以李斯特菌为基础的Annexin A2靶向免疫治疗联合抗PD-1抗体的抗胰腺癌疗效

人ANXA2肽

合成了一组339肽，作为鉴定Kb和Db限制性小鼠表位的方法。小鼠和人类ANXA2同源性为98%（附加文件1：图S1）。肽发生器数据库（PeptGen）(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PEPTGEN/PEPTGEN.html)用于创建从NCBI蛋白质数据库获得的人类ANXA2蛋白质序列的重叠肽集。在约翰·霍普金斯肿瘤肽合成核心设施中，连续肽被构建为15个重叠10（>95%纯度）的单体。15肽被合并成4个初始组（附加文件1：表S1）。在识别出一组共同感兴趣的肽后，对单个15肽进行活性测试。然后从识别出的活性15肽序列中构建连续的8肽，重叠7个氨基酸（纯度>90%）（肽2.0公司）

lm-ANXA2施工

Lm-ANXA2菌株构建于Δ行动AΔ英磅实时衰减，双重删除（LADD）李斯特菌属平台应变[26]. ANXA2编码序列的合成使用李斯特菌属密码子偏倚（ATUM，Newark，CA），并在行动ApPL2积分向量衍生物中ActA氨基末端的启动子和框架内[27]. 质粒构建体在tRNA^精氨酸轨迹如所述。使用空的LADD菌株作为对照（空Lm）。

细胞内蛋白印迹

ANXA2的表达和分泌基本上在DC2.4细胞中进行[28]. 用抗分泌的ActA蛋白成熟氨基末端的多克隆抗体检测ActA融合子（ANXA2）。感染后表达稳定，并使用单克隆抗体P6007（EMDMillipore）归一化为李斯特菌P60蛋白。按照制造商说明使用IRDye二级抗体，并使用Odyssey成像系统（Licor Biosciences）采集图像。

小鼠和体内实验

从哈兰实验室（马里兰州弗雷德里克）购买6至8周龄C57Bl6雌性小鼠，并按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行维护。根据IACUC小鼠研究方案，有痛苦迹象的小鼠，包括驼背姿势、嗜睡、脱水和毛发粗糙，将被安乐死，并被视为已达到“生存”终点。如前所述，在第0天进行肿瘤接种的半脾技术[30]. 简单地说，在对小鼠进行麻醉后，将脾脏取出内脏，剪短，并将其分为两半。一半脾脏注射2×10⁵随后移除KPC肿瘤细胞和注射的半脾。这种易于复制的临床前模型允许持续发展侵袭性肝转移，是肝脏微环境中转移性疾病的免疫学研究的理想选择。第2天，腹腔注射单剂量环磷酰胺（Cy）（100 mg/kg，Bristol-Myers Squibb）。在第3天、第10天和第17天，清空Lm和Lm-ANXA2（5×10⁵在0.2 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行IP给药。如前所述，在确定转移性肿瘤负担后的第3天开始给药李斯特菌[31]. 从第24天开始，每周两次IP给药抗-PD-1抗体（5 mg/kg IP，RMP1-14，BioXcell）或同种对照IgG（5 mg/kgIP，2A3，BioX cell），直到死亡或第90天。对于CD8+T细胞耗竭，在第2天开始抗CD8a抗体（10 mg/kg IP，2.43，BioXcell），每周两次IP给药，直到第30天。

基因工程KPC小鼠（KRAS和p53突变）[24]每周用小动物超声波（Vevo770）检查一次。一旦PDAC肿瘤达到3-5mm，小鼠被随机（第0天）分为两个治疗组：空Lm疫苗接种，然后注射IgG抗体或Lm-ANXA2，然后注射抗PD-1阻断剂。在第1天、第8天和第15天进行基于李斯特菌的免疫治疗。从第22天开始，每周两次IP给药抗PD-1抗体（5 mg/kg）或IgG（5 mg/kg/kg），共5次。

李斯特菌的安全性分析

购买6至8周龄C57Bl6雌性小鼠，并按照上述方法进行维护。在第1天、第8天和第15天，清空Lm和Lm-ANXA2（5×10⁵在0.2 mL PBS中进行IP给药。测量并跟踪每只小鼠的重量（单位：克）。第18天，收集每只小鼠的血清，并在SRI生物科学临床分析实验室测量天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶水平。

肝转移浸润淋巴细胞分析

在接种KPC肿瘤后第28天进行肝转移滤过性淋巴细胞分析。通过100μm和40μm尼龙过滤器对每个肝脏进行机械处理，并将其置于25 mL CTL培养基中。通过100μm尼龙过滤器对每个脾脏进行机械处理，并将其制成15 mL CTL培养基。将所有悬浮液以1500 rpm离心5 min。将肝细胞颗粒悬浮在4 mL ACK裂解液中（Quality Biological），将脾细胞颗粒悬浮于2 mL ACK分解液中2 min，然后以1500 rpm旋转5 min。然后将肝细胞粒悬浮于5mL 80%Percoll（GE Healthcare Life Sciences），用5 mL 40%Percoll覆盖，并在室温下以3200rpm离心25分钟，无需制动。去除淋巴细胞层并将其悬浮在10 mL CTL培养基中。

小鼠IFN-γ酶联免疫吸附和免疫斑点测定

根据制造商提供的方案，使用CD8-阴性分离试剂盒（LifeTechnologies）对分离的肝浸润淋巴细胞进行CD8+细胞富集。将肽刺激的Kb和Db细胞以1:1（2×10）的比例添加到分离的CD8+T细胞中⁵每个细胞系的细胞），并在37°C下培养18小时。根据制造商的方案（eBioscience）进行小鼠IFNγ酶联免疫吸附试验（ELISA）Ready-Set-Go试验。根据制造商的方案（Abcam）进行小鼠IFNγ酶联免疫斑点（ELISPOT）检测。

定量实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

使用三唑试剂（ThermoFisher Scientific）从肿瘤浸润淋巴细胞颗粒中提取总RNA。然后使用Superscript III First Strand Synthesis Supermix Kit（ThermoFisher Scientific）将RNA转化为cDNA。在StepOnePlus实时PCR系统（ThermoFisher Scientific）上进行定量实时RT-PCR（qPCR），并使用StepOne软件V2.1进行分析。SYBR Green-based qPCR检测TNFα、IL-2、IFNα、IFNβ和IFNγ的表达。所有基因表达均归一化为β-肌动蛋白的表达。所有qPCR反应均一式三份。

治疗性给予lm-ANXA2提高PDAC小鼠模型的生存率

然后，我们在转移性PDAC的临床前模型中测试了以李斯特菌为基础的治疗性癌症免疫疗法靶向ANXA2是否能提高生存率。基因工程KPC小鼠开发的PDAC（与KRAS公司和第53页突变）[24]在发病机制和免疫生物学方面与人类PDAC相似，并且与人类PDACs一样难以用免疫治疗剂治疗[32]. 首先，采用先前报道的小鼠肝转移实验模型，将KPC肿瘤细胞直接注射到脾脏中[30]. 使用空Lm菌株作为对照，其仍能激发先天免疫刺激。在第3、10和17天给药Lm-ANXA2和Empty Lm。根据其他临床前疫苗治疗模型的报告，在第2天给予单次低剂量Cy用于T调节细胞耗竭[8]. 与空Lm对照组相比，Lm-ANXA2提高了小鼠的存活率(对 = 0.026）（图。​（图1c）。1c个). Lm-ANXA2和Empty Lm均未导致C57Bl/6小鼠体重减轻、基于正常血清值的显著转氨酶炎或小鼠的任何其他明显毒性，类似于先前描述的基于李斯特菌的免疫治疗[29,33,34]（附加文件1：图S2）。以前的数据表明基于李斯特菌的免疫治疗反应完全由CD8+T细胞介导[26]. 为了在我们的模型中重申这一点，我们利用了CD8+T细胞耗竭。在用Lm-ANXA2处理CD8+T细胞缺失小鼠或用Empty Lm处理CD8+T细胞缺失鼠（附加文件1：图S3）。与使用Empty Lm治疗的CD8+T细胞缺失小鼠相比，使用Empty-Lm治疗CD8+T细胞完整小鼠的存活率并不高（附加文件1：图S3）。在整个治疗期间，使用Lm-ANXA2治疗的荷瘤小鼠的存活率显著高于使用Lm-AN XA2治疗且同时伴有CD8+T细胞耗竭的小鼠（图2)表明Lm-ANXA2的抗肿瘤作用是由CD8+T细胞介导的。

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图2

李斯特菌免疫治疗伴CD8+T细胞缺失。如前所述，在第0天植入KPC PDAC细胞的小鼠接受Lm-ANXA2治疗(n个 = 每组10–12只小鼠）。在第2天通过抗CD8a抗体（10 mg/kg IP；2.43，BioXcell），直到第30天。Kaplan-Meier曲线显示，经Lm-ANXA2治疗的PDAC荷瘤小鼠的存活率和CD8+T细胞耗竭显著低于未经CD8+T细胞耗竭的Lm-ANXA2治疗的小鼠(对 = 0.027)

Lm-ANXA2使PDAC敏化，以抗PD-1为基础的联合治疗改善小鼠模型的生存结果

Lm-ANXA2的抗肿瘤效果似乎仍然很温和（图。​（图1c）。1c个). 因此，我们在PDAC半脾模型中检测了Lm-ANXA2是否可以增强PD-1抑制剂治疗的抗肿瘤活性，如果联合使用，则提供额外的益处。Lm-ANXA2和Empty Lm在第一次接种前一天首次服用环磷酰胺后的第3、10、17天服用（图3a年). 从第24天开始每两周给药一次大鼠抗鼠PD-1单克隆抗体或IgG同型对照品，直至死亡或第90天。我们首先发现，与单独的Lm-ANXA2相比，Lm-ANXA2和抗PD-1抗体的同时组合（数据未显示）没有增强的抗肿瘤活性。同样，抗PD-1在该模型中作为单药治疗无效。然而，我们发现，与单独使用Empty Lm或Empty Lm+抗PD-1阻断抗体治疗相比，Lm-ANXA2和抗PD-1抗体的序贯联合治疗提高了生存率(对 = 0.007）（图。​（图3b）。第3页). 与单独使用Empty Lm治疗相比，联合使用抗PD-1抗体和Empty L m并不能提高生存率(对 = 0.55）两个治疗组的疗效均较差。与单独使用Lm-ANXA2相比，Lm-ANXA2+抗PD-1联合治疗有提高生存率的趋势，但未达到统计学意义(对 = 0.399). 值得注意的是，在这种半脾小鼠模型中，单独使用Lm-ANXA2或与IgG同型控制结合，似乎并没有持续导致长期存活超过120天（图。​（图1c；1c个; 图。3b和c)可能取决于每只小鼠肿瘤负担的变化。然而，Lm-ANXA2加上抗PD-1抗体后，大约50%的小鼠的长期存活时间持续超过120天。另外，抗PD-1抗体或Empty Lm单独在该小鼠模型中仅导致约10%的长期存活率。Lm-empty/对照IgG治疗的适度抗肿瘤活性与先前发表的研究一致，研究表明，由empty Lm诱导的先天免疫反应具有抗肿瘤作用[13,24]. 然而，联合使用抗PD-1阻断剂和Empty Lm治疗对长期生存率没有显著影响(对 = 0.65）（图。​（图3c）。3立方厘米). Lm-ANXA2+抗PD-1阻断剂的序贯联合治疗表明，与单独使用Empty Lm或与抗PD-1拮抗剂联合使用相比，在统计学上显著提高了小鼠的长期存活率(对 = 0.02和p=0.02）（图。​（图3c）。3立方厘米). 与整体生存数据类似，与单独使用Lm-ANXA2相比，Lm-ANXA2+抗PD-1联合治疗的治愈率提高的趋势得到了认可(对 = 0.22).

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图3

Cy/Lm-ANXA2和PD-1阻断剂序贯联合治疗可提高PDAC小鼠模型的生存率和治愈率。一通过半脾程序进行肿瘤植入的方案，并使用Cy、Empty Lm或Lm-ANXA2和抗PD-1抗体进行治疗，如图所示。bKaplan-Meier生存曲线和(c（c）)植入PDAC细胞并用Cy、Empty Lm、Lm-ANXA2和抗PD-1抗体的不同组合处理的小鼠在第120天的治愈率。未经处理(n个 = 8); 空Lm/IgG(n个 = 21); 空Lm/抗PD-1(n个 = 22); Lm-ANXA2/IgG(n个 = 19); Lm-ANXA2/抗PD-1(n个 = 18). 注意，该结果结合了两个独立重复的实验，因此每个治疗组的小鼠数量不同

在患有自发性PDAC肿瘤的基因工程KPC小鼠中用lm-ANXA2和PD-1阻断剂治疗可产生更大的最大肿瘤反应

我们进一步研究了Lm-ANXA2和抗PD-1阻断疗法的序贯联合治疗是否可以提高自发性PDAC基因工程小鼠模型的PDAC生存率。我们首先证实，在用Lm-ANXA2处理的转基因KPC小鼠中，与空Lm相比，在来自PDAC的肿瘤浸润免疫细胞中诱导了多种抗肿瘤细胞因子的RNA表达，包括IL-2、IFNα、IFNβ和IFNγ（图4)进一步支持Lm-ANXA2可以重新编程KPC小鼠的TME，并可能使KPC小鼠对PD-1抗体治疗更敏感。值得注意的是，与未经治疗的小鼠相比，Empty Lm未显著诱导IL-2、IFNα、IFNβ和IFNγ，而这些都是通过Lm-ANXA2治疗诱导的（附加文件1：图S4）。与Lm-ANXA2相比，在Lm-ANXA2中添加抗PD-1治疗后，浸润免疫细胞内感兴趣的抗肿瘤细胞因子的表达增加，IFNβ显著增加（附加文件1：图S4）。因此，分别用Empty Lm疫苗或Lm-ANXA2和抗PD-1抗体治疗具有3-5mm胰腺肿瘤的KPC小鼠（图5a级)每周用小动物超声波（Vevo770）对、和进行检查（附加文件1：图S5）。在未经处理的基因工程KPC小鼠上，通过超声波测量每周肿瘤体积。给出了典型的超声波图（图。​（图5b）。5亿). 到第21天，当所有计划的李斯特菌治疗完成时，Lm-ANXA2和Empty Lm治疗组之间通过超声波测量的肿瘤反应没有明显差异。因此，Lm-ANXA2治疗组在第22天开始抗PD-1抗体治疗。考虑到难以繁殖大量基因工程KPC小鼠，并将肿瘤大小和年龄相等（小鼠生存实验的关键变量）的小鼠随机分为多个治疗组，因此，我们仅将联合治疗与未经治疗的对照小鼠进行生存实验。如表所示1，Lm-ANXA2治疗组中80%的小鼠在第22天启动抗PD-1抗体后出现肿瘤缩小，而该组中只有18%的小鼠在给予抗PD-1之前出现肿瘤缩小(对 = 0.009). Empty Lm治疗组和未治疗组的小鼠在第22天之前或之后都没有显著的肿瘤缩小。最大肿瘤反应是指从峰值肿瘤大小到峰值后最低肿瘤体积的体积变化，如果没有肿瘤缩小，则视为“零”。然后将该值在经过治疗的小鼠和对照小鼠（未经治疗的KPC小鼠）之间进行比较。与未经治疗相比，Lm-ANXA2+抗PD-1阻断剂联合治疗的最大肿瘤反应在统计学上显著增加(对 = 0.022）和仅用空Lm处理(对 = 0.027）（附加文件1：图S6）。在不治疗和仅使用Empty Lm治疗之间，最大肿瘤反应没有显著差异(对 = 0.974). 与对照KPC小鼠相比，经Lm-ANXA2+抗PD-1阻断剂序贯联合治疗的KPC小鼠的生存期显著延长（图。​（图5c）。第5页). 这项研究首次表明，基于疫苗的免疫治疗和基于PD-1阻断剂的联合免疫治疗能够在患有自发性PDAC肿瘤的小鼠中产生客观肿瘤反应并延长生存期。由于超声检查是劳动密集型的，我们将此实验限制在三个治疗组。观察到的肿瘤反应不太可能由抗PD-1抗体引起，因为KPC小鼠已被证明对单剂抗PD-1的抗体治疗具有耐药性[35,36]. 然而，未来的实验需要比较Lm-ANXA2和抗PD-1抗体的组合以及单独抗PD-1的抗体。

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图4

Lm-ANXA2治疗后PDAC肿瘤微环境中浸润性免疫细胞的细胞因子表达。基因工程KPC小鼠自发分化PDAC肿瘤浸润免疫细胞炎性细胞因子qPCR基因表达分析(n个 = 2） 使用Empty Lm与Lm-ANXA2进行治疗* = 对 < 0.05; *** = 对 < 0.001

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图5

对患有自发性PDAC肿瘤的基因工程KPC小鼠进行Lm-ANXA2和抗PD-1阻断抗体的序贯治疗，可延长生存期。一基因工程KPC小鼠的治疗方案。bLm-ANXA2/抗PD-1抗体治疗前后肿瘤的典型超声图像。c（c）Lm-ANXA2联合抗PD-1抗体治疗KPC小鼠的Kaplan-Meier生存曲线(n个 = 12） 和控制KPC小鼠(n个 = 8)

对KPC肿瘤进行了ANXA2的免疫组织化学染色，证明了PDAC中ANXA2表达的异质性，从低表达到高表达不等（附加文件1：图S7）。ANXA2表达的这种变异性可能解释了为什么只有一部分小鼠对治疗有反应。

我们感谢阿比盖尔·布里廷厄姆对关键技术的支持。我们感谢Bill Hanson帮助构建本研究中使用的Lm-ANXA2菌株。我们感谢约翰霍普金斯大学的丁丁对我们手稿的统计咨询和批评。