野生型和帕金森病相关突变体α-突触核蛋白在人和转基因小鼠脑中的亚细胞定位

摘要

突触核蛋白（SYN）是主要在大脑中表达的～14kDa磷酸蛋白。synuclein家族成员包括αSYN、βSYN、γSYN(拉维丹，1998年)和滑膜炎(Surguchov等人，1999年)。αSYN的中心结构域最初被确定为阿尔茨海默病斑块的非淀粉样β蛋白成分（NAC）(尤达等人，1993年)。随后在帕金森氏病（PD）和痴呆伴LBs患者的路易体（LBs）、苍白体和路易神经节以及多系统萎缩的细胞质内含物中发现了全长αSYN(Spialantini等人，1997年;Arima等人，1998年;Baba等人，1998年;Spialantini等人，1998年;武田等人，1998年a;Tu等人，1998年;Wakabayashi等人，1998年;Culvenor等人，1999年)。LBs在阿尔茨海默病、家族性阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的LB变体中呈αSYN阳性(Lippa等人，1998年,1999;武田等人，1998年b)以及1型脑铁蓄积性神经变性（以前称为Hallervorden–Spatz病）(Arawaka等人，1998年;Wakabayashi等人，1999年).

αSYN基因中的两个错义突变与家族性PD有关(Polymeropoulos等人，1997年;Krüger等人，1998年)。这两种突变都加速了αSYN的固有特性，使其自聚集成与LBs分离的纤维形态相似的纤维(Conway等人，1998年;Giasson等人，1999年;Narhi等人，1999年)。因此，与大多数与其他家族性神经退行性疾病相关的突变相似，αSYN突变导致淀粉样变的异常生成，淀粉样变沉积在疾病特异性病变中(哈代和格温·哈代，1998年;兰斯伯里，1999;Selkoe，1999年).

突触核蛋白的生理功能尚不清楚。小鼠αSYN基因的靶向性破坏导致多巴胺能神经递质的微小扰动(Abeliovich等人，2000年)。αSYN结合蛋白的鉴定表明了其在信号转导中的潜在作用，可能与轴突运输有关(Jenco等人，1998年;Engelender等人，1999年;Jensen等人，1999年;Ostrerova等人，1999年)。αSYN和βSYN都被磷酸化，这可能表明信号转导事件的另一个联系(Nakajo等人，1993年;Okochi等人，2000年).

先前的免疫组化研究表明，αSYN和βSYN在突触前终末富集，亚细胞分馏研究表明αSYN与βSYN可能存在突触体定位(Maroteaux和Scheller，1991年;Shibayama-Imazu等人，1993年;Jakes等人，1994年;George等人，1995年;Iwai等人，1995年;Irizarry等人，1996年)。在这里，我们直接比较了野生型和PD-相关突变体[A30P]αSYN与βSYN的细胞表达。整合膜蛋白突触素被用作突触小泡的标记物。我们的直接比较研究表明，αSYN和βSYN在人和小鼠大脑中广泛的突触共定位。在表达人类突变体[A30P]αSYN的转基因小鼠的大脑中，发现与βSYN的突触共定位，表明该突变不会干扰αSYN向突触的顺行运输。然而，除了突触前定位外，转基因野生型和突变型[A30P]αSYN都异常积聚在整个大脑的神经元细胞体和神经突起中。因此，转基因αSYN并没有不能被转运到突触，但过度表达明显导致了神经元的病理性积聚。

材料和方法

抗体。合成的βSYN（87–101）肽EEFPTDLKPEEVAQE通过N端半胱氨酸残基与锁孔帽贝血蓝蛋白偶联，以及锁孔帽蝶血蓝蛋白耦联的αSYN（125–140）肽YEMPSEEGYQDYEPEA和小鼠αSYN的（116–131）肽MPVDPGSEAYEMPSEE被用于免疫兔子（比利时Seraing的Eurogentec）。产生的抗βSYN（6485）、αSYN（64 82）和小鼠αSYN的抗血清以1:300的工作稀释度用于Western探针。与Connex（德国慕尼黑）合作生产了鼠抗人αSYN（116–131）肽MPVDPDNEAYEMPSEE单克隆抗体（Mc）15G7。合成肽，使用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺直接偶联到锁孔帽贝血蓝蛋白，并用于免疫大鼠（Lou/c）。杂交瘤上清液在Western印迹上以1:5稀释并未稀释用于免疫组织化学。小鼠Mc42对抗大鼠αSYN（15–123）（IgG₁工作稀释度1:3000）从Transduction Laboratories（肯塔基州列克星敦）购买，抗人αSYN（117–131）肽的兔多克隆IgG 3400（工作稀释度1:2000）来自Affiniti（英国马姆黑德）。Mc SY38杂交瘤上清液（工作稀释液1:200）由W.W.Franke和R.E.Leube（德国海德堡Deutsches Krebsforschungszentrum）提供。辣根过氧化物酶结合二级抗体（工作稀释度1:5000）购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。

抗体特征。纯化重组人突触核蛋白大肠杆菌由P.H.Jensen（美国大学Å胡斯，Århus，丹麦）。从人脑中纯化的αSYN和βSYN(Baba等人，1998年)由T.Iwatsubo（日本东京大学）提供。对两微克纯化的突触核蛋白进行SDS-PAGE（15%聚丙烯酰胺），并将其电印在聚偏氟乙烯膜上（0.45μImmobilon-P；Millipore，Bedford，MA）。用5%脱脂牛奶阻断蛋白质印迹，并用上述抗体进行检测，如图所示。除非另有说明并在X-Omat胶片上显示，否则使用SuperSignal（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）产生化学发光。

热稳定的细胞溶质部分是从人类（颞叶皮层、癫痫脑叶切开样本；德国哥廷根大学）和整个小鼠大脑中制备的，如下所示。将脑组织均质成4-5 vol的均质缓冲液[9%蔗糖，5 m米二硫苏糖醇，2 m米EDTA，25米米Tris，pH 7.0，加上Cömplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒（德国曼海姆Boehringer Mannheim），八次波特冲程，并按前述方法处理(Jensen等人，1998年)。蛋白质浓度在100000×克上清液用微孔板蛋白分析法测定（Bio-Rad，Hercules，CA）。对于每个样品，100μg细胞溶质脑蛋白在煮沸10分钟后冻干，并将变性蛋白颗粒去除16000×克离心。如上所述，对样品进行蛋白质印迹处理。

亚细胞分馏和蔗糖梯度浮选分析。对C57BL/6小鼠进行乙醚麻醉，斩首处死，并对其全脑进行解剖。癫痫患者的脑叶切开术后可以获得人类颞叶皮质灰质，手术后可以冷藏。在4-5 vol均质缓冲液中通过八次Dounce冲程均质脑组织，并制备核后部分(Jensen等人，1998年)。如前所述，对突触小室进行亚细胞分离和富集(Huttner等人，1983年;George等人，1995年)。用三氯乙酸沉淀膜小球中的蛋白质和稀溶性突触体内容物（LP2）。收集的降水量为16000×克离心，用70%丙酮洗涤，中和，并在Lämmli的缓冲液中再溶解。样品通过12.5%SDS-PAGE进行解析，并在相应的Western blot中依次探测SYNs和突触素。必要时，用增强化学发光ECLplus（Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK）检测弱信号。

蔗糖梯度浮选分析(Jensen等人，1998年)用野生型、转基因小鼠和人脑制备的材料进行实验。简单地说，将样品添加到55%的蔗糖中，并覆盖线性蔗糖梯度（20-48或30-48%）。平衡离心后，从顶部收集1 ml组分（20–48%蔗糖梯度中的1–4组分除外，1.5 ml）。丢弃（可溶性）富含蛋白质的底部馏分。按照上述方法处理每个梯度组分的整个三氯乙酸沉淀，用12.5%SDS-PAGE或4–20%Tris–tricine-PAGE（Novex）进行分离，并用Western探针进行检测。

免疫组织化学。新鲜小鼠大脑和尸检衍生的人类小脑和颞叶皮层固定在磷酸盐缓冲的4%多聚甲醛中，并嵌入石蜡中。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶技术和荧光标记均用于αSYN、βSYN和突触素的免疫细胞化学检测。在二甲苯中对切片（4-μm厚）进行脱蜡，并使用下降的乙醇系列进行再水化。为了增强αSYN的免疫反应性，切片在0.01米柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0，在微波炉中五次，持续3分钟。在PBS中用2%牛血清白蛋白和0.01%（v/v）Triton X-100培养30分钟，以阻止非特异性结合。在室温下用一级抗体孵育1.5小时。根据制造商（英国海威科姆Dako）的说明，使用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶系统检测抗体结合，使用Neufuchsin作为显色剂。

用两种不同的荧光结合二级抗体对βSYN与αSYN或突触素进行双重免疫标记。与第一抗βSYN的一级抗体孵育1.5小时后，将切片与四甲基罗丹明异硫氰酸盐结合的山羊抗兔IgG孵育30分钟。然后再孵育第二级一级抗体（抗αSYN或抗突触素）添加1.5小时，并分别使用荧光素结合的山羊抗鼠抗体和山羊抗鼠IgG进行检测。用兔IgG预先吸收这两种抗体，以尽量减少与第一种一级抗体的交叉反应。用苏丹黑B染色切片，阻断自体荧光(Romijn等人，1999年)。切片用Leica（德国Nussloch）TCS-NT共焦激光扫描显微镜进行分析。

转基因小鼠的产生。从20 ng人脑cDNA（加利福尼亚州帕洛阿尔托市Clontech）中通过PCR扩增出野生型人类αSYN cDNA（396 bp），并克隆到pMOSBlue（Amersham Pharmacia Biotech）中，通过测序确认其同源性。用Nde公司我和Sma公司一、 被克莱诺反应钝化，并插入钝化Xho公司pTSC21k的I站点。编码人类[A30P]αSYN的序列(Okochi等人，2000年)通过PCR扩增并亚克隆到Xho公司pTSC21k的I站点。Thy-1磁带包含一个改进的生态小鼠Thy-1.2糖蛋白基因的RI片段(维达尔等人，1990年;Moechars等人，1996年;Lüthi等人，1997年)。A线性不是分离包含没有质粒载体序列的转基因的I DNA片段，并根据标准技术以2ng/ml的浓度注射到受精卵中(Hogan等人，1995年)。使用位于αSYN插入物两侧的Thy-1序列特异性引物，通过PCR鉴定创建者小鼠，得到1 kb转基因特异性扩增子。后代回交到C57BL/6小鼠株。

RNA分离和Northern印迹分析。在出生后2、5、10、16和20天从小鼠的全脑中分离出RNA。按照制造商的建议，用0.9 ml RNAzol–0.1 ml氯仿的小球在FP120（Bio 101）中均质器官。聚乙烯（A⁺)从50μg总RNA（mRNA分离试剂盒；Roche Molecular Biochemicals）中选择的RNA在0.7%甲醛-琼脂糖凝胶上分离。RNA被印在Hybond上⁺膜（Amersham Pharmacia Biotech）并与人类αSYN转基因RNA特异的单链寡核苷酸探针杂交（人αSYN开放阅读框的反义核苷酸260-320，5′-CTCCTCTTATTCTTGCCACACTCT-TTTGACAAGCAGCTGCTGCTGCAATGC-3′）；和人αSYN开放阅读框的反义核苷酸1-30加上上游载体的核苷酸−1至−32，5′-CTTGAAAGTCCTTCATGAATACATCCATCGAGTGCCAAGAGTTCCGACTTGGATTCT-3′）和小鼠β-肌动蛋白（5′-CCGGAGGAAGGATGGCAGTGGCCATCCT-GCCGAAGTCTAGAGCAACATGC-3′）。探针通过末端脱氧核苷酸转移酶与α的反应进行标记-[³²P] dATP（6000 Ci/mmol；Amersham Pharmacia Biotech）。杂交是在65°C的快速杂交缓冲液（Amersham Pharmacia Biotech）中进行的。在室温下在2×SSPE（+0.1%SDS）中洗涤印迹15分钟，然后在65°C下第二次洗涤15分钟，并在65°C.下在1×和0.5×SSPE中再洗涤两次。将膜暴露于Biomax MR（伊士曼柯达）胶片。

结果

αSYN和βSYN的选择性检测

氨基酸87–101位于靠近NAC结构域的C末端，在迄今为止报道的所有哺乳动物βSYN序列中都是绝对保守的(拉维丹，1998年)。为了产生不与突触核蛋白家族其他成员发生交叉反应的βSYN特异性抗体，用βSYN肽87–101免疫兔子，产生抗血清6485。抗体6485与纯化的以及重组的βSYN在Western blots上发生强烈反应（图。​（图11A类,B类)。人和小鼠大脑βSYN均被识别（图。​（图11C类)。用1 mg/ml免疫肽预吸收抗血清6485，完全消除了Western blots上的免疫反应性（结果未显示）。抗血清6485与αSYN和γSYN无交叉反应（图。​（图11A类,B类)。此外，αSYN特异性抗体Mc42（转导实验室）未检测到抗βSYN 6485免疫沉淀物，反之亦然（数据未显示）。因此，抗血清6485可用于特异性鉴定人和小鼠组织中的βSYN。

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图1。

选择性检测αSYN和βSYN。A类用6485抗血清对5μg纯化人脑αSYN和βSYN制备的Western blot进行检测(左边)然后剥离并重新接种抗血清6482(正确的)。抗血清6485特异性识别βSYN，而针对αSYN C端的抗血清6482对βSYN具有一定的交叉反应性。预处理分子量标记的位置指示给左边每个污点。B类，Western blot由5μg制备(顶部2个面板)或2μg(底部3块面板)纯化的重组人αSYN、βSYN和γSYN。C类、小鼠耐热上清液(亩)或人类(嗡嗡声)将脑细胞液（100μg）冻干并进行15%SDS-PAGE。用特定于正确的。

因为我们试图比较转基因小鼠中过度表达的人[A30P]αSYN与内源性αSYN和βSYN的细胞分布，所以我们寻找能够唯一鉴定人αSYN的抗体。在人和小鼠αSYN的C末端附近存在双氨基酸取代。在人类序列中，氨基酸121-122是天冬氨酸-甘氨酸，而在小鼠中，相应的氨基酸是甘氨酸-丝氨酸。针对包含该区域的肽（人类αSYN残基116–131）产生的Mc15G7确实对人类αSYN具有特异性（图。​（图11C类)。同样，兔多克隆抗血清3400（亲和力）对人类αSYN具有特异性（图。​（图11C类)。其他人类特异性αSYN抗体也能识别相同的区域(Jakes等人，1994年,1999)。抗体15G7和3400对βSYN和γSYN没有交叉反应（图。​（图11B类)。因此，抗体15G7和3400被用于在转基因小鼠中特异性检测转基因人[A30P]αSYN（见下文）。另一方面，我们制备了针对由小鼠αSYN的116–131氨基酸组成的肽的抗血清7544，该肽可特异性识别啮齿动物蛋白（图。​（图11C类)，对βSYN和γSYN无交叉反应，如免疫沉淀-印迹实验所确定（数据未显示）。最后，Mc42识别了小鼠和人类αSYN（图。​（图11C类).

突触体组分中αSYN和βSYN的检测

蔗糖梯度漂浮试验最近被用于描述大鼠脑内αSYN的突触囊泡关联(Jensen等人，1998年)。平衡离心小鼠大脑的核后部分后，在最高密度部分8中发现βSYN，并且也漂浮到较低密度部分6中（图。​（图22A类)。观察到αSYN的曲线非常相似（图。​（图22A类)。我们还分析了突触囊泡标记物突触素的分布(维登曼和弗兰克，1985年)。联会藻素仅在浮动组分中鉴定出来（图。​（图22A类)。对于新鲜小鼠大脑，脑叶切除术后癫痫患者快速处理的人类颞叶皮层中的αSYN出现在最高密度分数13以及浮动的低密度分数中（图。​（图22B类)。同样，突触素在最高密度组分中未被发现，而是在低密度组分被涂抹（图。​（图22B类).

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图2。

脑内同核蛋白的亚细胞定位。直接用200μl小鼠核后上清液进行蔗糖梯度（20–48%）浮选试验(A类)16000×克离心(C类)。用SDS-PAGE（12.5%）分离组分，并用Western blot连续检测αSYN(顶部面板)，βSYN(中间面板)和突触素(底部面板)。另外两个实验显示了相同的结果。B类采用脑叶切除术后癫痫患者快速处理的颞皮质灰质的核后上清液进行蔗糖梯度（30–48%）漂浮试验。对级分进行Tris–tricine PAGE（4–20%梯度），并用Mc42抗αSYN依次探测蛋白质印迹(顶部面板)和抗突触素(底部面板)。ECL用作化学发光底物。另一名患者的组织也显示出同样的结果。D类，亚细胞分离步骤示意图。一只小鼠大脑的核后上清液(电子)（代表3个独立实验）或癫痫患者的颞叶皮层灰质活检(F类)被亚细胞分离。用50μg（只有25μg的突触体颗粒P2可用）进行SDS-PAGE（12.5%）(电子)或20μg（只有10μg的突触囊泡颗粒LP2可用）(F类)每个分数。相应的蛋白质印迹依次探测αSYN(顶部面板; Mc42英寸电子，15G7英寸F类)，βSYN(中间面板)和突触素(底部面板)。ECLplus用作化学发光底物F类。

当用16000×克小鼠大脑核后部分的上清液，αSYN和βSYN均从浮动部分中耗尽，且仅存在于最高密度部分中（图。​（图22C类)。然而，突触素在16000×克上清液，如1000×克上清液。突触素阳性漂浮物在16000×克上清液可能代表游离的突触小泡。突触体在16000×克(Huttner等人，1983年)。因此，1000×克上清液可能代表突触体，因为在16000×离心时信号丢失克。

为了进一步证明这种可能性，系统亚细胞分离(Huttner等人，1983年)（图。​（图22D类)用小鼠大脑进行（图。​（图22电子)。在细胞核后（1000×克)上清液（S1）和12500×克上清液（S2）。随后对S2部分进行100000×克离心。在此步骤后，在上清液（S3，细胞溶质部分）中检测到αSYN。在12500×克颗粒（P2）。这个粗糙的突触体部分被清洗，低渗溶解，清除25000×克离心，并经受100000×克离心。离心后，在上清液中发现αSYN（LS2，突触体的可溶性含量）。用抗血清6485对同一膜进行重组，发现βSYN的亚细胞分布相似。在人类癫痫控制脑中发现了相同的αSYN亚细胞分布（图。​（图22F类)。在100000×克颗粒（P3和LP2），并且在突触体制剂（LP2）中特别富集。

正常脑内αSYN和βSYN的克隆化

我们的直接比较生化实验表明，在相同的亚细胞组分中可重复发现αSYN和βSYN。为了证实αSYN和βSYN的共定位，我们在人脑颞叶和小脑皮质切片上进行了免疫组织化学实验。颞叶皮层的免疫染色显示，所有皮层层都有强烈的突触神经纤维染色（数据未显示）。在小脑中，分子层、类似小脑肾小球的颗粒细胞层的离散区域以及浦肯野细胞体周围可见强烈染色（图。​（图3三A类,B类)。神经元和胶质细胞的细胞质以及白质均为免疫阴性。染色模式与抗突触素抗体的染色模式相似（图。​（图3三C类)。人类和小鼠大脑中没有不同的染色模式。

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图3。

人小脑中αSYN和βSYN的克隆化。抗体15G7抗αSYN(A类)，6485抗βSYN(B类)和抗突触素(C类)在分子层上都染上了点状图案。颗粒细胞层的免疫反应呈斑块状分布，与小脑肾小球的标记相对应。比例尺：A–C，100微米。双标记免疫荧光共聚焦显微镜显示αSYN的共定位(D类)和βSYN(电子)颗粒细胞层的小脑肾小球导致黄色的叠加数字图像中的信号(F类)。突触素也有类似的共定位作用(G公司)和βSYN(H（H）).我，叠加数字图像。比例尺：D–I型，10微米。

为了确定βSYN与αSYN以及突触素的共定位，采用双标记免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜。βSYN阳性结构与小脑肾小球中富集的αSYN和突触素阳性突触结构明显重叠（图。​（图3三D–I型)。同样，在分子层中观察到几乎完全重叠（结果未显示）。

[A30P]αSYN在转基因小鼠中的表达

αSYN基因A30P突变杂合患者发展为侵袭性早发型PD(Krüger等人，1998年)。研究体内[A30P]αSYN在转基因小鼠大脑中表达的结果被生成。将含有A30P错义突变的人类αSYN cDNA编码区的构建物微量注射到卵酶中（图。​（图44A类)。该结构中[A30P]αSYN的表达由脑神经元特异性Thy-1启动子驱动(Kollias等人，1987年)。转基因后代回交到C57BL/6小鼠株。

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图4。

[A30P]αSYN在转基因小鼠脑中的表达。A类，转基因结构示意图（未按比例绘制）。带阴影的盒子，mThy-1.2启动子区。打开箱子Thy-1外显子序列；（截短的）外显子IV包含多聚腺苷酸化信号。实线，Thy-1内含子A.人[A30P]αSYN开放阅读框的启动和终止密码子(填充的框；*，A30P突变位点）直接位于Xho公司I限制站点(X（X）).虚线Thy-1基因的3′-区。N个,不是I限制位点用于在微注射之前线性化构建和删除矢量序列。B类将两种人类αSYN转基因特异探针和一种小鼠β-actin基因探针的混合物杂交到poly（A⁺)如图所示，来自[A30P]αSYN小鼠的RNA。转录本的大小分别为～1.8 kb和2.1 kb。C–E对6~10周龄[A30P]αSYN小鼠系个体的全脑细胞液（200μg）的冻干热稳定上清液进行15%的SDS-PAGE。转移后凝胶的亮蓝染色证明负载量相等。用小鼠特异性抗血清7544连续检测蛋白质印迹(C类)、Mc42(D类)和人类特异性抗体3400(电子)。通过密度扫描量化色带(底部面板)。每个品系至少有三只动物的[A30P]αSYN蛋白表达筛选数据具有代表性。αSYN-免疫活性双谱带(星号)在可变强度下观察到与29kDa标准相一致的位置，该位置与二聚体的分子质量一致。这些假定的二聚体物种可以在大凝胶中很好地分解（P10DS；猫头鹰分离系统，朴茨茅斯，NH）(F类)。来自10个月大的18号系小鼠的全脑细胞液（600μg）直接接受15%的SDS-PAGE，无需任何浓缩步骤。用3400抗体进行Western blot检测。

Northern和Western blot分析显示，转基因人[A30P]αSYN mRNA和蛋白分别在整个大脑中有较强的表达（图。​（图4）。4)。雄性和雌性突触核蛋白的表达和定位没有差异（数据未显示）。与品系8、9和14相比，品系18和31持续表达较高水平的转基因蛋白（约2–4倍）。从Mc42探针的Western blot判断，Mc42同样能检测到人类和小鼠αSYN（见图。​图11C类)，转基因在第18和31行中的过度表达估计大约是内源性αSYN水平的两倍。偶尔观察到少量抗αSYN的高分子量物种免疫反应（图。​（图44电子,F类)。该双带的运动性与αSYN二聚体的运动性一致。[A30P]αSYN表达在出生后的第一个月上调，并在老年时保持较高水平（数据未显示）。在野生型和转基因小鼠中，这种表达时间过程与内源性αSYN的表达时间过程大致相似（数据未显示）。

[A30P]αSYN在转基因小鼠中的突触体定位

突变型[A30P]αSYN先前被证明与在体外化验(Jensen等人，1998年)。因此，[A30P]αSYN的轴突转运不足。为了证明这种可能性体内，对表达[A30P]αSYN的小鼠的全脑匀浆进行蔗糖梯度浮选测定。用人特异性抗体3400进行免疫印迹显示，[A30P]αSYN在最高密度分数9和含有突触素的浮动分数中（图。​（图5）。5)。在同一动物中，Mc42显示出非常相似的分布，它检测到内源性小鼠αSYN和转基因人类[A30P]αSYN。高表达系18和31以及低表达系8、9和14在蔗糖梯度中表现出相同的[A30P]αSYN分布（图。​（图5，5因此排除了高表达水平可能克服囊泡结合活性部分丧失的可能性。这些结果表明[A30P]αSYN是顺行运输到突触的体内（另请参见下文）。

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图5。

[A30P]αSYN在转基因小鼠脑中的突触体定位。如图所示，处理来自4个月龄雄性18系小鼠的核后上清液​图22A类.用抗血清3400连续检测Western blot(顶部面板)、Mc42(中间面板)和抗突触素(底部面板).

[A30P]αSYN在转基因小鼠脑神经元胞体和突起中的异常积累

使用人特异性抗体15G7进行免疫组织化学，以可视化转基因小鼠脑切片中αSYN的亚细胞定位（图。​（图66A–C)。以表达类似水平人类野生型αSYN的转基因小鼠作为对照。[A30P]αSYN和野生型αSYN的正常神经肽和突触前染色在整个大脑中都很明显，这支持了我们的结论，即两种形式的αSYN都是顺行运输的。除了正常的突触前定位外，人类转基因特异性抗体15G7在神经元细胞体中显示出强烈的弥漫性胞浆免疫染色（图。​（图66B类,C类)。相反，在小鼠特异性抗血清7544的染色体隔室中未观察到内源性αSYN（图。​（图66电子,F类)。此外，经常观察到异常的αSYN阳性轴突（图。​（图7）。7)。受影响的神经突含有弥漫性αSYN免疫反应，有时在几微米的范围内膨胀成单个或多个静脉曲张（图。​（图77A类,B类,F类,G公司)。形态相似的αSYN阳性肿胀神经突是LB疾病的特征性特征（图。​（图77H（H）)。在突变型和野生型转基因小鼠中，偶尔可以看到αSYN阳性突起来自积聚了αSYN的神经元细胞体（图。​（图77A类,B类)。在包括小脑浦肯野细胞（图。​（图66B类,C类)和齿状核（图。​（图77E–G公司)黑质和纹状体、海马、新皮质和脑干。[A30P]αSYN在所有五个转基因小鼠系中的体细胞和神经炎积累相似，在半岁和1岁的动物中观察到。相反，针对内源性小鼠αSYN的抗体的染色模式（图。​（图7D），7D） ，βSYN（图。​（图77C类)和突触素（结果未显示）在非转基因和αSYN转基因小鼠之间没有差异。因此，在表达人αSYN的小鼠中，突触囊泡蛋白的运输通常不受干扰。相反，神经细胞体和轴突中的病理性积聚仅限于转基因人αSYN。

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图6。

转基因和内源性αSYN在小脑切片中的分布。人特异性抗体15G7与非转基因小鼠小脑切片无反应(A类)但在[wt]αSYN小鼠中显示出分子层的强烈标记(B类)和31行[A30P]αSYN(C类)老鼠。此外，在两种转基因小鼠的Purkinje细胞中均观察到弥漫性胞浆免疫反应。小鼠特异性抗血清7544在人类小脑切片中没有显示特异性信号(D类)。在[wt]αSYN小鼠中观察到内源性αSYN的正常突触染色模式，标记分子层和小脑肾小球(电子)和第31行[A30P]αSYN小鼠(F类)。注意，在转基因小鼠中未观察到抗血清7544的细胞溶质染色。

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图7。

人类αSYN在转基因小鼠脑神经元细胞体和神经突中的积累。人[A30P]αSYN在包括额叶皮层在内的大多数脑区的细胞体和球状突起中异常积聚[A类（第31行）和B类（第18行），15G7]。一些[A30P]αSYN填充的神经突起(箭头)由神经元细胞体产生，累积[A30P]αSYN(A类,B类)。相反，βSYN的表达(C类，抗血清6485）和内源性αSYN(D类，抗血清7544）仅限于神经膜，在神经元细胞体和积聚[A30P]αSYN的神经突中未发现。病理性球状αSYN阳性神经炎(箭头)也可以在[wt]的齿状核中观察到(电子)和[A30P][第31行(F类)和第18行(G公司);箭头]小鼠（15G7染色）。H（H）路易神经节(箭头)LB痴呆患者海马CA2/3区15G7染色。

讨论

利用对突触核蛋白家族选定成员特异的抗体，我们证明了αSYN和βSYN在小鼠和人脑中的突触共定位。在生化方面，αSYN和βSYN都存在于相同的亚细胞隔室中，即胞浆和突触体。这两种突触核蛋白都存在于整个大脑中，最显著的是小脑富含突触的分子层（图。​（图6），6)，新皮质（图。​（图7），7)海马体和视网膜（数据未显示）。双标记共聚焦显微镜显示αSYN和βSYN广泛共定位。因此，大多数突触素阳性突触前终末（如果不是全部的话）都含有αSYN和βSYN，至少在人类小脑皮层是如此。由于在（Thy-1）-h[wt]αSYN和（Thy-1）-h[A30P]αSYN小鼠中观察到相同的突触前染色，因此PD-相关的A30P突变并没有消除转基因小鼠大脑中突触室的顺行运输。然而，转基因αSYN在神经元细胞体和轴突中的积累可能表明其轴突运输受到了一些干扰。

在最近描述的蔗糖梯度漂浮试验中，低密度部分的αSYN免疫反应被解释为αSYN与突触小泡的相互作用(Jensen等人，1998年)。然而，离心力相对较低（16000×克)从浮馏分中耗尽的同核蛋白（图。​（图22C类)。以这种力离心足以使突触体形成颗粒(Huttner等人，1983年)。小鼠脑亚细胞分离后，突触体颗粒P2中确实存在αSYN和βSYN。溶出突触体颗粒后，从100000×克上清液LS2。相反，突触素从100000×克含有突触小泡的颗粒LP2(Huttner等人，1983年)。此外，在100000×克颗粒P3（图。​（图22D类)以及16000×克上清液（图。​（图22C类)。因此，如果突触核蛋白与突触小泡结合，如初级神经元培养的点状免疫染色所示(Shibayama-Imazu等人，1993年;威瑟斯等人，1997年)并通过在体外αSYN与合成膜的相互作用及粗囊泡的制备(Davidson等人，1998年;Jensen等人，1998年)，相互作用似乎是可逆的。漂浮试验过程中的稀释和突触体的低渗溶解可能会使假定的突触核蛋白-突触囊泡复合体分离。这两种方法分别在蔗糖梯度和水中进行至少10倍的稀释。相反，插入跨膜蛋白突触素(维登曼和弗兰克，1985年)突触小泡对这些过程具有抵抗力。脑核后部分的浮动部分中存在的αSYN和βSYN可能来自突触体中的突触小泡。与这种解释一致的是突触体相关蛋白SNAP-25的鉴定，它是突触前膜标记物(Söllner等人，1993年)，在αSYN阳性浮动分数中(Jensen等人，1998年)。在之前对大鼠大脑的研究中，LS2中也发现了突触体突触核蛋白(Maroteaux和Scheller，1991年;Shibayama-Imazu等人，1993年;George等人，1995年).Irizarry等人（1996年）然而，据报道，αSYN在从死后人类颞叶皮层制备的突触体上清液（LS2）和颗粒（LP2）中分布均匀。方法学（新鲜大脑与死后大脑）的差异可能是这一发现的原因。

以前已经用抗αSYN和βSYN抗体检测到小脑分子层的免疫反应性（绕过Purkinje细胞），以及大鼠和金丝雀颗粒细胞层小脑肾小球的特别强染色(Shibayama-Imazu等人，1993年;Jakes等人，1994年;George等人，1995年;Iwai等人，1995年)。这些蛋白质在小鼠大脑中的分布相似。双染色共聚焦显微镜显示αSYN、βSYN和突触素几乎完全重叠。我们无法识别αSYN或βSYN特异性突触。αSYN和βSYN的广泛共定位表明它们在空间上很接近，因此处于功能冗余的位置。

有人认为[A30P]αSYN沿轴突的转运效率较低(Jensen等人，1998年,1999)。然而，我们在转基因小鼠脑中观察到野生型和[A30P]αSYN的正常突触体定位和突触前分布。因此，αSYN的顺行运输体内未被A30P突变严重消除。同样，转染野生型和突变型αSYN的原代神经元在亚细胞靶向性方面也没有发现差异(McLean等人，2000年).

然而，在表达野生型和[A30P]αSYN的转基因小鼠中观察到，αSYN在神经元细胞体和轴突中的积累表明轴突运输受到干扰。内源性小鼠αSYN未保留在病理细胞体和神经炎中。此外，在[A30P]αSYN阳性图谱中未发现βSYN或突触素。因此，染色体和神经炎堆积是转基因人αSYN的一个特殊特征，而不仅仅是由于运输突触囊泡蛋白的机械过载。

在接受慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）方案的小鼠体内发现αSYN蓄积，导致多巴胺能神经元凋亡死亡，而急性MPTP毒性对αSYN表达没有影响(Vila等人，2000年)。在大鼠和狒狒多巴胺能神经元凋亡模型中也有类似的发现(Kholodilov等人，1999年;Kowall等人，2000年)。我们在[A30P]αSYN小鼠中未检测到任何凋亡情况。因此，观察到的染色体（和神经炎）积聚不是凋亡的结果。

在考虑这项工作的同时，人类αSYN（野生型和PD突变型）在转基因中表达黑腹果蝇被证明可以形成7–10 nm的原纤维，这是人类LB的特征(费尼和本德，2000年)。本研究中发现的唯一差异是，与[wt]αSYN果蝇相比，突变型[A30P]αSYN]转基因动物的攀爬行为下降更快。最近，在人类PDGF-β启动子的控制下，出现了一种过度表达人类野生型αSYN的转基因小鼠系(Masliah等人，2000年)。这些动物的细胞质中以及粗面内质网和细胞核中都有αSYN的无定形沉淀。据报道，多巴胺能标记物和运动能力下降。我们的（Thy-1）-h[A30P]αSYN小鼠在1岁之前没有表现出运动障碍。显然，神经元能够应付转基因[A30P]αSYN的负荷，尽管它有形成纤维的倾向在体外(Giasson等人，1999年)。过度表达h[A30P]αSYN的病理累积可能代表病理异常的早期阶段，最终可能导致PD-like表型。脊椎动物大脑中是否需要额外的辅因子来诱导原纤维的形成和LB样沉积物的产生还有待观察。

脚注

参考文献