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自然。作者手稿；PMC 2019年5月21日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然。2009年9月17日；461(7262): 361–366.
2009年8月12日在线发布。 数字对象标识：10.1038/性质08319
预防性维修识别码：PMC6528170型
美国国立卫生研究院：尼姆斯1024375
PMID：19675567

Get3识别尾锚定膜蛋白的结构基础

阿格涅斯卡·马特加,1 安娜·斯拉奇奇,1中，三 莫林·E·唐宁,1 马尔戈扎塔·多博斯,1中，4 马来亚拉姆-马里亚潘,2 拉马努扬·S·赫格德,2和罗伯特·J·基南1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

将新合成的膜蛋白靶向内质网是一个重要的细胞过程。大多数膜蛋白被信号识别颗粒识别并共同翻译靶向。然而，近5%的膜蛋白被一个不能进入共翻译途径的单一羧基末端跨膜结构域“尾锚定”。相反，尾锚定蛋白在翻译后被称为Get3的保守ATP酶靶向。Get3识别或靶向尾锚定蛋白的机制基础尚不清楚。在这里，我们展示了酵母Get3在“开放”（无核苷酸）和“封闭”（ADP·AlF）中的晶体结构4−-结合）二聚体状态。在封闭状态下，Get3的二聚体界面包含一个巨大的疏水沟槽，这与尾锚定蛋白结合的突变分析有关。在开放状态下，Get3经历了惊人的重排，破坏了凹槽并屏蔽了其疏水表面。这些数据为在Get3靶向膜期间核苷酸调节尾锚定蛋白的结合和释放提供了分子机制。

真核细胞已经进化出复杂的机制来确保膜蛋白的高保真靶向性和插入细胞内的细胞器。对于靶向内质网（ER），最清楚的机制是由细胞溶质信号识别颗粒（SRP）、ER相关SRP受体和Sec61蛋白转位通道介导的共翻译途径1——三从细菌到人类，该途径是保守的，并且对于广泛的膜蛋白的生物合成至关重要。然而，许多ER靶蛋白不能进入SRP依赖的共翻译途径。

一个特别重要的例子是尾锚定（TA）蛋白，由单个C末端跨膜结构域（TMD）定义4,5和一个面向氨基末端结构域的细胞溶质。TA蛋白在几乎每个细胞膜中介导许多必需的生物化学活性。众所周知的例子包括参与囊泡运输的SNARE蛋白、线粒体和ER蛋白易位装置的组成部分、凋亡蛋白Bcl2家族的成员以及几种病毒包膜和非结构蛋白4,6,7TA蛋白的靶向信息仅存在于TMD中。由于到达终止密码子时TMD仍在核糖体隧道内，因此不能进行共翻译靶向8因此，TA蛋白通过SRP-非依赖性途径在翻译后被强制识别和靶向。

通往内质网的TA蛋白通路的中心成分是一种高度保守的细胞溶质ATP酶，称为Asna1或TRC40(参考文献9,10). 虽然最初注释为Asna1是因为与ArsA约27%的序列一致大肠杆菌抗砷操纵子11——13，真核生物TRC40s已经进化出不同的功能。哺乳动物TRC40及其酵母同源物Get3都能识别并选择性结合胞浆中TA蛋白的TMD。然后，该复合物通过膜结合受体（在酵母中称为Get1和Get2）靶向内质网14)TA蛋白被释放以插入。这种受空间限制的单向靶向性由ATP结合和水解调节，但这一过程的机理尚不清楚。为了解决这个问题，我们确定了酵母Get3在无核苷酸和ADP·AlF中的晶体结构4−-束缚态。我们的结构和功能分析表明Get3如何选择性地结合TMD底物，以及ATP水解如何在靶向内质网期间调节TA蛋白的结合和释放。

Get3同型二聚体的整体结构

我们测定了ADP·AlF的X射线晶体结构4−-绑定酿酒酵母Get3和无核苷酸葡萄裂殖酵母获得3（约58%与酿酒酵母Get3），分辨率分别为2.0和3.0º(补充表1和补充图1和2). 两种结构都显示出对称的同二聚体(图1a,​，b）。b条). 每个单体包括一个核心ATP酶亚结构域和一个α螺旋亚结构域(补充图3a). Get3 ATP酶亚结构域与NTP结合蛋白的SIMIBI（信号识别粒子、MinD和BioD之后）类的其他成员结构相似15，包括与已知结构最接近的序列同源物ArsA16以及与之关系较远的固氮酶铁蛋白（NifH）17，Soj公司18，MinD公司19和SRP GTP酶20,21。

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Get3是一种动态的、金属稳定的同二聚体。

a、 b、，公开Get3的晶体结构(一)并关闭(b条)二聚体状态。每个单体包括一个核心ATP酶亚域（蓝色、绿色）和一个α螺旋亚域（洋红色、黄色）。二聚体界面上有一个紧密结合的锌原子（棕色球体）。c、 日期：，同二聚体界面（蓝色、棕色）中的残留物从开口映射到Get3单体的表面(c（c）)并关闭(d日)二聚体结构。单体围绕二聚体假两倍轴旋转约90°，相对于一和b条涉及保守ATP酶基序的界面区域为棕色。e、，封闭二聚体结构中Get3二聚体基序的详细信息，突出了锌通过保守CXXC序列基序的四面体配位。电子密度来自σA类-加权2楼o（o）−F类c（c）以2.0º分辨率计算的地图，以2σ等高线绘制。

无核苷酸结构S.pombe公司Get3显示了两个分开的亚单位(图1a)约900Å2界面中埋藏的表面积(图1c). 无核苷酸的3.8μ分辨率结构酿酒酵母Get3显示了相同的开放二聚体结构(补充表1和补充图2)这表明开放形式反映了无核苷酸Get3的保守构象。相反，ADP·AlF4−-约束形式酿酒酵母获取3(图1b)显示了一个大的构象变化，大约是一个亚基向另一个亚单位旋转约37°。这一运动将第四纪结构“封闭”成一种更紧密的形式，埋藏了约2400奥2跨越两个子结构域的广泛二聚体界面的表面积(图1d)。

Get3中的开-闭转变发生在以同二聚体界面上的锌离子为中心的铰链点附近。这种锌由每个单体的两个半胱氨酸残基的侧链进行配位(图1e)在真核生物Get3同源物（“CXXC基序”；补充图3b). 虽然在实验过程中没有添加外源锌，但四面体几何形状、配位配体的身份以及细菌纯化的Get3的X射线荧光光谱将该离子指定为锌。这些半胱氨酸突变的变异体不与锌配位，在溶液中不能二聚，并且不能补充Δ获得3酵母22因此，Get3是一种含有结构金属离子的专性二聚体，可稳定功能不同的构象。

复合疏水槽

Get3的α-螺旋亚结构域与ArsA的变构类金属结合位点重叠，但在序列、结构和功能上显示出重要差异。真核TRC40缺乏ArsA用于结合As/Sb（III）的保守残基。相反，该区域富含蛋氨酸(补充图3b，红色），其频率是脊椎动物蛋白质中常见频率的2-3倍。此外，真核生物TRC40同源物在我们称之为“TRC40-insert”的α-螺旋亚结构域中含有一个独特的~20-残基插入(补充图3b，黄色）。

在Get3开放二聚体中，α-螺旋亚结构域之间的分离度超过20,在这两个亚单位之间制造一个巨大的裂缝(图1a和​和2a）。2a个). 裂缝的表面是带电的，而不是疏水的，因此不适合TMD结合。相反，在封闭二聚体状态下，α-螺旋亚结构域直接接触，并定义了跨越两个单体的连续的、溶剂暴露的疏水槽(图1b和​和2b2亿)。

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封闭二聚体界面上的复合疏水槽。

a、，带有绿色疏水残基的Get3开放二聚体的表面表征；带正负电荷的残留物分别被染成蓝色和红色。b、，如中所示a、，而是Get3封闭二聚体。显示了大疏水槽（右侧面板）的大致尺寸。c、，由α-螺旋亚结构域（洋红色和黄色，颜色如图1和方向如中所示b、，右面板）。

每个α-螺旋亚畴向复合槽贡献六个双亲螺旋。凹槽底部由两个“交叉”螺旋（α6）形成，而与交叉螺旋大致正交的另外八个螺旋（α4、α5、α7和α9）形成了延伸凹槽的侧面(图2c). 该区域的电子密度通常弱于蛋白质的其余部分，这反映在较高的B因子中；实际上，在封闭二聚体的电子密度图中，连接螺旋α4–α5和α7–α9的区域（包括TRC40插入物的螺旋α8）是无序的(补充图1b)。

Get3复合槽暴露超过3000欧2溶剂的疏水表面积。相比之下水热Thermus aquaticusFfh（真核生物SRP54的同源物）仅暴露~1500μl2疏水表面积23Get3沟槽的非极性特征在真核生物TRC40中保持不变，但沟槽内壁残基的序列一致性不一致(补充图3b). 极性和带电残留物几乎完全从槽中排除，而对溶剂开放的末端由两个保守的带正电的表面补丁（Lys 147、Lys 150和Lys 215）描绘。凹槽的疏水区域约为30º长、15º宽和15º深(图2b)，这足以容纳约20个残基的α-螺旋TMD，因此可以形成TA底物结合位点。

为了验证这一点，分析了沟槽表面疏水残基的24个具有单天冬氨酸取代的Get3变体的底物相互作用在体外和a的功能互补Δ获得3酵母菌株体内。除一种外，所有这些都以野生型水平表达大肠杆菌，纯化后可溶，具有可检测的ATP酶活性(补充表2). 天然下拉分析显示野生型Get3与体外-以TMD依赖方式合成SEC61β（模型TA蛋白）(补充图4). 在变异的Get3蛋白中，沿着螺旋α7和α8聚集的突变可观察到TA底物结合减少(图3a,​、c、，c（c）、绿色和洋红色）。值得注意的是，这些区域包括开关II的C端子端（螺旋线α7）和TRC40插件的N端子端（螺线α8）。与底物下拉分析定性一致，体内最强缺陷沿着螺旋α7和α8聚集(补充图5)。

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疏水槽的功能分析。

a、，通过天然免疫沉淀法测定位点特异性Get3突变对与全长人SEC61β结合的影响。每个值是三到六个独立测量值的平均值，在不同的日子进行，相对于野生型。错误条表示s.e.m.显示少于约50%野生型绑定的变体突出显示（绿色、洋红色）。b、，ATP酶活性测定一式三份，数值为五最大值相对于野生型。误差条表示s.e.m.变异体，其野生型ATP酶活性低于~25%，突出显示（蓝色、洋红色）。c、，在TA底物结合（绿色）、ATP水解（蓝色）或两者（品红色）中表现出最强缺陷的突变被映射到复合疏水槽（方向与图2c). ATP酶突变体定位于沟的底部，靠近Get3核苷酸传感器（黄色；参见图4b). 螺旋α8在Get3封闭二聚体结构中无序，因此在此处不可见。日期：， 体内Get3突变体分析。WT，野生型。

正如预期的那样，一组双天冬氨酸突变体以及二聚体缺陷型Cys285Ser/Cys288Ser双突变体显示出更强的生长缺陷，与在体外TA底物结合活性(图3a,​，d）。d日). 值得注意的是，两个单一突变（Met200Asp和Met205Asp）表现相对温和在体外和体内缺陷结合在一起时影响更大。双突变体在大肠杆菌，可溶，ATP酶活性为野生型Get3的2-3倍(图3b和补充表2)表明观察到的缺陷不是由于折叠不当或催化作用受损所致。结合晶体学分析，这些功能数据表明，新合成的TA底物在靶向ER的过程中与Get3复合疏水沟槽结合。

核苷酸传感器

在ADP·AlF中4−-结合Get3晶体结构，两个核苷酸在同二聚体界面以头对头构象埋藏(图1b). 该界面中埋藏的近30%的表面积涉及保守的ATP酶序列基序(图1d). 虽然每个核苷酸主要与一个单体相关，但与第二个单体也有关键联系，这解释了为什么Get3的二聚体缺陷突变体，包括Cys285Ser/Cys288Ser(图3a,​、b、，b条,​，d），d日)，功能不活动22。

两种Get3单体的活性位点被锁定在模拟过渡状态的几乎相同的构象中(图4a). 这与ArsA形成了对比，ArsA中的核苷酸结合位点在结构和功能上似乎是不等效的24在Get3中，方板AlF4−ADP的α-和β-磷酸盐通过残基28–33的主链酰胺氮和Thr 32和Thr 33的侧链与P环相互作用。镁2+是由三个水分子八面体配位的，β-磷酸氧是AlF的氟化物配体之一4−和Thr 32侧链。此外，Switch II残基Asp 166和Thr 167分别与Mg进行第二壳层相互作用2+一个有序的水分子，由Asp 57的侧链（在Switch I中）和Pro169的仅3.6º（在Switch II中）协调，定位于对ATP的γ-磷酸进行顺式亲核攻击。这种相互作用是必要的，因为Asp57Asn突变体在ATP水解方面有缺陷，并且不能拯救潮霉素B敏感表型Δ获得3酵母(图3b,​，d）。d日). 此外，保守的P-loop残基Lys 26穿过二聚体界面与α-和β-磷酸盐和AlF接触4−在相反的活动站点。这种亚单位间的相互作用对包括NifH在内的相关系统的催化作用至关重要25和Soj18在Get3中，Lys 26可能通过中和γ-磷酸盐处的负电荷来稳定过渡态。

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Get3核苷酸传感器。

a、，封闭二聚体的一个亚单位（绿色）的复合ATP结合位点内的关键相互作用。必需的催化残基Asp 57与假定的亲核水分子（红色球体，星号）相协调，与AlF相邻4−核苷酸与第二亚单位（蓝色）中的残基（包括P-loop残基Lys 26）进一步相互作用。b、，在ADP·AlF的存在下，在Switch II区域（绿色和蓝色）观察到线圈到螺旋线的转变4−相对于无核苷酸状态（灰色亚基）。从中的方向看约180°c、，沿着二聚体假三折轴观察，并按图1开关II/α7和α螺旋亚结构域之间保守的交叉单体相互作用在开放二聚体中被破坏（此处不可见无核苷酸二聚体的第二亚单位）。c、，α-螺旋亚结构域在开放二聚体（灰色）中分开，并在每个产生的“半衰期”重排中形成螺旋；螺旋α8在封闭的二聚体中无序，插入疏水性半衰期以屏蔽溶剂。

观察到需要ATP水解才能在ER膜上有效释放TA底物10表明Get3的ATP酶和α螺旋亚结构域在功能上是相连的。与此一致，我们发现α-螺旋亚结构域内的天冬氨酸点突变子集降低了ATP水解速率在体外(图3b,​、c、，c（c）、蓝色和洋红色）。这些突变与保守的Switch II区域相邻(图3c，黄色），在相关系统中经历核苷酸介导的构象变化，包括NifH25,26在Get3晶体中，从开放状态到闭合状态的转变伴随着螺旋α7的N端螺旋线到螺旋线的转变，这是开关II的一部分(图4b). 在螺旋构象中，Switch II残基His 172的侧链（与ArsA中的非金属底物结合）与来自相反亚基的His172侧链堆叠。每个His 172与Glu 138（螺旋α6的一部分）进行额外的交叉单体相互作用，Arg 175（位于螺旋α7中，紧邻Switch II的C末端）与Asp 137（螺旋α6的一部分）形成单体间盐桥。值得注意的是，这些残基从酵母到人类都是保守的

封闭二聚体中ATP酶和α螺旋亚结构域之间的Switch-II介导的交叉单体相互作用网络在核苷酸转换和复合TA结合位点的形成之间提供了直接联系。与此一致，无核苷酸晶体结构显示Switch II/α7呈卷曲构象，封闭二聚体中观察到的亚单位间相互作用网络被完全破坏(图4b，灰色）。在这种开放状态下，α-螺旋亚畴之间的间隔超过20º(图1a)复合疏水槽被破坏。孤立α-螺旋子域内的螺旋被重排(图4c，灰色）；最值得注意的是，螺旋α8在封闭的二聚体结构中是无序的，它紧贴着α-螺旋亚结构域，在那里它保护疏水表面不受溶剂的影响。综上所述，类比其他SIMIBI蛋白质25,27,28，Get3晶体结构表明，Switch II的功能是将ATP结合和水解引起的结构变化传递到同二聚体界面和TA底物结合位点。

TA蛋白结合的意义

我们提出，在Get3同型二聚体的闭合构型中观察到的复合疏水沟槽形成TMD结合位点。这项任务与我们的生化、遗传和结构分析一致。槽的尺寸非常适合与约20个残留物的α螺旋TMD结合(图5a). 保守的TRC40插入物在封闭的二聚体结构中无序（可能反映出缺乏结合的TA底物），是TA结合位点的一个动态特征。它可以作为一个“盖子”，在靶向过程中保护结合TMD的暴露面不受溶剂的影响，并在没有底物的情况下保护分离的α-螺旋亚结构域的疏水表面。

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TA蛋白靶向模型。

一，的20-残基α-螺旋TMD詹氏甲烷球菌TA蛋白Sec61β（PDB加入1RHZ）38可以模拟成具有良好物理化学互补性的Get3疏水沟槽。b条，Get3开放二聚体结合ATP和新合成的靶向ER的TA蛋白（步骤1）。Get3-底物复合物通过与膜结合受体Get1/2的相互作用靶向ER（步骤2）。ATP水解后，核苷酸传感器中的构象变化破坏了复合槽的稳定性，驱动TA底物释放（步骤3）。膜插入可能是自发的，也可能是由专门的整合酶促进的（未显示）。ATP水解和TA底物插入后封闭二聚体的破坏推动从膜释放，并将Get3恢复到开放二聚体构型（步骤4）。

凹槽内广泛的疏水表面积（>3000μ2）表明Get3以高亲和力与广泛的ER-定向靶向信号结合。与此相一致的是，尽管疏水槽中存在电荷，但许多天冬氨酸Get3突变体仍能与TA底物相互作用(图3a和补充图5). 真核生物TRC40序列的系统发育分析表明，沟内蛋氨酸异常丰富。与之前关于SRP54和Ffh富含蛋氨酸的M域结合信号序列的提议类似23,29沟的固有侧链和主链动力学可能有助于Get3调节不同TA蛋白靶向信号的能力。

这些结构还表明Get3如何区分密切相关的ER和线粒体外膜（MOM）定向靶向信号。ER-靶向TA蛋白通常比靶向MOM的TA蛋白具有更长、更疏水的TMD30因此，Get3中的复合凹槽可能起到分子标尺的作用，优先与具有足够长度（~30μ）和疏水性的ER-定向TA蛋白结合。类似地，MOM定向靶向信号通常包含直接到TMD的C端的正电荷31,32因此，在Get3疏水槽的正电荷端可能会发生进一步的区分(图2b)其中电荷排斥使Get3偏向于与MOM目标信号结合。总之，这些结构特征可能允许选择性结合到ER-定向靶向信号。

TA蛋白靶向模型

我们的结构和功能数据允许我们提出一个物理上合理的模型，通过该模型，ATP结合和水解在靶向内质网期间调节TA底物的结合和释放(图5b). 当ATP结合将Get3推向封闭的二聚体状态时，靶向在胞浆中启动，以TMD依赖的方式促进新合成的TA膜蛋白的识别9,10,14为了尽量减少无效的ATP水解，封闭二聚体界面（例如Lys 26）中的活性位点残基保持在非催化构象中，直到预靶向复合物被传递到ER膜的Get1/2受体14.因为插入时需要ATP水解10，与受体、脂质双层和/或假定的整合酶结合，将“松散”的预靶向复合物驱动成具有催化活性的构象。在ATP水解和分解ADP和/或无机磷酸盐后，Switch II区域崩塌，从而破坏稳定复合槽的保守交叉单体相互作用网络(图4b). 最初，这些构象变化可能通过螺旋a7传播，以“弹出”打开TRC40插入盖，如封闭二聚体中观察到的那样，促进TA底物释放。一个有趣的可能性是，保守的TRC40插入物瞬间分割到内质网脂质双层的外叶中，以驱动TA底物插入到膜中。随后，Get3回复到开放的二聚体状态，降低其与Get1/2受体的亲和力，并将其返回胞浆以启动新一轮靶向。

方法总结

野生型和硒亚硫基蛋白在大肠杆菌并使用Ni-NTA和尺寸排除色谱进行纯化。晶体以吊滴、蒸汽扩散的形式生长。衍射数据是从先进光子源（阿贡国家实验室）光束线21-IDG处的低温保护晶体中收集的。的结构酿酒酵母Get3与ADP·AlF络合4−使用PHENIX通过含硒蛋氨酸蛋白质的单波长异常分散（SAD）测定33.无核苷酸的结构酿酒酵母和S.pombe公司通过PHASER中的分子替换解决了Get334一种单体酿酒酵母获取3–ADP·AlF4−复合物（去掉核苷酸和α-螺旋亚结构域）作为搜索模型。使用PHENIX进行精炼和建模33和COOT35。

一系列GET3公司通过Quik-Change突变产生含有位点特异性突变的基因。每个突变体的身份通过DNA测序确认。蛋白质表达于大肠杆菌并通过Ni-NTA色谱纯化。TA底物结合通过自然下拉试验进行监测，其中全长35在含有或不含有重组野生型或突变Get3蛋白的TRC40缺失的网织红细胞裂解物翻译提取物中翻译S-标记的人SEC61β。翻译后，在自然条件下免疫沉淀Get3，通过SDS-PAGE分析，并通过磷光成像定量。用NADH偶联微孔板光度法测定Ni-NTA纯化蛋白的ATP酶活性36,37

野生型和突变型GET3公司在中等强度、组成性ACT1启动子的控制下，将基因亚克隆到低拷贝数的URA质粒中，并转化为Δ获得3菌株（开放生物系统）；将每个转化子的系列稀释液（以及野生型和仅载体对照）置于补充100μg ml的合成定义培养基（−尿嘧啶）上−137°C下放置2天后，对潮霉素B板进行拍照。

方法

蛋白质的克隆、表达和纯化。

编码全长的基因酿酒酵母和S.pombe公司使用基因组DNA通过PCR扩增Get3，并将其亚克隆到pET28衍生物（Novagen）中，该衍生物经修饰后在N末端6×His标签和多聚体之间包含烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶裂解位点。蛋白质表达于大肠杆菌在细胞达到A类600约0.6。使用高压微流器（Avestin）在裂解缓冲液（50mM Tris，pH 7.5，500mM NaCl，5mMβ-巯基乙醇，10mM咪唑，10%甘油和1mM PMSF）中破坏细胞。通过离心清除后，通过镍亲和层析（Ni-NTA His Bind Resin，Novagen）对上清液进行分批纯化，并透析成10 mM Tris、pH 7.5、100 mM NaCl、2 mM二硫苏糖醇（DTT）、40%甘油。随后，选择性地用6×His-tagged TEV蛋白酶进行切割，并通过消减Ni-NTA纯化去除剩余的未经分离的Get3和6×His标记的TEV蛋白酶。为了结晶，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质（Superdex 200 10/300 GL，GE Healthcare）。将分数合并，浓缩至约10 mg ml−1在10 mM Tris、pH 7.5、100 mM NaCl和2 mM DTT中，并在−80°C下储存。硒代亚砜酿酒酵母通过反馈抑制制备Get3蛋白39在BL21（DE3）细胞（Novagen）中使用隔夜快速自动诱导系统2（Novagen）。通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱法确认硒代蛋氨酸的掺入。硒代亚砜Get3以与天然蛋白相同的方式纯化。

结晶。

6×His-tagged晶体酿酒酵母Get3与ADP·AlF络合4−通过混合等体积的含有2 mM ADP、2 mM MgCl的蛋白质溶液，在室温下使用悬挂滴蒸气扩散法生长2，2 mM氯化铝三和8 mM NaF，使用含有33%PEG 3350、0.1 M Tris、pH 8.4、0.2 M醋酸铵和75 mM酒石酸钠/钾的储层溶液。将等体积的蛋白质溶液与31%PEG 3350、0.1 M Tris、pH 8.4、0.2 M醋酸铵和50 mM甘氨酸混合，在类似条件下生长含硒蛋氨酸晶体。晶体在30%PEG3350、0.1 M Tris、pH 8.4、0.2 M醋酸铵、75 mM酒石酸钠/钾、2 mM ADP、2 mM-MgCl中进行低温保护2，2 mM氯化铝三，8 mM NaF和20%乙二醇（天然）或31%PEG3350，0.1 M Tris，pH 8.4，0.2 M醋酸铵，50 mM甘氨酸，2 mM ADP，2 mM-MgCl2，2 mM氯化铝三8 mM NaF和20%甘油（硒），并在液氮中快速冷冻。

晶体S.pombe公司通过将等体积的蛋白质溶液与含有25%PEG 3350、0.1 M MES、pH 6.5和0.4 M MgCl的储备溶液混合，在室温下使用悬挂滴蒸气扩散法生长Get3（裂解）2直接收集晶体并在液氮中进行闪速冷冻

6×His-tagged晶体酿酒酵母通过将等体积的蛋白质溶液与含有1.5 M硫酸铵、0.1 M MES、pH 6.5、0.1 M NaCl、5 mM脯氨酸和0.2 mM C的储备溶液混合，在室温下使用吊滴蒸汽扩散法生长Get3（apo）12E类8晶体在2 M硫酸铵、0.1 M MES、pH 6.5、0.1 M氯化钠、5 mM脯氨酸和25%甘油中冷冻，并在液氮中闪速冷冻。

结构确定和细化。

在100K的APS光束线21-IDG处收集天然和硒的SAD数据(λ=0.97856），并使用HKL2000（HKL Research）进行处理。数据收集统计信息列于补充表1。

的结构酿酒酵母与ADP·AlF复合物中的Get34−由SAD决定。使用PHENIX定位不对称单元中52个硒位点中的38个33经过相位调整和密度调整后，得到的电子密度图质量很高，允许我们手动放置四份Get3拷贝（使用ArsA的核心ATP酶区域作为起始模型），并显示活性位点中核苷酸的清晰密度。将本地数据设置为2.0º，用于COOT的模型重建和优化35和PHENIX。最终模型包含两个Get3同源二聚体，四个Mg2+ADP·AlF4−复合物，两个锌原子和507个水分子，并被精炼为R（右）-系数（R自由的)17.6%（21.3%）。对于链A中的残基1-4、101–120、191–211、279–284、353和354，未观察到电子密度；链条B中的1–3、106–125、154–158、194–209、280–284和351–354；链C中的1-4、100-125、153-158、189-212、278-284和352-354；链D中的1–4、105–117、152–159、192–211、282–284、353和354。

无核苷酸的结构S.pombe公司通过PHASER分子替换测定Get3为3.0º34使用单体酿酒酵母Get3（去掉α-螺旋子域）作为搜索模型（58%的序列一致性S.pombe公司). 尽管这些晶体衍射相对较差，但六倍NCS平均得到了可解释的电子密度图。使用COOT和PHENIX进行模型构建和改进（带有NCS约束）。最后的模型包含三个Get3同源二聚体和三个锌原子，并通过严格的NCS约束对其进行了改进R（右）自由的23.7%（28.8%）。侧链密度通常在α-螺旋子域中最弱，对于每条链中的残基1-6、101-108、191-195和323-329，未观察到可解释的电子密度。

无核苷酸的结构酿酒酵母使用PHASER通过分子替换测定Get3。使用酿酒酵母Get3或S.pombe公司无核苷酸开放二聚体作为搜索模型（去掉α螺旋亚结构域）。四倍NCS平均后计算的初始电子密度图清楚地确定了每个单体核心ATP酶结构域的方向，并使用差异图确认二聚体界面上存在锌(补充图2b). α-螺旋子域中也观察到螺旋特征，包括α6、α7和α9的部分。尽管酿酒酵母载脂蛋白结构显示了在S.pombe公司apo结构(补充图2c)，因为这些晶体衍射微弱（到3.8º)而且各向异性方面，没有尝试对模型进行细化。

中列出了优化统计信息补充表1手稿中的所有结构图都是使用Pymol生成的40和COOT。

定点突变体的制备。

站点定向酿酒酵母使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）生成Get3突变体，并通过DNA测序进行验证。蛋白质表达在大肠杆菌如前所述，除了细胞在25°C下生长并诱导过夜。所有突变体均高水平表达。除了Ala101Asp（不溶）外，野生型和突变型蛋白在非变性条件下（如上所述）通过镍亲和层析一步纯化，并透析到10mM Tris、pH 7.5、100mM NaCl、2mM DTT和40%甘油中。使用Bradford蛋白质分析（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，通过计算A类280消光系数。

Get3 TA底物相互作用下拉分析。

全长35在含或不含Get3（或突变Get3）蛋白的苯基缺失兔网织红细胞裂解物翻译提取物（见下文）中，以50μg ml的浓度合成S标记的人SEC61β−1在32°C下平移15分钟后，立即将反应物置于冰上。在每个反应中，添加2.5μl抗Get3血清，在冰上培养30分钟，并用冰镇下拉缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，150 mM醋酸钾和2 mM醋酸镁）稀释至1 ml。添加10微升Protein-A琼脂糖（BioRad），在4°C下用端对端混合培养90分钟，并用下拉缓冲液冲洗3×1 ml。免疫沉淀产物通过SDS-PAGE分析并通过磷光成像定量。

每个实验都包括一个没有Get3的反应，以评估背景下拉的程度。从所有样本中减去该值。野生型Get3被任意设置为100%下拉。每个值是在不同日期进行的三到六次独立测量的平均值。误差条表示s.e.m.考马斯染色证实，多克隆抗Get3抗体拖曳了等量的所有Get3突变体，表明位点特异性突变不影响抗体结合。

苯基缺失翻译提取物的制备。

通过重力将补充有翻译所需所有成分的兔网织红细胞裂解物通过高度取代的苯基-葡萄糖苷柱（GE/Amersham）。柱体积是裂解液体积的三分之一（通常分别为200和600 ml）。未收集过流的前缘和后缘。仅收集含有未稀释裂解物的峰值过流部分（，~400μl），并将其冷冻在液氮中的小份中，并储存在−80°C下。以这种方式制备，裂解物中TRC40的消耗量超过98%，但保留了全部翻译能力。考马斯染色显示，95%或更多的蛋白质没有受到缺失的影响。

ATP酶测定。

ATP酶活性在30°C下使用微量板光度法测定，其中ATP水解与NADH氧化偶联36,37.分析缓冲液含有50 mM Tris，pH值7.5，20 mM NaCl，5 mM MgCl2，1 mM DTT，5%甘油，0.02%n个-十二烷基-β-D类-麦芽吡喃糖苷、4.5 mM磷酸烯醇式丙酮酸盐、8.0 U乳酸脱氢酶（Sigma）、6.3 U丙酮酸激酶（Sigma-）、0.3 mM NADH和2μM Get3（野生型或突变型），并在200 ml的最终反应体积中进行反应。通过添加ATP启动反应，并在340 nm处用分光光度法跟踪NADH浓度的降低。使用100至400 s之间的线性稳态速率计算五最大值和表观Km、 列车自动防护系统使用NADH的路径长度校正摩尔消光系数的值。通过非线性回归将数据拟合到Michaelis–Menten方程，确定动力学参数。所有测量均一式三份。

酵母生长试验。

野生型和突变型GET3公司在中等强度、组成性ACT1启动子的控制下，将基因亚克隆到低拷贝数的URA质粒中，并转化为Δ获得3菌株（开放生物系统）。将每个转化体的系列稀释液（以及野生型和仅载体对照）点到补充有100μg/ml的合成限定培养基（−尿嘧啶）上−137°C下放置2天后，对潮霉素B板进行拍照。

补充材料

1

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致谢

数据是在阿贡国家实验室先进光子源（APS）的21-IDG和23-IDD光束线收集的，我们感谢光束线工作人员的支持。APS的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室的支持，合同编号为DE-AC02–06CH11357。我们感谢B.Glick和R.Strack的试剂和建议，感谢X.Li的分析表征，感谢A.Shiau和T.Steck对手稿的评论。这项工作得到了Edward Mallinckrodt，Jr.基金会（给R.J.K.）和美国国立卫生研究院院内研究计划（给R.S.H.）的资助。

脚注

完整的方法任何相关的参考文献都可以在论文的在线版本中找到，网址为www.nature.com/nature（自然）。

补充信息链接到该论文的在线版本www.nature.com/nature（自然）。

工具书类

1Egea PF、Stroud RM和Walter P靶向膜蛋白：信号识别颗粒的结构。货币。操作。结构。生物 15, 213–220 (2005). [公共医学][谷歌学者]
2Keenan RJ、Freymann DM、Stroud RM和Walter P信号识别粒子。年。生物化学评论 70, 755–775 (2001). [公共医学][谷歌学者]
三。拉波波特TA真核生物内质网和细菌质膜上的蛋白质易位。自然 450, 663–669 (2007). [公共医学][谷歌学者]
4Beilharz T、Egan B、Silver PA、Hofmann K和Lithgow T二分信号介导尾锚定膜蛋白的亚细胞靶向性酿酒酵母。生物学杂志。化学 278, 8219–8223 (2003). [公共医学][谷歌学者]
5Kalbfleisch T、Cambon A和Wattenberg BW用生物信息学方法鉴定人类基因组中的尾锚定蛋白。交通 8, 1687–1694 (2007). [公共医学][谷歌学者]
6Borgese N、Brambillasca S和Colombo S尾巴如何引导尾部锚定的蛋白质到达目的地。货币。操作。细胞生物学 19, 368–375 (2007). [公共医学][谷歌学者]
7Wattenberg B&Lithgow T公司靶向C末端（尾部）锚定蛋白：了解细胞质活动如何锚定到细胞膜。交通 2, 66–71 (2001). [公共医学][谷歌学者]
8Kutay U、Ahnert-Hilger G、Hartmann E、Wiedenmann B和Rapoport TA突触素通过插入内质网膜的新途径的转运途径。欧洲工商管理硕士J 14, 217–223 (1995).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Favaloro V、Spasic M、Schwappach B和Dobberstein B尾锚定（TA）蛋白膜插入的不同靶向途径。细胞科学杂志 121, 1832–1840 (2008).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Stefanovic S&Hegde RS公司翻译后膜蛋白插入内质网靶向因子的鉴定。单元格 128, 1147–1159 (2007). [公共医学][谷歌学者]
11库尔迪·海达尔B等。细菌亚砷酸盐转运蛋白arsA组分ATP-结合人类同源物的分离。基因组学 36, 486–491 (1996). [公共医学][谷歌学者]
12Kurdi-Haidar B、Heath D、Aebi S和Howell SB人亚砷酸盐刺激ATP酶（hASNA-I）的生化特性。生物学杂志。化学 273, 22173–22176 (1998). [公共医学][谷歌学者]
13Rosen BP、Bhattacharjee H、Zhou T和Walmsley ARArsA-ATP酶的作用机制。生物化学。生物物理学。学报 1461, 207–215 (1999). [公共医学][谷歌学者]
14舒尔迪纳M等。GET复合物介导尾锚定蛋白插入内质网膜。单元格 134, 634–645 (2008).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Leipe DD、Wolf YI、Koonin EV和Aravind LP-loop GTPases及相关ATP酶的分类和进化。分子生物学杂志 317, 41–72 (2002). [公共医学][谷歌学者]
16Zhou T、Radaev S、Rosen BP和Gatti DLArsA-ATP酶的结构：重金属抗性泵的催化亚单位。欧洲工商管理硕士J 19, 4838–4845 (2000).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17乔治亚迪斯MM等。固氮酶铁蛋白的结晶结构长春固氮菌。科学类 257, 1653–1659 (1992). [公共医学][谷歌学者]
18Leonard TA、Butler PJ和Lowe J细菌染色体分离：Soj二聚体的结构和DNA结合——一种保守的生物开关。欧洲工商管理硕士J 24, 270–282 (2005).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Hayashi I、Oyama T和Morikawa KMinD ATP酶的结构和功能研究：对细菌细胞分裂装置分子识别的启示。欧洲工商管理硕士J 20, 1819–1828 (2001).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Freymann DM、Keenan RJ、Stroud RM和Walter P信号识别粒子保守GTPase结构域的结构。自然 385, 361–364 (1997). [公共医学][谷歌学者]
21Montoya G、Svensson C、Luirink J和Sinning I信号再认知颗粒受体FtsY NG结构域的晶体结构。自然 385, 365–368 (1997). [公共医学][谷歌学者]
22Metz J、Wachter A、Schmidt B、Bujnicki JM和Schwappach B当细胞溶质中有铜时，酵母Arr4p ATP酶结合氯化物转运蛋白Gef1p。生物学杂志。化学 281, 410–417 (2006). [公共医学][谷歌学者]
23Keenan RJ、Freymann DM、Walter P&Stroud RM信号识别粒子信号序列结合亚基的晶体结构。单元格 94，181–191（1998年）。[公共医学][谷歌学者]
24姜瑜等。ArsA-ATP酶核苷酸结合域的非等效性。生物学杂志。化学 280, 9921–9926 (2005). [公共医学][谷歌学者]
25Schindelin H、Kisker C、Schlessman JL、Howard JB&Rees DCADP·AIF 4−稳定固氮酶复合物的结构及其信号转导意义。自然 387，第370–376页（1997年）。[公共医学][谷歌学者]
26弹簧SRG蛋白机制：来自结构分析的见解。年。生物化学评论 66, 639–678 (1997). [公共医学][谷歌学者]
27Gasper R、Meyer S、Gotthardt K、Sirajuddin M和Wittinghofer A探戈需要两个人：通过二聚体调节G蛋白。自然修订版分子细胞生物学 10, 423–429 (2009). [公共医学][谷歌学者]
28Zhou T、Radaev S、Rosen BP和Gatti DL四个区域的构象变化大肠杆菌ArsA-ATP酶将ATP水解与离子转运联系起来。生物学杂志。化学 276, 30414–30422 (2001). [公共医学][谷歌学者]
29伯恩斯坦HD等。信号识别颗粒54K亚基氨基酸序列的信号序列识别模型。自然 340,482–486(1989). [公共医学][谷歌学者]
30Horie C、Suzuki H、Sakaguchi M和Mihara K将C-尾锚定蛋白导向哺乳动物线粒体外膜的信号特征。分子生物学。单元格 13, 1615–1625 (2002).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31考夫曼T等。指示Bcl-x的信号特征L（左）而不是Bcl-2到线粒体外膜。细胞生物学杂志 160, 53–64 (2003).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32黑田R等。羧基末端的带电氨基酸决定了细胞色素b5的两种亚型在细胞内的位置。生物学杂志。化学 273, 31097–31102 (1998). [公共医学][谷歌学者]
33亚当斯PD等。PHENIX：构建新的自动晶体结构测定软件。水晶女演员。D类 58，1948年至1954年（2002年）。[公共医学][谷歌学者]
34McCoy AJ、Grosse-Kunstleve RW、Adams PD和Winn MD相位晶体学软件。J.应用。结晶器 40, 658–674 (2007).[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35埃姆斯利·普考坦KCoot：分子图形的建模工具。水晶女演员。D类 60, 2126–2132 (2004). [公共医学][谷歌学者]
36Kiianitsa K、Solinger JA和Heyer WDNADH偶联微板光度法研究低、高比活性ATP水解酶的动力学。分析。生物化学 321, 266–271 (2003). [公共医学][谷歌学者]
37Vogel G&Steinhart R公司的ATP酶大肠杆菌：从分离的亚单位中纯化、分离和重组活性复合物。生物化学 15, 208–216 (1976). [公共医学][谷歌学者]

工具书类

38范登伯格B等。蛋白质传导通道的X射线结构。自然 427, 36–44 (2004). [公共医学][谷歌学者]
39Van Duyne GD、Standaert RF、Karplus PA、Schreiber SL和Clardy J人免疫亲和素FKBP-12与FK506和雷帕霉素复合物的原子结构。分子生物学杂志 229, 105–124 (1993). [公共医学][谷歌学者]
40德拉诺WLPyMOL分子图形系统〈http://www.pymol.org〉 (2002).