盘共焦扫描装置、100 X 1.49 NA物镜和Andor EM-CCD相机的尼康Eclipse Ti显微镜底座上拍摄的。使用TIRF/iLAS2 FRAP模块（Biovision）和Rapp UGA-40光靶仪实现了光漂白后的荧光恢复（FRAP）。
活细胞显微镜。
共焦显微镜在定制的蔡司LSM780显微镜上进行，使用由ZEN 2011控制的×40，1.4 NA，Oil DIC Plan-Apochromat物镜（蔡司）。该显微镜配有培养室（德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）），在37°C下提供5%CO2的增湿环境。
免疫荧光。
将抗乙酰组蛋白抗体和荧光次级抗鼠或抗兔抗体分别以1:500和1:1000的稀释度添加到2%无脂肪酸的BSA溶液中。使用定制的蔡司LSM780显微镜，使用由ZEN 2011控制的×40，1.4 NA，Oil DIC Plan-Apochromat物镜（蔡司），对免疫荧光进行成像。
量化和统计分析
对实验数据及其表示进行的统计测试在图例中注明。
体外生成的染色质滴
使用ImageJ（1.51版）进行图像分析(施耐德等人，2012年). 除非另有说明，否则在给定面板中描绘显微镜图像时使用等效亮度和对比度。使用R统计软件包绘制ImageJ处理的显微镜数据(团队，2013)。
相图。
根据由Atto565标记的核小体重复长度为194 bp的十二碳核小体阵列的浓度梯度滴定不同浓度的单价盐和/或二价盐X·莱维斯组蛋白，并使用共焦荧光显微镜在384孔板的玻璃底部成像。每口井均采用相同的显微镜设置。在整个实验中，使用最小荧光强度值对结果.tif文件进行基线校正。在ImageJ中计算每个实验条件下代表性图像的平均像素强度和标准偏差。使用Java TreeView确定每个条件下变异系数值的灰度强度(Saldanha，2004年)。
相对荧光强度的定量。
染色质滴的平均荧光值由核小体阵列测定，核小体的荧光标记率为1/100或更少。为了测定因子驱动的荧光强度差异，使用不含荧光团的蛋白质来避免荧光猝灭伪影。所有平均荧光强度在ImageJ中由.tif文件测量，使用相似大小的染色质液滴中心，无焦平面引起的可见荧光降解。
微注射核小体阵列
Fiji（版本ImageJ 1.51w，Java 1.8.0_66，64位）使用自定义脚本进行图像分析，以避免基于用户的偏见。
为了确定注射的微阵列和内源性染色质之间的共定位，使用Hoechst染色DNA的图像生成一个掩模，其中像素被分为3乘3的邻域。对于每个像素，提取坐标和像素值，然后使用Graphpad PRISM 7.04版进行关联。为了分析变异系数，使用DNA通道生成一个掩模，其中测定了核小体阵列通道的平均荧光和变异系数。考虑核平均荧光超过5000 AU的细胞。在Graphpad PRISM 7.04版中进行了正态性检验和统计检验。
用于Ki67-eGFP表达细胞核小体阵列的线型测量(Cuylen等人，2016年)，通过核仁边缘测量8像素宽的显微图像截面。测量了DNA（Hoechst）、Ki67-eGFP和核小体阵列沿谱线的强度，分别以DNA（Hoechst）的最高值对齐，并相对于每个通道的细胞质背景进行归一化。
为了量化乙酰化水平，使用DNA（Hoechst）通道通过自动阈值化生成核掩模。在这个核掩模内，测定每个抗体的每个核的平均荧光强度值，并相对于非TSA处理的细胞进行归一化。
基因组分析
基因组分析结合了以下参考的已发布软件分析包和定制生成的脚本，可根据要求提供。
NRL量化的非参数归一化。
NRL量化是使用R统计软件包计算核小体间距的每基频与其LOESS平滑包络之间的差异(2013年团队). 假设单个核小体占据147个碱基对的DNA。
染色质景观亚型的定义。
多梳组区域：
多梳组区域定义为E14tga2小鼠ES细胞中的H3K27me3 ChIP-seq峰(联合体，2012年)与小鼠ES细胞的H3K27me3、H2Aub、EZH2和Ring1b ChIP-seq峰重叠(昆都等人，2017年)。
染色质亚型的ChIP-seq富集。
组蛋白H1d ChIP-seq的log2读取深度归一化富集的箱线图(曹等，2013)和ESE14细胞中的H3K27ac-ChIP-seq(联合体，2012年)在每个染色质亚型或基因组分裂成1兆碱基对片段后，计算相对于输入的相对值。
数据和代码可用性
所有自定义代码均可根据要求从作者处获得。
补充材料
1
图S1。核小体阵列组装后染色质LLPS的定性控制
.（A）(左上角)在12×601核小体阵列内，与位置良好的核小体相关的EcoRI和BsiWI限制性核酸内切酶识别位点图。(右下角)使用EcoRI-HF和BsiWI-HF限制性内切酶对裸12×601 dsDNA和组装成染色质的12×601DNA进行差异消化。使用Qiagen PCR纯化试剂盒提取切割DNA，并在1xTAE中的1%琼脂糖凝胶上运行。（B）(左上角)在12×601核小体阵列内，与位置良好的核小体相关的BstXI限制性核酸内切酶识别位点图。（右下）溴化乙锭染色12×601阵列DNA的Native PAGE电泳迁移率漂移分析，包括组装成染色质和未组装成染色素。（C） 12×601阵列DNA单独、组蛋白八聚体单独、游离组蛋白与12×601-阵列DNA混合以及通过盐透析介导组装制备的染色质的共焦荧光显微镜图像。绿色的DNA用YOYO-1标记，品红色的组蛋白用AF594标记在组蛋白H2B上。（D） 相分离染色质组装的共焦荧光显微镜图像X·莱维斯或H.智人组蛋白八聚体用Atto565标记在组蛋白H2A上，或组蛋白H2B用AF488或AF594染料标记(顶部到中间底部). 组装染色质的微分干涉对比显微镜图像H.智人不含共轭染料的组蛋白八聚体(底部）（E）组蛋白H2B上AF594标记的染色质滴和YOYO-1标记的dsDNA的显微图像。将液滴添加到显微镜板的孔中，显微镜板经过和未经mPEG化处理，以及经过和未经过BSA钝化处理。标尺分别为橙色和白色的4和10μm。
2
图S2。通过滴定单价盐、二价盐、核小体浓度、染色质长度和组蛋白尾部来调节染色质滴的形成，与
.组装染色质的荧光显微镜图像X·莱维斯（A）KOAc和Mg（OAc）滴定后用Atto565标记组蛋白H2A上的组蛋白八聚体2at或（B）KOAc和染色质。（C） 12×601阵列DNA的1%琼脂糖凝胶电泳，SacI-消化6×601序列DNA，KpnI-和NcoI-消化4×601链DNA并用溴化乙锭染色。（D）(在上面)描述用于组装单核小体的DNA模板的分子特征的示意图，所述单核小体包含601核小体定位序列、可定向连接的末端和BsiWI限制性位点。(在下面)溴化乙锭染色DNA的凝胶内成像，在6%天然PAGE凝胶上电泳分离，有（mn条）和没有组装成单核小体。左侧凝胶显示溴化乙锭荧光，右侧凝胶显示AF488-组蛋白H2B荧光。（E） 在T4 DNA连接酶介导的单核小体连接后，通过琼脂糖凝胶电泳分离出经BsiWI（底部）消化和未经BsiWI（顶部）消化的分离连接产物，并用溴化乙锭进行可视化。（F） AF488标记染色质滴的荧光成像（左上角，伪品红色）。在没有镁的情况下（右上），ATP（左下）或T4 DNA连接酶（右下）不会结扎（面板E），也不会形成液滴。白色标尺为10μm。（G） 染色质与胰蛋白酶蛋白水解后的考马斯亮蓝染色15%PAGE-SDS凝胶。*表示染色质消化后出现的抗胰蛋白酶带，随着时间的推移强度增加，并在消化的第二个15分钟内保持不变，表明组蛋白尾部被胰蛋白酶消化成功，组蛋白八聚体核心保留。
三
图S3。液滴动力学、对组蛋白H4尾部的依赖性以及组蛋白H1存在与否时的密度与
——.（A）在含有150 mM KOAc的缓冲溶液中，375 nM核小体浓度的染色质的荧光显微镜图像，与野生型、碱性斑突变体或酸性斑突变体组装X·莱维斯组蛋白八聚体。（B） 添加10 mM EDTA前和30秒后AF594标记染色质的显微图像。（C） 由AF594标记的核小体阵列组成的整个染色质液滴光漂白后荧光恢复的显微图像。（D） 来自面板C的6个单独光漂白实验的定量。（E）相对于游离AF594染料的标准曲线，带有1/1000核小体（0.1%）双重标记Alexa Fluor 594（AF594）的染色质液滴的平均液滴强度。10个染色质液滴的平均液滴强度用水平红线表示。（F） 三个独立的实验，定量粒化染色质浓缩物上清液中的荧光团含量，核小体全部（100%）双重标记AF594，相对于游离AF594荧光染料的标准曲线（填充黑色圆圈）。（G） 图示组蛋白八聚体的标记方案，每八聚体突出显示2个染料。白色比例尺为4和10μm。（H） 考马斯亮蓝染色15%PAGE-SDS凝胶，由重组纯化单体eGFP和H1.4衍生融合蛋白组成。（一） 考马斯亮蓝染色15%PAGE-SDS凝胶，由重组纯化组蛋白H1.4衍生蛋白制成。（J） 用0.1%Alexa Fluor 488（AF488）或0.1%Alexa Fluor594（AF594）标记的组蛋白H1结合和未结合染色质滴的相对平均荧光强度的条形图表示。
4
图S4。10n+5阵列对每个碱基的核小体频率和染色质浓缩的LOESS标准化，与
（A）在碱基对分辨率下酿酒酵母基因组染色质的核小体间连接子长度(Brogaard等人，2012年)(左边)核小体密度及其LOESS光滑包络的信号差异显示出对10n+5间距连接子长度的强烈偏向(正确的). （B） 添加150 mM KOAc（含或不含1 mM MgOAc）后，具有10n或10n+5核小体间连接子长度的染色质滴的荧光显微镜图像。（C） B中下部面板染色质滴（n=6）的平均荧光强度定量。（D）带有较短和较长10n+5核小体间连接体长度的染色质滴的显微镜图像，添加或不添加连接体组蛋白H1。白色比例尺为10μm。
5
图S5。核小体阵列微量注射的定量，与
（A）用非修饰核小体阵列微量注射Ki67-eGFP细胞（A组）。半透明遮罩表示线轮廓测量区域。标尺：5μm（概述），2μm（插图）（B）如面板A插图所示，线轮廓的量化。位置相对于DNA（Hoechst）峰值。细胞数n=21，每个细胞核一个细胞系，2个生物复制。（C） 在不使用/使用毛霉素A治疗的情况下，对指示的乙酰化组蛋白进行免疫荧光。标尺5μm。（D） 组蛋白乙酰化水平的定量显示在面板C中。数据来自2个独立的生物复制品，细胞数量为25个细胞，每个条件来自2个生物复制品。（E） 将未修饰核小体阵列的Spearman r定量到TSA处理的细胞中（与主图形面板C上排一起）（F）将乙酰化核小体数组的Spearmanr定量到TS处理的细胞（与主图像面板C下排一起）。
6
图S6。乙酰化染色质和多溴主要蛋白形成的液滴，与
（A）考马斯亮蓝染色的10%PAGE-SDS凝胶，由重组纯化的合成溴代多巴胺蛋白质组成。（B） 重组纯化BRD4的考马斯亮蓝染色10%PAGE-SDS凝胶。乙酰赖氨酸修饰染色质和（C）溴5和（D）BRD4的时间分辨显微镜。针对每种情况分别处理显微图像，并校正BRD4荧光以进行光漂白。（E） 溴5和BRD4结合染色质液滴光漂白后荧光恢复的荧光显微镜。（F） 在AF488标记的染色质乙酰化后，在未乙酰化AF594标记的染色素存在下，对溴5和BRD4结合的染色质滴进行荧光显微镜定量。
7
图S7。调控染色质相分离及其在染色质亚型上分布的小平面，与
——.LOESS-正常化核小体间连接子长度偏差(左边)组蛋白H1占有率的方框图表示(中间的)组蛋白乙酰化(正确的)全基因组和at染色质亚型（分别以灰色和彩色显示）揭示了调节染色质LLPS的细胞因子的差异调节。
8
电影S1。双色液滴融合成像，与
在分离相分离后，将标记有绿色Alexa Fluor 488（AF488）或洋红Alexa Fluor 594（AF594）的染色质混合在显微镜孔中，并使用旋转圆盘共焦显微镜每隔15秒采集显微镜图像。
9
电影S2。组蛋白乙酰化依赖于染色质滴的溶解，与
在GFP-TrR-p300的同相结合之后帽子（绿色）至AF594标记的染色质液滴（品红色），由12×601组成子序列-将含有核糖体阵列的乙酰辅酶A添加到显微镜孔中的第1帧和第2帧之间，并通过扩散以400μM的最终浓度混合。使用旋转圆盘共焦显微镜每15秒采集一次显微镜图像。
