跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
分子生物学细胞。2002年1月；13(1): 195–210.
数字对象标识：10.1091/mbc.01-05-0221
预防性维修识别码：PMC65082型
PMID：11809833

三元复合体的证据（eIF2-GTP-tRNA）我遇见)–预启动不足复合物是哺乳动物应激颗粒的核心成分

南希·凯德莎,*† 萨曼莎·陈,† 娜塔莉·吉尔克斯,† 魏丽,† 伊拉·米勒,‡ 约阿希姆·斯塔尔,§和保罗·安德森*†
马文·P·威金斯，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

环境胁迫诱导的eIF2α磷酸化抑制通过减少蛋白质的可用性来翻译蛋白质eIF2-GTP-tRNA我Met，连接引发剂的三元络合物tRNA遇见43S预引发复合物。产生的结果未翻译的mRNA动态地传递到离散的细胞质病灶称为应力颗粒（SG），该过程需要相关的RNA结合蛋白TIA-1和TIAR。SG似乎在与多聚体平衡，但这种关系的本质是模糊的。我们现在表明，48S预引发的大多数成分复合物（即小但不大的核糖体亚基，eIF3，eIF4E，eIF4G）被协调地募集到亚砷酸盐应激细胞中的SG。在相反，eIF2不是新组装的SG的组件。细胞表达eIF2α组装SGs的磷酸化突变体（S51D）相似的构成，证实了这些因素的招聘是翻译起始受阻的直接后果，而且是不应该的对亚砷酸盐的其他影响。令人惊讶的是，磷酸化eIF2α被招募到正在从砷化物诱导的应激。我们将在TIA和eIF2起作用的平移检查点模型翻译起始的拮抗剂，其中缺乏三元复杂驱动SG组件。

简介

应激颗粒（SG）是离散的细胞质病灶非翻译mRNA在受环境影响的细胞中积累应力(诺维尔等。, 1983,1989;沙尔夫等。,1998;凯德莎等。, 1999,2000). 在哺乳动物细胞中SGs的组装由eIF2α的磷酸化启动(凯德莎等。, 1999)，翻译起始因子将启动子tRNA加载到小核糖体亚单位上（审核人贝兰加等。, 1998;格雷和威金斯，1998年).eIF2α磷酸化抑制蛋白质翻译并促进非翻译mRNA的积累(法雷尔等。, 1977;斯里瓦斯塔瓦等。, 1998). 相关RNA-结合蛋白TIA-1和TIAR作用于eIF2α磷酸化的下游招募这些未翻译的mRNA到SG(凯德莎等。,1999). 通过从翻译机械，已经提出了SG来确定应力诱导的平移阻滞(凯德莎等。, 1999).因为热休克记录不包括在热休克植物细胞(诺维尔等。, 1983)，这个机制可能在一定程度上解释了应激细胞中的热休克转录物。

虽然SGs mRNA的隔离可能有助于压力诱导的转化阻滞，SG不是被动储存库非翻译mRNA。药物稳定或在SGs的组装表明mRNA可以在多聚体和SG公司(凯德莎等。, 2000). 尽管mRNA的表达速率尚未直接测量SG的进出情况，聚（A）+结合蛋白I（PABP-I），一种聚（A）+RNA快速穿梭进出SG（～每20秒更换50%SG相关PABP-I）。这个TIA-1的往返速度比PABP-I快约10倍（约50%SG相关TIA-1每2秒更换一次）。考虑到这些动力学，并考虑到TIA-1的显性阴性突变防止SG组装(凯德莎等。, 1999)，它TIA-1似乎将未翻译的mRNA护送至SG。动态SG相关mRNA和蛋白的穿梭使我们假设SG可能是mRNA分类的位点，未翻译的mRNA在这里被分类并进行重新初始化、降解或包装稳定的非多聚体信使核糖核蛋白（mRNP）复合物(凯德莎等。, 2000).

磷酸化-eIF2α将信使核糖核酸从多聚体驱动到SGs的能力提示翻译起始受损可能导致SG的组装。SG蛋白的高度动态特性由绿色光漂白后荧光回收率的测定荧光蛋白（GFP）-TIA-1和GFP-PABP提示完整SG的纯化可能是不可能的。因此，我们使用免疫荧光显微镜检查是否已知翻译引发因子是SG的组成部分。除了eIF2，48S预引发复合物的成分（即eIF3、eIF4E、eIF3G、，核糖体亚单位）被选择性地招募亚砷酸盐或eIF2α（S51D）诱导的SG。SG也可能由在不诱导eIF2α的条件下的能量饥饿磷酸化，表明SG组装的近端触发可能是可用性降低eIF2-GTP-tRNA我遇见而不是eIF2α磷酸化本身。我们提出了一个模型，其中eIF2缺乏48STIA-1/TIAR将组装在应激细胞中的复合物招募到SG。

材料和方法

单元格行

COS7和DU145细胞系来自American Type培养物收集（Rockville，MD）并在含有10%胎儿的DMEM中培养一氧化碳中的牛血清2培养箱使用7%CO2.

抗体和试剂

抗TIA-1/R杂交瘤（3E6）在我们的实验室中作为如前所述(托潘等。, 1995). 抗体抗血凝素（HA）是从伯克利抗体中获得的（加利福尼亚州伯克利）。抗磷酸化eIF2α和HSP27抗体从StressGen Biotechnologies（不列颠哥伦比亚，维多利亚，加拿大）。针对磷酸化eIF2α的不同多克隆抗体是从Research Genetics（美国亚利桑那州亨茨维尔）获得结果与使用StressGen抗体获得的结果一致。单克隆抗eIF4E、eIF4G和eIF5的抗体从转导实验室（肯塔基州列克星敦）。多克隆亲和力纯化山羊抗TIA-1、eIF-2α和eIF4G抗体和兔抗eIF5抗体从圣克鲁斯生物技术公司获得（加利福尼亚州圣克鲁斯）。兔抗PHAS-I抗体（eIF4E-BP）为从Zymed实验室（加利福尼亚州南旧金山）获得。人类抗核糖体P抗原的自身抗血清是从ImmunoVision（阿根廷斯普林代尔）。亲和纯化山羊多克隆针对eIF3的抗体是John Hershey（美国大学加利福尼亚州戴维斯市戴维斯市）。Anti-HuR是Imed送的一份礼物Gallouzi（耶鲁大学，康涅狄格州纽黑文）。反异质核核糖核蛋白（hnRNP）C和抗PABP（单克隆10E10）是一种吉迪恩·德雷福斯（宾夕法尼亚大学Medicine，宾夕法尼亚州费城）。抗eIF-2α单克隆抗体是Richard Panniers博士（美国国立科学院健康，马里兰州贝塞斯达）。针对eIF2Bε的抗体非常丰富由Scot Kimball（宾夕法尼亚州立大学学院Medicine，宾夕法尼亚州好时）。亲和纯化抗体核糖体亚基蛋白S3a和S19如前所述(卢奇等。, 1990). 亲和纯化抗体核糖体蛋白L5和L37是从用纯化蛋白免疫的兔子（L5）或绵羊（L37）大鼠肝脏核糖体。抗血清用35%的铵进行分级硫酸盐沉淀，用磷酸盐缓冲盐水透析（PBS），并针对与Sepharose结合的核糖体蛋白进行纯化。这个在PBS中使用3.0 M硫氰酸钠洗脱结合抗体，针对PBS进行透析，并通过纯化核糖体亚单位的免疫印迹。二级抗体偶联物（驴抗小鼠、兔、山羊或人；所有ML级）与Cy2或Cy3缀合杰克逊免疫研究实验室（宾夕法尼亚州西格罗夫）。亚砷酸钠，寡霉素、2-脱氧葡萄糖、羰基氰化物第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP）、依米汀、，二苯碘氯化铵（DPI）和嘌呤霉素购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。

免疫荧光和原位荧光染色

细胞生长在盖玻片上，用亚砷酸盐或其他物质处理药物如图中图例所示，固定并染色如前所述的蛋白质(凯德莎等。, 1999)，或加工用于荧光原位聚合（A）+核糖核酸检测结合免疫荧光蛋白检测。对于原位染色，细胞固定在4%多聚甲醛中，固定后并在无水甲醇中渗透，用50 mM平衡Tris缓冲液pH值7.5。将细胞杂交到末端标记的生物素化寡核苷酸（50个核苷酸；Invitrogen，Carlsbad，CA）通过使用商用试剂盒（mRNA定位器-Hyb试剂盒；Ambion，德克萨斯州奥斯汀），在45°下放置4小时。使用提供的缓冲液清洗后在试剂盒中，用含0.1%的2×SSC平衡细胞Triton X-100（Sigma），补充山羊抗体抗TIA-1（Santa Cruz Biotechnology）并含有Alexa-594–标记链霉亲和素（分子探针，尤金，俄勒冈州）稀释1/2000。1小时后孵育，细胞在2×SSC中清洗，然后孵育1驴抗羊Cy抗体（1/200稀释）中的h和0.5μg/ml赫赫斯特染料。清洗并安装细胞，观察标本使用尼康Eclipse 800显微镜。图像被数字捕获使用电荷耦合设备-SPOT RT数码相机，并使用编译Adobe Photoshop软件（5.5版；Adobe Systems，Mountain View，加利福尼亚州）。

蔗糖梯度分析

DU145细胞被镀，并在镀后48小时内使用约90%汇合。单层用Hanks平衡盐洗涤溶液，在含有10μg/ml环己酰亚胺5min，然后刮取离心分离。在0.5 ml冰镇裂解缓冲液（140）中对颗粒进行裂解mM KCl、1 mM二硫苏糖醇、20 mM Tris pH值8、5 mM氯化镁2，0.5%NP-40，0.5 U/ml RNAsin[Promega，威斯康星州麦迪逊市]，10 mM环己酰亚胺），含蛋白酶抑制剂（1mM苯甲基磺酰氟、5μM亮氨酸肽、5 mM苯甲脒、5μg/ml抑肽酶）、磷酸酶抑制剂（1.0 mM钒酸钠和50 mM氟化钠）和0.5 mM GMP-PNP（罗氏分子印第安纳波利斯生化公司）。细胞悬浮液是机械性的使用特氟隆玻璃匀浆器低速12次冲程中断在冰上。核以低速造粒，核后上清液在14,000 ×克.然后将所得上清液分层在预制的10-47%线性蔗糖梯度上（140 mM组成氯化钾、1 mM二硫苏糖醇、20 mM三氯化氢、pH值8、5 mM氯化镁2)超过60%–0.5毫升蔗糖缓冲11-ml试管。以40000 rpm的转速离心2小时45通过使用Beckman SW40Ti转子，最小值为。梯度从顶部洗脱使用Brandel洗脱系统（马里兰州盖瑟斯堡Brandel）。这个使用ISCO UA5 UV在254 nm处连续监测洗脱液显示器（ISCO，Lincoln，NE）。从梯度。单个馏分的等分样品为丙酮沉淀以去除蔗糖并浓缩样品，在SDS样品缓冲液中重新悬浮，并进行蛋白质印迹处理分析。

质粒构建

编码野生型和突变体eIF2α的质粒（S51D）是Randal Kaufman博士（密歇根大学安娜堡分校，MI）。每个质粒的编码区在框架中克隆到采用聚合酶链反应（PCR）策略构建pMT2-HA载体。这个从PETF-VA-eIF2αwt或PETF-VA-eIF2S51D扩增编码区突变30个周期（94°C 1分钟，50°C 1 min，74°C持续1分钟），使用Tli聚合酶（Promega）和具有生态RI和Xba公司我克隆网站（GGGATTCATGCCGGGTCTATAGTAGATTTTA和GCTCTAGATTCATCTTCAGCTTGGCT），分别是。插入物是用生态RI和Xba公司我在pMT2中使用HA标记进行了帧内克隆类似的切割。通过以下方法获得编码pCDNA3-HA-eIF2β的质粒用PCR扩增pGEX-2T-eIF2β的编码区Supratik Das博士和Umadas Maitra博士（阿尔伯特·爱因斯坦学院纽约州布朗克斯市叶希瓦大学医学博士）CGCGGATCACATGTGTGGGACGAGATG和CCGGAATTTTAGTTAGCTTTGGCACG。PCR该产品被克隆到pCDNA3框架中，N末端HA标签位于这个巴姆HI和生态RI站点。质粒编码pCDNA3 HA-eIF3p48/int6通过框架内连接到pCDNA3中构建的N端HA克拉我修改过的高保真pfu聚合酶放大开放阅读框（ORF），从第二个开始密码子，使用人PBL cDNA和引物AGAGAGATCGATCCTACTGGACTTTGATTCG和AGAGA GATCGATAC-CGAGACAGTGGCAGCT。通过测序验证最终克隆。

COS细胞转染

使用SuperFect（QIAGEN，Valencia，CA）根据制造商的说明。电池镀入六孔板（2×105细胞/接种良好转染前20 h）转染2-4 h，然后胰蛋白酶化并重新植入平行板进行免疫荧光（24孔板，包含11-mm盖玻片）。

结果

小而非大的核糖体亚单位是SG的组成部分

应激诱导的翻译起始磷酸化因子eIF2α对蛋白质翻译有深远影响。尽管大多数信使核糖核酸的翻译减少，信使核糖核酸的翻译热休克蛋白和应激诱导转录因子的编码（例如，酵母中的GCN4和哺乳动物中的ATF4；Hinnebusch，1996年,1997;哈丁等。, 2000)是为了响应磷酸化eIF2α。在植物细胞中，积累的非翻译mRNA在热应激状态下，细胞集中于离散的细胞质病灶称为热休克颗粒(诺维尔等。, 1989). 在哺乳动物细胞，聚（A）+RNA在相似的细胞质病灶对环境胁迫的反应(凯德莎等。, 1999). 哺乳动物是否SG是将未翻译的mRNA从所选mRNA的翻译机器或场所在压力下积极转换。要区分这些可能性，我们使用双色免疫荧光显微镜确定核糖体是否为哺乳动物SG的成分。使用抗体反应检测砷胁迫的DU145细胞TIA-1/R和核糖体蛋白S3/3a（图​（图1A），1A） ，核糖体蛋白S19（图​（图1B），1B） ，核糖体蛋白L5（图​（图1D），1D） ，核糖体蛋白L37（图​（图1E），1E） ，或核糖体蛋白Po（图​（图1F）。1F） ●●●●。如前所述，亚砷酸盐治疗导致大多数细胞质TIA-1和TIAR积聚这些电池中的SG（图​（图1，1、A、B、D–F；顶部，绿色）。成对出现对小核糖体特异性抗体的相同领域的看法亚单位蛋白S3/3a和S19（图​（图1，1、A和B；中间，红色）显示大量小核糖体亚单位积累在TIA-1/R+SG（黄色箭头；合并视图如底部面板所示）。小核糖体亚基的子集SG中的存在也与eIF3一致（图​（图1C，1C、 绿色），表明在SG中发现的小核糖体亚单位是预引发复合物的组分。与这个概念一致，大核糖体亚单位（L5、L37和Po）的成分不TIA-1/R累积+蒸汽发生器（图​（图1，1，D–F；中间，红色）。合并的视图（图​（图1，1，底部）确认缺席TIA-1/R大核糖体蛋白+SG公司（箭头显示绿色SG）。这些结果表明核糖体亚基不是很大，是哺乳动物SG的组成部分。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为mk0121717001.jpg

核糖体亚基较小，但不是较大招募到SG。将DU145细胞暴露于1 mM亚砷酸钠中30分钟，允许恢复2小时，以产生最大SG大小。固定细胞并对其进行TIA-1染色以显示SG（绿色，面板A、B、D、E和F），并用亲和纯化进行复染抗不同核糖体蛋白的抗体：核糖体蛋白质S3/3a（A和C，红色）、核糖体蛋白S19（B，红色）和核糖体蛋白质L5（D，红色）和核糖体蛋白L37（E，红色）。（F） 的本地化使用人类自身抗血清检测核糖体Po蛋白（红色）。使用eIF3亲和纯化抗血清来揭示eIF3（C，绿色）与SG相关核糖体S3/3a的共定位（C，红色）。黄色箭头表示核糖体蛋白募集到SG；白色箭头表示大核糖体亚单位对应的SG不招募蛋白质。棒材，20μm。S20提取物沉淀对照组（G）与亚砷酸盐处理的（H）DU145细胞在10–47%蔗糖梯度，从顶部洗脱，洗脱外径处的剖面254已录制。收集分数通过使用抗体进行SDS-PAGE和Western印迹小型部件（例如S3/S3a和S19）或大型部件（例如L5、L37、，和Po）核糖体亚单位，以及eIF4成分eIF4E、TIA-1，和eIF3。

解决TIA-1是否与小型核糖体亚单位使用生化方法，我们分离了裂解物在无亚砷酸盐或有亚砷酸钠（0.5）的情况下培养的DU145细胞mM，30 min），并分析个体存在大小核糖体亚单位eIF3的组分，eIF4E和TIA-1。对照细胞裂解产物产生紫外线254吸光度曲线包含对应于40S和60S核糖体的预期峰值亚单位和完整的80S核糖体（图​（图1G）。1G） ●●●●。分数位于密度越高，包含的多聚体既有小的也有大的核糖体亚单位（组分12-16）。在由亚砷酸盐处理的细胞、多聚体已经完全分散80S峰值相应增加。两者的主要部分eIF4E和TIA-1存在于未进入的可溶性物质中梯度，但每种蛋白质都含有大量含有40–60S核糖体亚单位的组分（图​（图1，1、G和H，分数4-6）。如预期的颗粒的蛋白质成分质量约为60万(好时（Hershey）等。, 1996)，eIF3p110不是在梯度顶部的可溶性蛋白质中发现（即分数1). 大约一半的eIF3出现在分数2和3中，显然不是与预引发复合物有关。剩下的大部分eIF3是存在于组分4和5中，与小核糖体亚基一致。令人惊讶的是，所有这些蛋白质在亚砷酸盐诱导的蔗糖梯度没有显著改变氧化应激，尽管其重新定位为SG（图​（图1，A–C）。1,A–C）。虽然我们不知道SG是否保持其结构细胞分馏和蔗糖梯度过程中的完整性离心分离，仅含有所有SG成分的馏分为粒级4和5，沉积于～50S。如果SG的子集成分在蔗糖梯度离心中存活，这些成分可能会迁移到48S预启动的预期位置复杂。

选择性招募48S启动前复合体的组成部分至SG

大核糖体亚单位的缺失消除了这种可能性SG是压力下的特权翻译网站。因为只有eIF3共定位部分的总可检测小核糖体亚单位与SG相关，我们推断SG相关的小核糖体亚基可能代表48S起始前复合物（包括mRNA和小的，但不包括大型核糖体亚单位）。因此，我们使用免疫荧光显微镜下比较TIA-1或TIAR公司+SG和单个组件应力砷化物中的平移起始装置（0.5 mM，1h） DU145电池。在图中所示的调查中​图22和​和3，这个三,顶部面板显示了TIA-1/R的本地化+SG（绿色）。在相同字段的成对视图中，中间面板显示所示翻译起始因素的定位（红色）。底部面板显示合并的图像。箭头表示TIA-1型+起始因子为的SG在成对视图中招募，而箭头表示TIA-1型+指定翻译的SG未招募起始因子。该分析表明eIF3，eIF4E、eIF4G、RNA结合蛋白HuR和聚（A）+RNA高度集中于SG，而eIF-2α、eIF5、PHAS-I/eIF4E-BP1、HSP27和eIF2Bε不在SG处累积。HSP27，其先前被证明存在于热休克诱导SG不是亚砷酸盐诱导SG的组成部分（图​（图3B，三B、 红色）。为了确保抗体特异性使用商业抗体对抗eIF-4E和eIF-4G，并给予相同的结果（我们未公布的数据）。确认eIF3，但不确认eIF2是SG的一个组成部分，我们构建了编码HA-eIF2α、HA-eIF2β和HA-p48/int-6（eIF3的一个亚单位），以便使用相同的抗HA抗体检测这些不同的亚单位。在COS转染体，抗HA免疫荧光显微镜显示每个重组蛋白都分布在细胞核之间和细胞质室（图​（图4，A–C；4,A–C；顶部，绿色）。TIA-1的亚细胞定位如所示相同字段的成对视图（图​（图4，4，A–C；中间，红色）。这个合并视图（图​（图4，4，A–C）显示在底部面板中。在未经处理的细胞，两者几乎没有共定位HA-eIF2α或HA-eIF2β与TIA-1（图​（图4，4、A和B）。相反，HA-p48 eIF3在包括TIA-1在内的细胞质病灶积聚～50%的转染细胞（图​（图4C，4C、 箭头）。作为对砷化物诱导的氧化应激，HA-p48eIF3（图​（图4F，4F、 箭头），但不是HA-eIF2α（图​（图4D，4D、 箭头）或HA-eIF2β（图​（图4E，箭头），4E、，箭头），被招募到TIA-1+SG（图​（图4，4，D–F；中间，红色）。这些结果确认eIF3（而非eIF2）是SG的组件并支持SG是eIF2/三元络合物缺陷的位置的概念预引发复合物在应激期间积累。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为mk0121717002.jpg

48S预引发复合物的成分包括招募到应激颗粒。用亚砷酸盐处理DU145细胞（0.5 mM，1 h）并处理为多色免疫荧光通过使用与TIA-1/R（绿色）反应的抗体进行显微镜检查指示的起始因子或其他蛋白质（红色）和DNA（蓝色）。每个垂直列显示同一字段的视图。顶行：TIA-1或TIAR（绿色）。中间行（红色）：eIF2α（A）、eIF3（B）、eIF4E（C）、eEF4G（D） 和eIF5（E）。底行，合并视图。黄色箭头指示红色和绿色都发出信号的单个压力颗粒重叠；白色箭头表示SG的位置包含TIA。细胞核被染成蓝色。棒材，20μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717003.jpg

存在或不存在压力的其他因素颗粒。用亚砷酸盐刺激DU145细胞，如图​图22并进行免疫荧光处理。每个垂直柱显示同一字段的视图。顶行：TIA-1或TIAR（绿色）。中部行（红色）：PHAS-I（eIF4E-结合蛋白）（A），HSP27（B），eIF2Bε（C），和HuR（D）；聚（A）+RNA（E）。底行，合并视图。黄色箭头指示单个应力颗粒，其中红色和绿色信号重叠；白色箭头表示仅包含TIA的SG的位置。细胞核被染成蓝色。酒吧，20微米。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717004.jpg

重组HA-eIF2α和HA-eIF2β不是招募到SG；重组HA-eIF3p48被招募到SG中。COS细胞瞬时转染HA-eIF2α（A和D；绿色），HA-eIF2β（B和E；绿色）；或HA-eIF3p48/int6（C和F；绿色）。将未经处理的细胞（A–C）或亚砷酸盐处理过的细胞（D–F）固定HA（所有面板为绿色）和TIA-1（所有面板均为红色）着色。箭头指示将HA标记蛋白招募到SG中的SG；箭头表示SG没有HA标记蛋白的补充检测到。棒材，20μm。

在组装和分发期间协调eIF的招募和分发蒸汽发生器的拆卸

上述成分分析表明聚（A）+mRNA被招募到SGs中作为一种成分改性48S预引发复合物。如果这是真的，个人应协调招募mRNP复合体的组成部分组装和拆卸蒸汽发生器。在单元格中用亚致死剂量的亚砷酸盐脉冲，SG聚集以响应随着细胞的恢复，初始应力会自动扩散(凯德莎等。, 1999). 我们使用该系统来确定SG成分被协调地招募到SG中，并从SG中分散出来。DU145细胞用亚致死剂量的亚砷酸盐（1.0mM，30min），然后在没有亚砷酸盐的介质中恢复。细胞是固定在不同的时间，使用免疫荧光。新兴SG规模较小，分布在细胞；它们后来合并成更大的核周结构先前显示在活细胞中使用GFP-TIA-1(凯德莎et（等）阿尔。, 2000). 在无应力细胞中，eIF3广泛存在于细胞质（图​（图5A；5A；红色），而TIA-1/R分布在细胞核和细胞质之间微点状图案（图​（图5，5，A行；使用抗体检测见TIA-1和TIAR，以绿色显示）。在受到亚砷酸盐治疗，eIF3（红色）被招募到具有类似症状的SG应力和恢复期间TIA-1/R（绿色）的动力学（图​（图5，B–F）。5,B–F）。即使在SG组装的早期阶段（即30之后接触亚砷酸盐的最小值；图​图5B），5B） ，eIF3出现在最小蒸汽发生器，与包含TIA-1/R的蒸汽发生器一致（图​（图5B，箭头）；5B、，箭头）；在合并视图中，此同区域化显示为黄色。之后亚砷酸盐、eIF3和TIA-1/R的去除在SG数量减少，但在恢复阶段的前2小时。在恢复的第3个小时内，SG拆卸，使TIA-1/R和eIF3恢复原状亚细胞区域（图​（图5F）。5F） ●●●●。因此，eIF3在在SG组装和拆卸期间与TIA-1/R并联在SG的组装过程中很早就被招募到SG。类似的时间进程进行实验以确定聚（A）+RNA、eIF4E、PABP和ELAV蛋白HuR通过TIA-1和TIAR协调招募至SG。如所示图中的简略分析​图6，每个6,这些mRNP组件中的每一个都被协调招募到，并且分散于，个SG。eIF4G和small的结果类似核糖体亚单位S3（我们未发表的数据）。这些结果表明聚（A）+RNA作为一种改性48S预引发复合物的成分。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717005.jpg

TIAR和eIF3共定位动力学应力颗粒。用1.0 mM亚砷酸钠处理DU145细胞清洗30分钟，然后在没有亚砷酸盐（回收）达到指定时间。每行描述平行同一字段的视图。TIA-1/R显示为绿色，eIF3显示为红色，并且巧合显示为黄色（右栏：合并）。控制（A），30分钟亚砷酸盐治疗未恢复（B），30分钟亚砷酸钠治疗后30分钟恢复（C）；30分钟亚砷酸盐，然后恢复1小时（D）；30分钟亚砷酸盐，然后2小时恢复（E）；和30分钟亚砷酸盐然后恢复3小时（F）。细胞核被染成蓝色。棒材，20μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717006.jpg

协调poly（A）的招聘+SG组装和拆卸期间，SG的RNA、PABP-I、eIF4E和HuR。DU145细胞受到亚砷酸盐胁迫，并允许其恢复，如图所示​图5。5左上角，TIA-1（绿色）与poly（A）（红色）；左下，TIA-1（绿色），PABP（红色）；右上角，TIA-1（绿色），eIF4E（红色）；底部右侧，TIA-1（绿色），HuR（红色）。在所有面板中，蓝色代表DNA（Hoechst染色）。棒材，20μm。合并视图显示在右侧每个系列的面板。箭头表示每个视图中的SG。

eIF2α翻译起始因子的招募（S51D）诱导SG

亚砷酸盐对细胞的影响复杂，不仅限于eIF2α激酶的激活(Bernstam和Nriagu，2000年). 因此，我们确定在COS电池中组装的SG的组成转染了eIF2α的磷酸化突变体（即S51D），其之前的研究表明TIA-1型+SG公司(凯德莎等。, 1999).与砷化物诱导的SG一样，HA标记的eIF2α（S51D）诱导的SGs是通过环己酰亚胺或依米汀分散（我们未公布的数据），表明它们与多聚体处于动态平衡状态亚砷酸盐诱导的SG。如图所示，使用与HA反应的抗体标签（图​（图7A；7A；红色），重组HA-eIF2α（S51D）在整个细胞中扩散分布，但它的一小部分明显局限于TIA-1型+它诱导的SG（图​（图7A；7A；绿色；白色箭头指向SG）。HA-eIF2α（S51D）强烈诱导SGs招募核糖体蛋白S3a（图​（图7B；7B类；红色），eIF3（图​（图7D；7D类；红色），eIF4E（图​（图7E；7E；红色）和eIF4G（图​（图7F；7F；红色），因为这些蛋白质明显集中在SG，SG在合并视图显示在每列的底部（黄色箭头）。核糖体Po抗原的弱部分募集（图​（图7C；7C类；红色）和eIF5（图​（图7G；7G；红色）（白色箭头），与用亚砷酸盐诱导SG获得的结果（图​（图1F1F和​和2E，分别），2E、，分别），表明这些因素可能是次要的或暂时的仅当eIF2α连续时才可检测到的SG组件磷酸化。HSP27（图​（图7H；7H；红色）和eIF2B（我们的未发布数据）未被纳入HA-eIF2α（S51D）诱导的SG。这些结果证实了早期的研究(凯德莎等。, 1999)报道称HSP27是热休克诱导的SGs的组成部分，但不是通过其他刺激。尽管HSP27已被报道为共聚集与eIF4G结合形成不溶性细胞溶质热休克颗粒报告排除了eIF4E、eIF3和PABP(库斯塔等。,2000)根据沉降，表明热震颗粒与SG不同。据报道，RNA结合蛋白HuR形成细胞溶质聚集体对热休克的反应(加卢齐et（等）阿尔。, 2000)这导致我们检查其对SG的招聘。我们发现HuR被招募到HA-eIF2α（S51D）诱导的TIA-1型+蒸汽发生器（图​（图7I；7我；红色、黄色箭头）也被招募用于砷诱导的TIA-1+SG公司（图​（图3D；三D类；红色）。正如预期的那样，非调度hnRNP C不是招募至HA-eIF2α（S51D）诱导的SG（图​（图7J；7J；红色）也不适用于亚砷酸盐诱导的SG（我们未公布的数据）。因此，最小值磷酸化eIF2α表达诱导的“核心”SG包含除了之前报告的TIA-1、TIAR、PABP-I和poly（A）+核糖核酸(Kedersha公司等。, 1999).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717007.jpg

eIF2α（S51D）诱导应力的组成颗粒。用质粒瞬时转染COS细胞编码重组磷酸拟态eIF2α（S51D）以诱导应力颗粒的组装。28小时后，对细胞进行处理抗体反应双色免疫荧光显微镜带有TIA-1或TIAR（绿色）和指示的换算系数（红色）。每列包含同一字段的成对视图图片位于底部。红色表示HA-eIF2α（S51D）（A）；小的核糖体蛋白S3a（B）；大核糖体亚基蛋白Po（C）；电子高速公路3（D） ；eIF4E（E）；eIF4G（F）；eIF5（G）；HSP27（高）；HuR（I）；和hnRNP C（J） ●●●●。当指示的换算系数为时，SG显示为黄色/橙色与TIA-1共定位（eIF3、eIF4E、eIF3G、核糖体亚单位S3、HuR；黄色箭头）或绿色，当指示的换算系数不与TIA-1（例如HSP27、hnRNP C；绿色箭头）协同定位。最小HA-eIF2α（S51D）、核糖体P抗原和eIF-5（白色箭头）。细胞核被染成蓝色。棒材，20μm。

少量但可检测到的磷酸化HA-eIF2α（S51D）及其诱导的SGs（图​（图7A）7A） 表明磷酸化eIF2α构成了总eIF2α可能被选择性地招募到SG中（与总数相反eIF2α，它似乎不是亚砷酸盐诱导的成分如图所示的新生SG​图2A2A和​和4D）。4D） ●●●●。要检查此可能，我们使用针对磷酸化eIF2α的抗体来监测SG组装/拆卸期间的定位（图​（图8）。8). 在没有压力的情况下磷酸化eIF2α抗体显示非特异性核染色（图​（图8A；8A；红色）。这种弱核染色是用来自两个不同的商业来源，可能代表着薄弱对非常丰富的核磷蛋白的交叉反应（例如组蛋白）。尽管亚砷酸盐处理30分钟（图​（图8B）清晰地8B）明显升高细胞质磷酸化eIF2α信号与TIA-1共定位+蒸汽发生器（图​（图8B，8B、 白色箭头；SG在合并字段中显示为绿色）。30分钟后恢复，TIA-1+蒸汽发生器尺寸增加（图​（图8C；绿色，8C类；绿色，箭头），但SG中几乎没有磷酸化eIF-2α（图​（图8C；8C类；红色）。随着恢复的进行phospho-eIF-2α减少，残余phosphoy-eIF2α为在SG定量发现（图​（图8，8、D和E）。的级别免疫荧光平行法检测胞浆磷酸化eIF2α经相同处理的样品上的Western blot所示（图​（图8G），和8G） ，使用来自两种不同来源的抗体获得了类似的结果商业来源。因此，虽然eIF2α磷酸化启动SG组装，如果有磷酸化eIF2α在新生SG中实际存在。只有在恢复期间总磷酸化eIF2α的量相对于总量减少在最初30分钟暴露期间产生（图​（图8G，8G、 比较车道E车道B），只有少数小区有SG磷酸化eIF2α定位于SG。这个结果是真实的不是由于抗体的某些非特异性作用而被检测到少量但一致的拟磷蛋白SG处的HA-eIF2αS51D（图​（图8H），8H） 用抗HA抗体检测。磷酸化HA-eIF2αS51D在SGs的有限共定位这表明它们在成分上与“晚期”SG相似而不是“早期”的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717008.jpg

磷蛋白eIF2α仅存在于应力颗粒中在恢复期间。用亚砷酸盐处理DU145细胞，并允许如图所示恢复​图55然后对TIA-1和磷酸化eIF2α。左栏，TIA-1（绿色）和DNA（蓝色）；中间的柱，磷酸-eIF2α（红色）和DNA（蓝色）；右列，合并。对照组（A），30分钟亚砷酸盐治疗，无恢复（B），30 min亚砷酸盐后30分钟恢复（C），亚砷酸盐后30分钟1小时回收（D），30分钟亚砷酸盐，然后2小时回收（E），以及30分钟亚砷酸盐，然后恢复3小时（F）。棒材，20μm。（G）等量总蛋白裂解物的免疫印迹如上所述处理相同的细胞，用探针探测磷酸化eIF2α抗体。（H） 磷酸模拟物HA-eIF2αS51D为在COS中表达，并用抗HA（绿色）检测。细胞是TIA-1（红色）和DNA（蓝色）复染。箭头表示位置SG，其中少量但可检测到的HA标记蛋白质被定位。棒材，20μm。

能量消耗诱导SG，但不诱导eIF2α

eIF2α磷酸化通过限制eIF2-GTP-tRNA的量我遇见三元的复合物；这是因为eIF2（αP）GDP具有竞争力eIF2B抑制剂，鸟嘌呤核苷酸交换因子eIF2将GDP兑换为GTP。只有eIF2-GTP可以绑定met-tRNA我并产生eIF2-GTP-tRNA我遇见三元配合物启动所需的（审核人Trachsel，1996年). 这个eIF2-GDP与eIF2-GTP的交换也受到低细胞水平的影响体外GTP/GDP比值，导致三元复合物缺乏和受损翻译(沃尔顿和吉尔，1976年;胡克尔马等。,1985). 因此，我们用各种药物处理细胞，这些药物会耗尽细胞细胞内能量储存以确定能量是否缺乏可以独立于eIF2α磷酸化诱导SGs。简介糖酵解抑制剂治疗（2-脱氧葡萄糖；图​图9B），9B） ，线粒体膜电位（离子载体FCCP；图​图9C），9C） 线粒体ATP酶（寡霉素；图​图9D）9D） 诱导SG组装。双重染色磷酸化eIF2α（图​（图9；9; 红色）表明这些SG组装在eIF2α无明显增加的细胞磷酸化（图​（图9，9，B–D；红色）相对于控件（图​（图9A；9A；红色）。相反，两种亚砷酸盐（图​（图9E）9E） 和DPI，一个特定的黄素依赖性氧化还原酶抑制剂（图​（图9F），9F） ，诱导SG同时伴有磷酸化eIF2α升高。使用免疫荧光验证能量不足引起的蒸汽发生器是否包含其他蒸汽发生器标记，包括poly（A）+RNA和eIF3（我们的未发布的数据）。这些处理不足以诱导细胞凋亡，例如洗掉药物使细胞恢复。磷酸特异性抗eIF2α抗体的Western blot分析证实2-脱氧葡萄糖、FCCP和寡霉素不会诱导eIF2α的磷酸化（图​（图9，9，底部；与反应的抗体TIAR用于确认样品之间的载荷相等）。我们得出结论能量消耗可以诱导SG而不增加eIF2α磷酸化。能量缺乏和同时降低的ATP/GTP除此之外，水平还会影响翻译的许多方面三元复合物形成，如氨基酰-tRNA充电、eIF4A、，eIF1A和终止事件。然而，SG之间的紧密联系磷酸化eIF2α的组装和磷酸化使我们倾向于GTP水平降低导致eIF2-GTP-tRNA我遇见三元络合物，三元络合物的缺乏可能会促使SG的形成磷酸化eIF2α本身的增加。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为mk0121717009.jpg

通过能量消耗诱导SG诱导eIF2α磷酸化。DU145细胞用2-脱氧葡萄糖（B）、FCCP（C）、寡霉素（D）、亚砷酸盐（E）或DPI（F）在无葡萄糖培养基（B、C、D和F）或常规培养基（E）中30分钟。然后直接将细胞固定并染色或溶解于PAGE的SDS-缓冲区。（上图）免疫荧光显示TIA-1为绿色和磷酸化eIF2α呈红色。细胞核呈蓝色。棒材，20μm。（底部）总细胞裂解物的免疫印迹如上所述，用磷酸-eIF2α和TIAR探测（作为加载控制）。

讨论

我们实验室和其他人以前的工作(诺维尔等。,1989;凯德莎等。, 1999,2000)已确定SG是高度动态的细胞质病灶聚（A）+RNA、TIA-1、TIAR和PABP-I瞬时在应激诱导的eIF2α磷酸化反应中积累。SG的RNA和蛋白质成分都与多聚体，如SGs在细胞处理后的分散所示与稳定多聚体的药物（例如，依米汀和环己酰亚胺），以及通过增强SG在使用药物治疗的细胞中的组装破坏多聚体的稳定性（例如，嘌呤霉素）。在此，我们证明SG不仅与多聚体平衡，而且包含经典cap-dependent 48S的许多组件起始前复合体，包括eIF3、eIF4E、eIF4G和小的（但不是大）核糖体亚单位。不包括在SG中的eIF2B、eIF5、HSP27、，eIF4E结合蛋白PHAS-I，以及令人惊讶的eIF2。SG根据S51D的强制表达式进行组装eIF2α的类磷酸突变体的成分与这些类似这表明eIF2α的磷酸化足以向SG招募这些eIF。代谢能力毒物诱导SG组装而不诱导eIF2α的磷酸化表明磷酸化eIF2α是间接的。代谢毒物和磷酸化eIF2α降低eIF2-GTP-tRNA我遇见然而，这表明正是三元配合物的缺乏引发了SGeIF2α的形成而非磷酸化，尽管其他这是可能的解释。SG的主要组成部分[即TIA-1/R，聚（A）+mRNA，PABP-I(凯德莎et（等）阿尔。, 1999)、HuR、eIF3、eIF4E和eIF4G（本研究）]，组装以类似动力学进入/从SG中分解，表明它们作为一个综合体协调招募到SG。SG组件存活的蔗糖梯度沉积似乎在40–50S迁移，与我们的论点一致，即SG由eIF2缺陷组成引发前复合物。

体外真核翻译起始（综述德维尔，1999;Pestova和Hellen，1999年;好时和美林，2000年)以开头eIF3与40S核糖体亚单位的结合。随后的eIF1A的招募和eIF2-GTP-tRNA我遇见形成43S综合体与mRNA/eIF4E/eIF4G/PABP mRNP结合以产生规范的48S预引发复合物。在应激细胞中，48S的成分预引发复合物（eIF2除外）包括协调招募到SG。这些结果表明三元络合物不足的“非经典”48S络合物（以下简称作为48S*络合物）是SG的核心成分。存在已经提出了一些类型的eIF2缺陷48S预引发复合物解释应激诱导转录的优先翻译哺乳动物中的ATF4等因子(哈丁等。, 2000)和酵母中的GCN4(Hinnebusch，1996年,1997;哈丁等。,2000)，在以下条件下优先翻译eIF2α磷酸化。他们的成绩单长5′未翻译包含多个小型上游ORF的区域通过使扫描核糖体提前终止来进行翻译到达应激诱导转录因子的起始密码子。在应激细胞中eIF2-GTP-tRNA我遇见已被提议允许组装eIF2缺陷48S预引发复合物扫描过上游ORF。当这些eIF2缺乏48S时复合物获得eIF2 GTP tRNA我他们之前见过到达转录因子的起始密码子，翻译可以开始。磷酸化eIF2α诱导SG组装和SG的组成表明它们由48S*络合物组成；这些是否与拟监管ATF4和GCN4的翻译仍有待确定。

我们之前证明mRNA处于动态平衡多聚体和SG之间(凯德莎等。, 2000)，因为用依米汀治疗含SG细胞“冻结”核糖体的mRNA，改变TIA-1的分布蔗糖梯度中多糖体组分的制备砷胁迫细胞(凯德莎等。, 2000). 如果eIF2缺失的48S*预引发复合物构成了SG，发生这种情况的机制变得明显。组件包含扫描不合格/eIF2缺陷预启动的TIA-1多体mRNA 5′端的复合体将允许伸长核糖体“流出”转录物，有效地将mRNA从多聚体转化为48S*mRNP。Emetine治疗可防止这种情况发生，允许少量TIA-1转移到多聚体区域梯度的(凯德莎等。, 2000). 如果没有依米汀，48S*复合体通过自聚集进入SGTIA-1的朊蛋白样结构域。在SG“分类”环境中单个mRNP的结构和组成可以决定mRNA被重新包装成mRNP、重新启动、沉默或降解(凯德莎等。, 2000). 招聘mRNA-稳定ELAV蛋白HuR到SGs支持这一模型，因为在信使核糖核酸分型位点，以确定单个转录物的命运。

我们的数据表明TIA-1/R和eIF2-GTP-tRNA我遇见可以作为调节多聚体平衡的功能性拮抗剂和SG。以下实验支持了这一概念观察：1）磷酸化eIF2α突变体（S51D）活性三元配合物的浓度促进了SG公司(凯德莎等。, 1999); 2） 不含磷的食物eIF2α突变体（S51A），防止应激诱导的活性三元配合物抑制亚砷酸盐诱导的SGs组装(凯德莎等。, 1999); 3） TIA-1ΔRRM，a的过度表达截短突变可隔离内源性TIA-1和TIAR，防止SG组装并促进共转染报告基因的表达(凯德莎等。, 2000); 和4）TIA-1过度表达抑制共转染报告基因的表达(凯德莎等。, 2000). 重组TIA-1和在无应力条件下观察到TIA-1ΔRRM，表明这些蛋白质可能调节多体和应激和非应激细胞中的非多胞体mRNP。

发现磷酸化eIF2α仅被选择性招募用于拆卸蒸汽发生器很了不起，因为它表明SG拆卸可能需要phospho-eIF2α。因为三元由磷酸化eIF2α组成的配合物可以引发单轮体外翻译（审查人Trachsel，1996年)，有可能实际上需要这种磷酸-eIF2α三元配合物来将TIA-1/R从48S*复合体中移除，并允许恢复正常启动。这种机制可以解释观察到的弱核糖体Po和eIF5募集到eIF2α（S51D）诱导的SG。在在这种情况下，磷酸模拟eIF2α的SG定位部分将是呈现为三元复合体并启动翻译。虽然S51D突变体可并入三元的程度复合物未知，它诱导的大多数SG缓慢分散环己酰亚胺处理后（我们未公布的数据），表明其成分mRNA与多聚体平衡。

除了在环境保护期间作为SG组织者的角色外应激、TIA-1和TIAR已被证明选择性地抑制TNF-α转录物的翻译。在缺乏TIA-1的巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）转录物的多聚体谱是转移，使TNF-α转录物的百分比与与野生型巨噬细胞相比，多聚体增加(皮埃西克等。, 2000). 这一结果表明TIA-1通过促进肿瘤坏死因子-α的组装来抑制其翻译非多体mRNP复合物。我们认为该杂岩在结构上相当于48S*mRNP。因为TIA-1绑定到AU-rich元素在TNF-α转录物的3′-非翻译区它将与组装预启动复合体交互与其他转录本相比显著增加。系绳TIA-1到TNF-α转录物将增加这些转录物的百分比在非多体mRNP复合物中发现的转录物抑制表达并增加这些转录物对监管控制。以类似的方式，hnRNP K/E1蛋白连接到15-脂氧合酶转录物的3′-非翻译区，诱导组装翻译不合格的48S预启动复杂(奥斯塔雷克等。, 2001). hnRNP K/E1蛋白起作用通过阻止60S核糖体亚单位的连接(奥斯塔雷克等。, 2001)同时允许小核糖体亚单位扫描到起始密码子，此时扫描停止文字记录被静音。因为eIF2 GTP tRNA我遇见是必需的启动子密码子识别，TIA-1可能诱导48S*复合物通过不同的机制促进翻译沉默。需要未来的实验来解决这个问题。

在完整的背景下评估翻译控制机制细胞相对于体外系统而言是复杂的穿梭蛋白如TIA-1、TIAR和HuR可能在细胞核中执行不同但相关的功能和细胞质。最近的报告表明，TIA-1调节特异性mRNA剪接事件(德尔·加托·孔萨克等。,2000;Forch公司等。, 2000;勒吉尼等。,2001)，表明SG组件在细胞质可能是特定核转录物的改变剪接，由于TIA-1从核重定位到SG。的确，应激诱导穿梭蛋白hnRNP A1的重定位从细胞核到细胞质似乎调节前mRNA剪接通过这种机制在体内(范德胡文·范奥尔德et（等）阿尔。, 2000). TIA-1/R招募eIF-2缺陷48S的能力*SGs复合物显示了mRNA的模块化和多功能性结合蛋白，并强调mRNA代谢的许多方面与mRNA在细胞器之间的运动同时发生或亚细胞结构域。

致谢

我们感谢安德森实验室的成员提供的帮助讨论。我们感谢Supratik Das博士、Gideon Dreyfuss、ImedGallouzi、John Hershey、Randal Kaufman、Scot Kimball、Umadas Maitra、，Richard Panniers慷慨提供了许多使用的试剂在本研究中。P.A.得到了美国国立卫生研究院的支持AI-33600拨款和关节炎生物医学科学拨款基金会。

使用的缩写：

电子标签页真核起始因子
PABP-I型聚（A）+结合蛋白I
蒸汽发生器应力颗粒

脚注

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc.01–05-0221。文章和出版日期为www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.01–05-0221.

参考文献

  • Berlanga J，Herrero S，DeHaro C.小鼠非红细胞血红素敏感真核细胞起始因子2a激酶的表征。细胞生物学杂志。1998;273:32340–32346.[公共医学][谷歌学者]
  • Bernstam L，Nriagu J.砷胁迫的分子方面。毒物环境健康杂志B Crit Rev。2000;三:293–322.[公共医学][谷歌学者]
  • Cuesta R、Laroia G、Schneider RJ。伴侣Hsp27通过结合eIF4G和促进cap-initiation复合物的分离，抑制热休克期间的翻译。基因发育。2000;14:1460–1470. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Del Gatto-Konczak F、Bourgeois CF、Le Guiner C、Kister L、Gesnel MC、Stevenin J、Breathnach R。RNA结合蛋白TIA-1是一种新型哺乳动物剪接调控因子，通过邻近5′剪接位点的内含子序列发挥作用。分子细胞生物学。2000;20:6287–6299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dever TE公司。翻译入门：善于适应。生物化学科学趋势。1999;24:398–403.[公共医学][谷歌学者]
  • Farrell PJ、Balkow K、Hunt T、Jackson RJ、Trachsel H。起始因子elF-2的磷酸化和网织红细胞蛋白质合成的控制。单元格。1977;11:187–200.[公共医学][谷歌学者]
  • Forch P、Puig O、Kedersha N、Martinez C、Granneman S、Seraphin B、Anderson P、Valcarcel J。促凋亡因子TIA-1是选择性前mRNA剪接的调节器。分子细胞。2000;6:1089–1098.[公共医学][谷歌学者]
  • Gallouzi IE、Brennan CM、Stenberg MG、Swanson MS、Eversole A、Maizels N、Steitz JA。HuR与细胞质mRNA的结合受到热休克的干扰。美国国家科学院程序。2000;97:3073–3078. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gray N，Wickens M.动物翻译起始的控制。Annu Rev细胞开发生物学。1998;14:399–458.[公共医学][谷歌学者]
  • Harding HP、Novoa I、Zhang Y、Zeng H、Wek R、Schapira M、Ron D。调节翻译起始控制哺乳动物细胞中应激诱导的基因表达。分子细胞。2000;6:1099–2108.[公共医学][谷歌学者]
  • 好时JW、Asano K、Naranda T、Vornlocher HP、Hanachi P、Merrick WC。人类和酵母转化起始因子EIF3结构的保守性和多样性。生物化学。1996;78:903–907.[公共医学][谷歌学者]
  • 好时JWB、梅里克WC。蛋白质合成起始的途径和机制。收录人：Sonenberg N、Hershey JWB、Mathews MB，编辑。基因表达的翻译控制。纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社；2000年，第33-88页。[谷歌学者]
  • Hinnebusch AG。GCN4的翻译控制：通过eIF2磷酸化的基因特异性调节。收录人：Hershey JWB、Mathews MB、Sonenberg N，编辑。平移控制。纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社；1996年，第199-244页。[谷歌学者]
  • Hinnebusch AG.酵母GCN4的翻译调控。控制启动子tRNA与核糖体结合的因素的窗口。生物化学杂志。1997;272:21661–21664.[公共医学][谷歌学者]
  • Hucul JA，Henshaw EC，Young DA。二磷酸核苷对蛋白质合成总速率的调节作用于起始水平。生物化学杂志。1985;260:15585–15591.[公共医学][谷歌学者]
  • Kedersha N，Cho M，Li W，Yacono P，Chen S，Gilks N，Goland D，Anderson P。TIA-1的动态穿梭伴随着mRNA向哺乳动物应激颗粒的募集。细胞生物学杂志。2000;151:1257–1268. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kedersha NL、Gupta M、Li W、Miller I、Anderson P.RNA结合蛋白TIA-1和TIAR将eIF-2α的磷酸化与哺乳动物应激颗粒的组装联系起来。细胞生物学杂志。1999;147:1431–1442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Le Guiner，C.、Lejeune，F.、Galiana，D.、Kister，L.、Breathnach，R.、。，Stevenin，J.和Del Gatto-Konczak，F.（2001年）。TIA-1和TIAR激活具有弱5′剪接位点的选择性外显子的剪接富铀细胞伸展自己的前mRNA。生物学杂志。化学。(在里面按). [公共医学]
  • Lutsch G，Stahl J，Kärgel H-J，Noll F，Bielka H。大鼠肝脏40S核糖体亚基表面核糖体蛋白定位的免疫电镜研究。欧洲细胞生物学杂志。1990;51:140–150.[公共医学][谷歌学者]
  • Nover L、Scharf K、Neumann D。细胞质热休克颗粒由前体颗粒形成，与一组特定的mRNA相关。分子细胞生物学。1989;9:1298–1308. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nover L，Scharf KD，Neumann D。番茄细胞培养物和叶片中细胞质热休克颗粒的形成。分子细胞生物学。1983;三:1648–1655. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ostareck D，Ostareck-Lederer A，Shatsky I，Hentze M.红细胞分化中脂氧合酶mRNA沉默：3′UTR调节复合体控制60S核糖体亚单位的结合。单元格。2001;104:281–290.[公共医学][谷歌学者]
  • Pestova TV，Hellen CU。核糖体招募和扫描：有什么新功能？生物化学科学趋势。1999;24:85–87.[公共医学][谷歌学者]
  • Piecyk M等人。TIA-1是一种选择性调节TNF-α表达的翻译沉默子。EMBO J。2000;19:4154–4163. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Scharf KD、Heider H、Hohfeld I、Lyck R、Schmidt E、Nover L。番茄Hsf系统：HsfA2需要与HsfA1相互作用才能有效地导入细胞核，并可能定位于细胞质热应激颗粒中。分子细胞生物学。1998;18:2240–2251. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Srivastava S，Kumar K，Kaufman R.eIF2alpha的磷酸化通过激活双链RNA依赖蛋白激酶介导细胞凋亡。生物化学杂志。1998;273:2416–2423.[公共医学][谷歌学者]
  • Taupin JL，Tian Q，Kedersha N，Robertson M，Anderson P。Fas介导的凋亡细胞死亡过程中，RNA结合蛋白TIAR从细胞核转移到细胞质。美国国家科学院程序。1995;92:1629–1633. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Trachsel H.引发剂蛋氨酸-tRNA与核糖体的结合。收录人：Hershey JWB、Mathews MB、Sonenberg N，编辑。翻译控制。纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社；1996年，第113-138页。[谷歌学者]
  • van der Houven van Oordt W，Diaz-Meco MT，Lozano J，Krainer AR，Moscat J，Caceres JF。MKK（3/6）-p38信号级联改变hnRNP A1的亚细胞分布并调节选择性剪接调控。细胞生物学杂志。2000;149:307–316. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Walton GM，Gill GN。嘌呤核苷酸对蛋白质合成起始复合物形成的优先调节。Biochim生物物理学报。1976;447:11–19.[公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会