材料和方法
构造。用于表达p25（pcDNA3-p25）、CDK5（pcDNA3-CDK5）和显性阴性CDK5（pcDNA3-DNK5）的载体由L.H.Tsai博士（马萨诸塞州剑桥市哈佛大学医学院）提供(Tsai等人，1994年). p25和DNK5（CDK5的显性负性形式）cDNA在pEGFP（增强型绿色荧光蛋白）载体（BD Biosciences Clontech，Le Pont de Claix，France）中进行亚克隆，以鉴定转染细胞。pcDNA-3-t-Bid表达载体如前所述(Darios等人，2003年). 哺乳动物表达载体pcDNA3中含有外显子2、3和10（htau40）的人tau全长cDNA由G.V.Johnson博士（阿拉巴马大学，伯明翰）提供(Cho和Johnson，2004年)苏氨酸231被丙氨酸取代的结构，称为T231Aτ。
细胞培养、治疗和转染。按照实验动物护理和使用指南（国家研究委员会，1996年）、欧洲共同体理事会指令86/609/EEC和机构伦理委员会指南。尽一切努力减少使用的动物数量及其痛苦。胚胎第15.5天，从麻醉后断头的怀孕Wistar大鼠（Elevage Janvier，Le Genest St.Isle，法国）中制备中脑的初级培养物。如前所述，解剖了腹侧中脑(Brugg等人，1996年)，机械分离，在N5培养基中，在聚乙烯亚胺（1 mg/ml）涂层的培养孔上镀上，补充5%马血清（HS）和2.5%胎牛血清（FCS），密度为5×104细胞/厘米2培养2d后，FCS含量降至0.5%，以防止星形胶质细胞增殖。所有实验均在第6天开始，此时培养物中含有>98%的有丝分裂后神经元。启动细胞死亡程序，C2-ceramide（25μ米; 将Tebu-Bio，Le Perray en Yvelines，France）添加到含有1%马血清的N5培养基中。为了抑制CDK5的活性，罗斯科汀（10μ米; Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，法国）在C2-陶瓷前30分钟添加。
对于需要转染表达载体的实验，使用嗜铬细胞瘤PC12细胞代替原代培养物。密度为2×10的电池4细胞/厘米2如前所述，在添加2%马血清和100 ng/ml NGF（以色列特拉维夫Alomone实验室）的L15培养基中培养6天，以获得分化(Muriel等人，2000年;Darios等人，2003年). 实验在含有1%HS的L15培养基中进行。根据制造商的说明，用脂质体DMRIE-C（Invitrogen，Cergy Pontoise，法国）转染PC12细胞。分化5天后进行转染，24小时后在这些细胞中进行实验。对照细胞转染相应的空pEGFP或pcDNA3载体。
CDK5活性。在100μl的20 m溶液中制备细胞裂解物米3个-(N个-吗啉基）丙基磺酸（MOPS），pH 7.2，含0.3米氯化钠，1米米氯化镁2，1米米EGTA，0.1米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5%Nonide P-40，1 m米二硫苏糖醇和2%全迷你抑制剂混合物（德国曼海姆罗氏公司）。在4°C（18000×克，30分钟）。将抗CDK5抗体（C8，2μl；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）添加到提取物中，并在4°C孵育1 h后，将10μl蛋白A-Sepharose（Amersham Biosciences，Saclay，France）添加到混合物中。在4°C下额外培养10 h后，从提取物中取出珠子，用50 m水洗两次米三氯化氢，pH 7.5，150 m米NaCl和0.05%吐温-20，用20m冲洗三次米MOPS，pH 7.2，1 m米氯化镁2，1米米EGTA和0.1 m米EDTA公司。然后使用珠结合的CDK5在30°C和20 m孵育30 min以磷酸化CDK5底物组蛋白H1米MOPS，pH 7.2，1 m米氯化镁2，0.1米米[γ-32P] ATP（[γ]的10μCi-32P] dATP）和0.4 mg/ml组蛋白H1。通过添加SDS-PAGE样品缓冲液终止反应，然后煮沸5分钟。蛋白质通过SDS-PACE分离。用磷酸化成像仪（FLA2000；日本东京富士）对磷酸化组蛋白H1进行可视化，并用专用软件进行定量。
免疫细胞化学。细胞在4%多聚甲醛中固定25分钟，并通过标准免疫细胞化学程序进行分析。主要抗体是单克隆抗细胞色素c（c）克隆6H2.B4（1:100；德国汉堡PharMinen）、多克隆抗葡萄糖调节蛋白78（GRP78）（1:400；加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚州Stressgen）和多克隆抗γ-微管蛋白（1:500；由法国巴黎居里研究所M.Bornens博士善意提供）。二级抗体为Alexa Fluor 488-共轭山羊抗鼠IgG（1:600；Interchim，Montluçon，France）和花青素3-共轭山羊抗兔IgG，1:800；Jackson ImmunoResearch，Sohum，UK）。
蛋白质印迹。总细胞提取物通过150 m内的裂解制备米氯化钠，50米米Tris-HCl、0.5%Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸钠、200 n米冈田酸，50 mg/ml氟化钠，2 m米正钒酸盐，25 m米β-磷酸甘油酯（均来自Sigma）和2%完整迷你抑制剂混合物。或者，通过在4°C下20 m内裂解制备无微管提取物米HEPES，pH 7.5，250 m米蔗糖，10米米氯化钾，1.5米米氯化镁2，1米米乙二胺四乙酸，1米米EGTA，1米米DTT，200牛顿米冈田酸，50 mg/ml氟化钠，2 m米正钒酸盐，25 m米β-磷酸甘油酯和2%完全迷你抑制剂混合物。上清液在10万倍离心后回收克在4°C下保持30分钟。
蛋白质通过SDS-PAGE分离，印在硝化纤维素膜上，并与一级抗体孵育。我们使用了以下抗体：针对总Tau蛋白的Tau-5，无论其磷酸化状态如何（1:500：Chemicon，Euromedex，Souffelweyersheim，France），AT8（Tau在S202/T205上磷酸化，1:500；Innogenetics，Gent，Belgium），AT180（Tau在T2311:200上磷酸化；Innogenetics），抗α-微管蛋白克隆DM1A（1:1000；Sigma），或抗p35 C19（1:1000；Santa Cruz Biotechnology）。用与辣根过氧化物酶偶联的适当二级抗体（1:150000；Jackson ImmunoResearch）孵育后，Super Signal化学发光检测试剂盒（Pierce，Rockford，IL）显示免疫反应性。
钙成像。线粒体游离钙水平（[Ca2+]麻省理工学院)用rho-2 AM（5μ米550nm激发，630nm发射；分子探针，尤金，俄勒冈州），一种积聚在线粒体中的带正电罗丹明衍生物。定量方法如前所述(Muriel等人，2000年;Darios等人，2003年). 简单地说，用配有摄像机和图像分析系统的倒置荧光显微镜观察细胞（Compix Hamamatsu，法国巴黎）。用60倍物镜采集图像。在每个培养孔（每个条件三个孔）的六到八个随机选择的区域中，对每个细胞体的整个表面进行荧光定量。计算每个细胞的平均荧光强度，并用相应对照的百分比表示。
内质网游离钙水平（[Ca2+]呃)在含有125m的缓冲液中进行定量米氯化钠，5米米KCl，1米米硫酸镁4，1米米纳2高性能操作4，5.5米米葡萄糖，20米米氯化钠三，2米米
我-谷氨酰胺和20米米HEPES，pH 7.4，mag-fura-2 AM（4μ米340/380nm激发，510nm发射；分子探针），一种适用于检测腔内高[Ca的低亲和力比率探针2+]呃水平(Solovyova等人，2002年). 在340 nm和380 nm处激发的mag-fura-2荧光强度是使用Compix Hamamatsu软件在成对图像上测定的。340/380的比率是离线计算的。然后计算每个细胞的平均比率，并将其表示为相应对照的百分比。
细胞器聚集的量化。ER（用抗GRP78抗体标记）和线粒体（用抗细胞色素标记）的分布c（c）抗体或钙探针rho-2）通过图像分析定量。在配备摄像机和图像分析系统（Compix Hamamatsu）的倒置荧光显微镜上，使用60倍物镜获取非饱和图像。当荧光斑大于10μm时，线粒体或ER被认为是聚集的2细胞质其余部分的相对荧光强度至少比平均荧光强度高30%。在每种条件下（每种条件三个井），对每孔六到八个随机选择的区域中的所有细胞（每孔约200个细胞）进行分析。结果是三个独立实验的平均值。
电子显微镜。细胞用2%多聚甲醛和1%戊二醛固定20min，用2.5%戊二醛后固定30min，再用1%四氧化锇包埋于Epon中。切割超薄切片（50nm），并用乙酸铀酰染色，以在80 kV的Jeol（Peabody，MA）1200EX电子显微镜下进行检查。在相同的细胞水平上分析每种实验条件下的超薄切片。在15000倍放大率下分析随机选择的细胞的整个横截面（每个细胞大约6至8张显微照片）。对每个细胞对应的所有显微照片进行分析，并对出现在多张显微照片上的所有线粒体或内质网进行标记，以避免对同一细胞器进行多次分析。如前所述，为了估计内质网和线粒体之间的平均距离，测量了所有线粒体的线粒体外膜和最近内质网膜之间的最小距离(Pacher等人，2000年)，使用分析软件（德国穆斯特软成像系统）。每种情况下至少分析15个独立细胞，每段分析约50个线粒体。
统计。数据表示为平均值±SEM。通过方差分析进行统计分析。采用Student-Newman-Keuls测试分析各组之间的差异。结果被认为具有统计学意义第页<0.05。实验一式三份，至少重复三次。
结果
激活CDK5对神经酰胺介导的细胞死亡是必要的
为了研究CDK5在钙依赖性神经元死亡中的意义，我们用C2-ceramide（25μ米). 在C2-陶瓷处理的前5分钟内，观察到CDK5活性增加()并被罗斯科汀阻止，罗斯科汀是一种CDK抑制剂，对有丝分裂后神经元中的CDK5具有特异性(Niethammer等人，2000年). CDK5活性的增加不是由于CDK5表达增加()而是将CDK5激活物p35分解为更有效的p25(Patrick等人，1999年)与CDK5活性增加同时发生的(). 在C2陶瓷处理的细胞培养物中观察到，罗斯可汀抑制CDK5可降低神经元死亡水平，表明CDK5在凋亡过程中起作用().
CDK5激活是C2-陶瓷介导的神经元死亡的早期步骤。一个在C2-ceramide治疗的最初几分钟内，在中脑原代培养物中观察到CDK5活性增加，并被CDK抑制剂roscovitine（10μ米; Rosc）。B类，C2神经酰胺处理后CDK5蛋白水平没有变化，但其激活剂p25是通过p35的蛋白水解裂解产生的，其时间过程与CDK5活性的增加相同。C类，roscovitine对CDK5活性的抑制减少了C2神经酰胺诱导的神经元死亡。*第页<0.05，与未使用罗斯科汀组相比差异显著。
CDK5的激活有助于钙从内质网转移到线粒体
为了确定CDK5激活是否与钙从内质网向线粒体的转移有关，我们首先分析了线粒体中的游离钙水平（[Ca2+]麻省理工学院)荧光阳离子铑-2聚集在细胞器基质中。在神经酰胺处理的中脑原代培养物中，[Ca2+]麻省理工学院增加(). 这种增加并不是由于线粒体对阳离子罗德-2的吸收增加，因为线粒体的膜电位随着[Ca2+]麻省理工学院增加（补充图S1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 为了证明[Ca的增加2+]麻省理工学院归因于从内质网转移钙2+]呃是用荧光标记物mag-fura-2测量的，它是这个细胞器特有的（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). [加利福尼亚州2+]呃减少为[Ca2+]麻省理工学院增加()强烈提示，在神经酰胺处理的细胞中，钙从内质网转移到线粒体。[Ca的减少2+]呃以及[Ca的增加2+]麻省理工学院在中脑原代培养物中，CDK5抑制剂罗西维汀显著降低()和DNK5(Tsai等人，1994年)在PC12细胞中(). 这表明，在神经酰胺诱导的细胞死亡过程中，CDK5参与了钙从内质网向线粒体的转移。
CDK5激活后，钙从内质网转移到线粒体。一个,B类，C2-陶瓷诱导[Ca增加2+]麻省理工学院（用铑-2测量），而[Ca2+]呃（用mag-fura-2定量）减少。当罗斯柯夫碱（Rosc）抑制中脑神经元中的CDK5时，这些作用减弱(一个)或通过神经分化PC12细胞中DNK5的表达(B类).*第页<0.05，与不加roscovitine或DNK5相比有显著差异。
rhod-2荧光的强度在对照细胞中较低，并且表现为分布在整个细胞中的小斑点。然而，在神经酰胺处理的细胞中，位于细胞核附近的较大斑块比细胞其他部位的荧光更强烈(). 当线粒体被抗细胞色素抗体标记时，也获得了类似的图像c（c）()这表明这种模式与线粒体的细胞内分布有关，而不是与细胞器亚群对钙的选择性吸收有关。神经酰胺处理引起的rhd-2荧光的区域分布依赖于CDK5，因为它被罗斯柯夫碱抑制()和DNK5(). 因此，CDK5在[Ca2+]麻省理工学院及其本地化。这就提出了一个问题，即CDK5在钙从内质网向线粒体的转移中的作用是直接的还是次要的，是内质网和线粒体在细胞中的再分配。
C2-陶瓷诱导[Ca增加2+]麻省理工学院是区域本地化的。铑-2荧光（[Ca2+]麻省理工学院)中脑神经元经C2-ceramide处理后集中于斑块（白色箭头）(一个)和PC12细胞(B类). 在存在CDK5抑制剂罗斯科维汀（Rosc）和DNK5的情况下，未观察到斑块(一个,B类). 核仁中rho-2的积累与处理无关。比例尺，10μm。*第页<0.05，与对照组相比差异显著。
CDK5激活导致内质网和线粒体聚集。一个CDK5及其激活物p25的表达增加了PC12细胞中CDK5的活性。B类,C类，CDK5及其激活物p25在PC12细胞中的表达足以诱导用抗GRP78抗体标记的ER和用抗细胞色素标记的线粒体聚集（箭头）c（c）抗体。D-F公司罗斯柯夫碱（Rosc）抑制了C2-ceramide处理引起的内质网和线粒体在中脑神经元中的聚集(D类,E类)通过DNK5在PC12细胞中的表达(F类). 比例尺，10μm。*第页<0.05，与相应对照组相比差异显著。
细胞死亡过程中钙从内质网向线粒体的局部转移暗示CDK5依赖的细胞器聚集
为了确定CDK5是否直接参与C2陶瓷诱导的钙从内质网向线粒体的转移，我们在PC12细胞中共表达CDK5及其激活物p25。转染24小时后检测到高水平的CDK5活性()，但[Ca没有增加2+]麻省理工学院观察到（数据未显示）。这表明CDK5活化是神经酰胺诱导[Ca增加所必需的2+]麻省理工学院如上所示()，本身不足以产生这种效果，这需要同时激活半胱氨酸蛋白酶-8（将Bid裂解为t-Bid）依赖神经酰胺(Darios等人，2003年)（见下文）。
因此，我们评估了CDK5激活是否与ER和线粒体的重新分布有关。细胞器用抗GRP78和抗细胞色素标记c（c）抗体，并如材料和方法中所述对分布进行定量。CDK5及其激活剂p25的表达足以诱导内质网和线粒体的聚集，这表明CDK5负责[Ca2+]麻省理工学院()，尽管不是增长本身。相反，在经C2-陶瓷处理的细胞中，罗考维汀对CDK5的抑制作用()或DNK5的表达()阻止细胞器重新定位。
确定依赖CDK5的内质网和线粒体聚集是否有助于之前在C2-陶瓷处理细胞的电子显微照片上观察到的细胞器之间形成紧密接触(Muriel等人，2000年)，我们测量了在分子抑制剂DNK5存在和不存在的情况下，经C2-陶瓷处理的细胞中线粒体与内质网最近片段之间的距离。如所示与对照细胞相比，经C2陶瓷处理的细胞中内质网和线粒体更紧密(). C2-ceramide的这种作用因CDK5显性负性形式的表达而减弱，这表明它是由激酶激活引起的。一致地，CDK5与其激活剂p25的共表达本身就足以使内质网和线粒体更紧密地结合在一起().
C2-ceramide激活CDK5使ER和线粒体更加紧密。一个，在没有或存在CDK5抑制剂DNK5的情况下，用C2陶瓷处理的PC12细胞的电子显微照片。C2-陶瓷降低了内质网和线粒体之间的距离（M；白色条和箭头所示的距离）。DNK5的表达阻止了细胞器之间距离的减少。比例尺，500 nm。注意神经酰胺治疗后早期出现的内质网肿胀。B类电子显微照片上测量的C2陶瓷处理细胞内质网和线粒体之间距离减少的时间过程。*第页<0.05，显著低于DNK5表达细胞。C类CDK5及其激活物p25的表达降低了ER与线粒体之间的距离。#第页<0.05，显著低于对照细胞。
由于CDK5活化诱导内质网和线粒体聚集，但无法介导这些细胞器之间的钙转移，我们分析了其与t-Bid的关系，t-Bid是已知参与神经酰胺介导的细胞死亡中钙转移的Bcl-2家族促凋亡成员(Csordas等人，2002年;Darios等人，2003年). 如所示t-Bid的表达诱导了[Ca的增加2+]麻省理工学院然而，t-Bid与CDK5和p25共表达诱导了[Ca的更大增加2+]麻省理工学院()表明这两种分子途径都有助于增加[Ca2+]麻省理工学院在神经酰胺介导的细胞死亡过程中。此外，尽管t-Bid诱导了[Ca的增加2+]麻省理工学院整个细胞都是均匀的()，t-Bid与CDK5/p25共表达再现了[Ca的局部增加2+]麻省理工学院在经C2陶瓷处理的细胞中观察到().
CDK5介导的细胞器聚集增强t-Bid诱导的[Ca增加2+]麻省理工学院.一个，CDK5及其激活剂p25的表达增强了t-Bid诱导的[Ca2+]麻省理工学院.B类,C类，t-Bid的单独表达导致[Ca的均匀增加2+]麻省理工学院，而t-Bid与p25/CDK5共表达导致局部增加（白色箭头）。核仁中罗德-2的积累与处理无关。*第页<0.05，与对照组相比差异显著；#第页<0.05，与t-Bid-expressing细胞显著不同。
总之，这些结果表明，CDK5负责在神经酰胺介导的神经元死亡过程中观察到的线粒体和内质网的重新分布。这导致细胞器之间形成特权接触，并加强t-Bid介导的钙转移。
神经元死亡时内质网和线粒体移位到中心体
众所周知，肌动蛋白或微管网络在细胞器贩运中都起着作用(Reynolds and Rintoul，2004年). 为了确定它们在神经酰胺介导的神经元死亡过程中是否有助于内质网和线粒体的CDK5依赖性聚集，我们研究了解聚对这一过程的影响。解聚微管的诺可唑阻止了C2神经酰胺诱导的内质网和线粒体的聚集()，这是神经酰胺诱导的[Ca增加中依赖CDK5的成分2+]麻省理工学院但不是t-Bid-dependent组件(). 解聚肌动蛋白丝的细胞清蛋白D对这两个参数都没有影响(). 这表明神经酰胺诱导的CDK5依赖性增强增加了[Ca2+]麻省理工学院这归因于内质网和线粒体的运动，它们独立于肌动蛋白细胞骨架，但需要完整的微管系统。
内质网和线粒体的聚集和[Ca的增加2+]麻省理工学院在C2陶瓷中，经处理的细胞需要完整的微管系统，并发生在中心体周围。一个,B类，微管与诺卡唑（1μ米; Noco）阻止内质网和线粒体聚集(一个)以及[Ca的增加2+]麻省理工学院(B类)而肌动蛋白细胞骨架与细胞松弛素D（2μ米; 细胞D）无影响。*第页<0.05，与对照组相比差异显著；#第页<0.05，与经C2-陶瓷处理的细胞显著不同。C类线粒体和α-微管蛋白的免疫共标记显示，细胞器聚集在中心体周围。比例尺，5μm。
这一观察表明，细胞器集中的区域可能对应于微管组织中心或中心体。为了验证这一假设，我们用抗细胞色素对C2陶瓷处理的细胞、线粒体和中心体进行了免疫组化标记c（c）抗γ-微管蛋白抗体。如所示线粒体聚集在中心体周围，与微管依赖性转运相一致。
依赖CDK5的tau对苏氨酸231的磷酸化介导内质网和线粒体的重组
微管相关蛋白tau是CDK5的底物(Baumann等人，1993年)并涉嫌贩卖细胞器(Sato Harada等人，1996年;Ebneth等人，1998年;Mandelkow等人，2004年). 因此，我们利用一系列针对可能被CDK5磷酸化的tau蛋白表位的抗体，检测了神经酰胺介导的细胞死亡过程中tau的磷酸化。用tau-5抗体检测到的全细胞裂解物中的总tau水平在C2-ceramide处理期间没有变化，表明其表达没有受到影响。苏氨酸231（T231；根据含有441个氨基酸的人类Tau亚型进行编号）磷酸化的Tau，由抗体AT180标记，在治疗的前15分钟内出现(). 根据已发表的数据，T231的磷酸化被CDK5抑制剂roscovitine降低，证实在我们的条件下它被这种酶磷酸化(Hamdane等人，2003年). 使用表位特异性抗体：AT270（T181）、AT-8（S202/T205）和AD2（S396/S404）未观察到tau磷酸化（数据未显示）。
CDK5磷酸化苏氨酸231上的tau。一个，全细胞裂解物的蛋白质印迹显示，在C2神经酰胺处理的中脑神经元中，在15分钟内检测到T231上tau的磷酸化（AT180免疫反应性），并被roscovitine（Rosc）阻止。总τ水平（tau-5免疫反应性）和总α-微管蛋白（α-tub）水平没有变化。B类，CDK5及其激活物p25在PC12细胞中的表达导致转染细胞中T231的磷酸化（箭头所示）。C类，通过在PC12细胞中表达DNK5来抑制CDK5，可以阻止C2-陶瓷诱导的T231磷酸化。比例尺，10μm。D类经C2-ceramide处理的中脑神经元可溶性蛋白的无微管部分中恢复了T231磷酸化的Tau（AT180免疫反应性），表明其已从微管中释放出来。罗斯科维汀对CDK5的抑制阻止了无微管组分中T231-磷酸化tau的出现。总τ水平（tau-5免疫反应性）相应增加，表明经C2-陶瓷处理后，τ从微管中释放出来。α-管蛋白水平在无微管组分中保持不变，表明微管在治疗期间没有解聚。
为了进一步证实T231被CDK5磷酸化，我们在表达CDK5及其激活物p25的细胞中寻找AT180免疫反应性。转染细胞中CDK5的激活导致AT180免疫反应的出现()表明T231被激酶磷酸化。相反，在经C2陶瓷处理的细胞中DNK5的表达阻止了AT180免疫反应的出现(). 因此，CDK5在神经酰胺介导的神经元死亡过程中负责T231磷酸化。
然后我们评估了tau磷酸化对T231的影响，结果表明，T231降低了tau与微管的结合(Sengupta等人，1998年;Cho和Johnson，2004年). 为了确定C2陶瓷处理后微管中是否释放了τ，我们检测了细胞裂解液中无微管部分是否存在未结合的τ。在C2陶瓷处理期间，T231上磷酸化的Tau在该部分中增加()以及总τ的水平。在这两种情况下，罗斯科汀都能阻止这种增加。与全细胞裂解物一样，无微管组分中游离α-微管蛋白的水平在C2-陶瓷处理期间没有增加，表明微管在处理期间没有解聚(). 这些结果表明，T231上的磷酸化诱导tau从微管转移到可溶性部分。然而，微管中tau的磷酸化和释放与蛋白质的聚集无关（数据未显示）。
为了进一步证明T231上的磷酸化对于神经酰胺介导的细胞死亡期间微管中tau的释放是必要的，我们表达了野生型tau或tau，其中苏氨酸231突变为丙氨酸（T231A），并且在该位点不再磷酸化(Cho和Johnson，2004年). 在表达野生型tau的细胞中，C2-陶瓷处理增加了无微管部分的总tau水平(). 在表达tau T231A的细胞中情况并非如此()，表明在C2神经酰胺处理期间，从微管释放tau需要T231的磷酸化。
T231上tau的磷酸化有助于线粒体和ER的聚集，增加[Ca2+]麻省理工学院以及C2-陶瓷处理的PC12细胞中的细胞死亡。一个在表达野生型（WT）人tau或T231A突变的人tau的PC12细胞中，只有野生型tau在C2-ceramide处理细胞的无微管可溶部分中释放，表明在T231未磷酸化的情况下，微管中不会释放tau。B类在表达T231A tau的细胞中，C2-陶瓷诱导的内质网和线粒体聚集减少。C类，C2-陶瓷诱导的[Ca增加2+]麻省理工学院在表达T231A tau的细胞中减少。D类，表达T231A tau的细胞死亡减少。*第页<0.05，与相应对照组相比差异显著；#第页<0.05，与用空载体转染或表达野生型tau的C2神经酰胺处理的细胞显著不同。
最后，评估τ磷酸化、细胞器聚集和[Ca增加之间的关系2+]麻省理工学院，我们在PC12细胞中表达野生型tau或tau T231A。与野生型Tau相比，Tau T231A减少了神经酰胺诱导的内质网和中心体周围线粒体的聚集(). 它还阻止了神经酰胺诱导的[Ca增加中依赖CDK5的成分2+]麻省理工学院()以及随之而来的细胞死亡(). 这些结果表明，T231上依赖CDK5的tau磷酸化是这些事件的原因。
讨论
在这项研究中，我们使用了CDK5、roscovitine和DNK5的药理和分子抑制剂，以表明CDK5在神经酰胺介导的神经元死亡过程中，钙从内质网向线粒体的致命转移中发挥作用。CDK5本身并不介导钙从内质网向线粒体的转移。然而，它通过促进内质网/线粒体网络的重组，增强了t-Bid等促凋亡蛋白介导的转移。这涉及T231上tau的磷酸化，诱导微管释放tau，促进细胞器运动。
钙从内质网转移到线粒体
钙可以通过形成钙达到高浓度的微区，从内质网转移到细胞器之间接触部位的线粒体(Rizzuto等人，1993年;Hajnoczky等人，1995年;Rizzuto等人，1998年). 神经酰胺是这种形式的钙转移的诱导剂(Szalai等人，1999年;Pinton等人，2001年;Rapizzi等人，2002年). 在我们之前的研究和其他研究中，t-Bid在钙从内质网向线粒体的转移中起着重要作用(Csordas等人，2002年;Darios等人，2003年)尽管其机制尚未完全阐明。Bak或Bax也是Bcl-2家族的促凋亡成员，也可能参与(Nutt等人，2002a)可能是在t-Bid依赖性齐聚和跨膜通道形成之后(Eskes等人，2000年;Wei等人，2000年)虽然还牵涉到依赖电压的阴离子通道(Rapizzi等人，2002年).
我们现在表明，CDK5激活也与神经酰胺介导的神经元死亡途径有关，在该途径中，它使钙从内质网转移到线粒体，达到致死水平。CDK5不直接负责钙转移，因为在没有过度表达t-Bid或通过神经酰胺依赖性caspase-8激活的Bid裂解的情况下，CDK5的激活不会导致[Ca增加2+]麻省理工学院CDK5的抑制并不能阻止[Ca的增加2+]麻省理工学院由t-Bid表达式导出（未显示数据）。然而，CDK5确实促进了内质网和线粒体之间紧密接触的形成，这是钙转移的形态学基础。
这些接触是在生理条件下发生的(Rizzuto等人，1998年;Reynolds and Rintoul，2004年). 然而，在神经酰胺介导的细胞死亡过程中，它们得到了加强(Muriel等人，2000年). 我们现在已经证明，这些接触的加强是CDK5依赖性的，因为在酶的药理抑制剂或主要负形式的激酶的存在下，细胞器之间距离的减少受到抑制。相反，通过激酶及其激活物p25的共同表达，仅激活CDK5就足以缩短细胞器之间的距离，证实该过程是由CDK5介导的。据报道，在存在微摩尔胞浆钙的情况下，内质网和线粒体之间也存在类似的联系(Wang等人，2000年;Yi等人，2004年)钙激活钙蛋白酶将CDK5激活物p35裂解为p25的条件(Patrick等人，1999年).
神经酰胺介导的细胞死亡过程中，内质网和线粒体之间距离的CDK5依赖性减少与中心体周围细胞器的CDK5-依赖性聚集有关。当诺卡唑治疗、CDK5抑制或不能被CDK5磷酸化的tau T231A表达阻断时，钙转移减少。然而，由于t-Bid仍然存在，它并没有完全消除。CDK5激活后中心体周围细胞器密度增加是否会增加内质网和线粒体形成紧密接触的可能性，或者细胞器之间形成专门接触本身是否是一个调节过程，还有待确定。在第一种情况下，细胞死亡是偶然发生的，因为线粒体和内质网拥挤在一起。钙从内质网向线粒体转移的增强以及随之而来的细胞死亡，只不过是其邻近性增加的不幸后果。在第二种情况下，内质网和线粒体向中心体的运动是一个协调过程的一部分，其目的是增加线粒体游离钙水平，达到诱导细胞死亡的程度。为了回答这个问题，有必要确定CDK5和t-Bid在这个细胞死亡模型中的上游激活是什么，以及线粒体和ER如何相互识别以形成这个过程所需的特权接触。在这方面，最近的一项研究表明，ER蛋白PACS-2（磷酸呋喃酸性簇分选蛋白-2）在ER和线粒体之间的联系中发挥作用，导致Bid裂解(Simmen等人，2005年).
