Heh1 WH结构域的细胞溶胶暴露足以将Chm7招募到细胞膜

我们假设Chm7被排除在细胞核之外，以防止其在没有核膜屏障扰动的情况下不合时宜或不适当的“激活”。这样的模型预测，一定有一个核结合伙伴，它本身可能被细胞溶质Chm7“隐藏”；基于我们和其他人之前的工作(韦伯斯特等人，2014年;韦伯斯特等人，2016年;Gu等人，2017年)最明显的候选人是Heh1。为了验证这一假设，我们产生了与在镀锌1启动子（注意，即使在受抑制的葡萄糖条件下也有空泡状自体荧光，见图2A). 与许多其他INM蛋白不同，INM蛋白在过度表达后会回到内质网(Lusk等人，2007年)，Heh1-RFP由于使用活性NTR-依赖性INM靶向途径，即使在高水平上也会继续在INM累积（参见图2A、B和King等人，2006年). 因此，即使当Heh1的过度表达水平高于内源性水平一个数量级时，大多数Heh1定位于INM，预计细胞溶质Chm7无法进入Heh1(图2A、半乳糖、中间面板）。与此相一致，我们观察到内源性表达的Chm7-GFP的稳态分布没有改变，其中约30%的细胞的核膜病灶内有一小部分(韦伯斯特等人，2016年;图2A). 删除Heh1的LEM域对Chm7-GFP分布也没有影响，因为Heh1（51-834）-RFP也仅局限于INM(图2A)。

在单独的窗口中打开

图2。

Heh1-WH结构域的细胞溶胶暴露足以将Chm7招募到内质网膜。

(A类)在RFP过度表达（+半乳糖）2小时之前（+葡萄糖）或之后（+半乳糖），对Heh1全长和截短部分进行RFP标记（如左图所示，在脂质双层中），对Chm7-GFP（倒置）进行去卷积荧光显微照片。星号表示红色通道中的空泡自荧光。比例尺为5µm。(B类)Heh1的有效INM靶向依赖于Kap-α/Kap-β1（蓝色和紫色）和Ran-GTP（红色）。(C类)在YPG平板上发现的指示菌株的十倍系列稀释液，以表达Heh1的指示截断。30岁时生长后的平板成像^o个C持续36小时。

接下来，我们测试了Heh1中包含假定NLS的缺失，包括Heh1（303-834）和Heh1(图2A). 对于heh1（442-834），只有WH域可用于Chm7绑定。与此一致的是，表达heh1（442-735）的细胞内质网完全缺乏Chm7-GFP，其中WH被去除(图2A). 因此，将Heh1-WH结构域暴露于胞质溶胶对于将Chm7-GFP募集到内质网膜是必要的，也是足够的。

接下来，我们评估了Heh1-WH域的功能重要性，以apq12Δ单元格，这两个单元格都需要CHM7公司和HEH1型完全可行(Yewdell等人，2011年;Bauer等人，2015年;韦伯斯特等人，2016年) (图2C). 有趣的是，在heh1Δapq12Δ细胞只能通过编码全长Heh1的基因或喂1（51-834）等位基因。相反，导致Heh1定位错误或无法招募Chm7的缺失（例如。heh1（1-735），缺少WH域编码序列）无法完全补充生长。因此，虽然WH域很重要，但N末端INM靶向域也是Heh1功能的关键组成部分apq12Δ细胞。

Chm7绑定到INM平台

定位数据明确指出Heh1和Chm7的WH域之间存在直接相互作用。不幸的是，我们无法在体外检测到与纯化重组蛋白的稳定相互作用（图3——图补充1A)虽然我们注意到，已经显示了这种与这些蛋白质的人类版本的相互作用(Gu等人，2017年). 虽然这些负面数据有很多潜在原因，但有一种可能是有额外的蛋白质（或脂质）参与体内的相互作用。为了验证这一想法，我们使用抗GFP纳米体偶联珠从全细胞提取物中亲和纯化Chm7-GFP(图3——补充图1B)并对蛋白洗脱液进行MS/MS肽鉴定。与Chm7以潜在的非活性形式定位于整个细胞溶质的想法一致，与来自野生型细胞提取物的非特异性结合抗GFP珠蛋白的蛋白质相比，我们检测到除Chm7本身以外的少数特定肽谱(图3A). 为了便于可视化，我们直接将Chm7-GFP和no-GFP控制的亲和纯化结合部分的平均光谱计数（两个实验）与图3A.

在单独的窗口中打开

图3。

Chm7与Vps4招募所需的Heh1、Nur1和下游ESCRT结合。

(A–C)Chm7-GFP和Chm7的亲和纯化_打开-GFP是从野生型和vps4Δpom152Δ细胞。将结合的蛋白质洗脱并进行LC-MS/MS肽鉴定。将识别指示蛋白质的肽谱数量散点图与“无GFP”样品中识别的肽谱进行直接比较，并根据图3-源数据1点线和蓝绿色圆圈表示在非特异性蛋白质（蓝色）上富集至少两倍的肽。图A和图C表示MS鉴定的肽的归一化光谱计数的两个重复的平均值(D类)Heh1和Nur1，但不是Heh2与chm7共存_打开。Heh1-mCherry（红色通道）、Heh2-mCherry和Nur1-GFP（绿色通道）的反褶积荧光显微照片显示在顶部和底部面板的指示列中。任一chm7_打开-GFP或chm7_打开-mCherry如底部面板所示共同表达，但chm7open本地化仅在插图中显示为绿色和红色通道的合并。(E类)Vps4招募到chm7_打开需要Snf7和下游ESCRT。Vps4-GFP和chm7的去卷积荧光显微照片_打开-所示菌株背景中的樱桃。显示绿色、红色和合并图像。

图3——源数据1。

包含Chm7-GFP和Chm7亲和纯化的所有确定MS肽谱的表_打开-WT或vps4Δpom152Δ无GFP控件的单元格。

每个亲和纯化的数据可以在底部的标签中找到。

单击此处查看。^{（181K，xlsx）}

图3——图补充1。

在单独的窗口中打开

Chm7与Vps4招募所需的Heh1、Nur1和下游ESCRT结合。

(A类)重组纯化的Heh1 WH结构域和GST-Chm7在体外溶液结合试验中不能相互作用。考马斯染色SDS-PAGE凝胶显示溶液结合实验的输入和结合部分，其中GST或GST-Chm7与Heh1-WH结构域孵育并固定在GT载体上。MW标记的位置显示在左侧。(B类)抗-GFP磁珠与野生型（W303）细胞提取物或表达Chm7-GFP或Chm7的细胞孵育_打开-GFP。如图所示，洗脱结合在珠子上的蛋白质，用SDS-PAGE分离，然后送往MS/MS肽鉴定或用考马斯染色。分子量（MW）标记的位置如左图所示。(C类)chm7任意单位（A.U.）总荧光（积分密度）的相关性_打开-mCherry和Vps4-GFP共同定位于核膜。从100 chm7计算的线性回归_打开foci来自三个独立的重复；第页是线性相关（皮尔逊）系数。(D类)Vps4-GFP与chm7共定位的平均荧光强度图（以任意单位表示；A.U.）_打开-所示遗传背景中的樱桃疫源地。误差条表示三个独立重复中>50个焦点的平均值SD。(E类)chm7的平均荧光强度（以任意单位）图_打开-所示遗传背景中的樱桃疫源地。误差条表示三个独立重复中>50个焦点的平均值SD。P（P）-采用Dunnett校正的单向方差分析得出的值，其中**p≤0.01。(F类)chm7所包围区域的绘图_打开-GFP集中在指定的遗传背景中。误差条表示从三个独立重复中汇集的50个以上病灶的平均值的SD。P（P）-采用Dunnett校正的单向方差分析得出的值，其中ns为p≥0.05，*p≤0.05，***p≤0.001。(G公司)Western blot评估所示遗传背景中Vps4-GFP的总水平。HRP结合二级抗体和ECL检测抗-HA标记。Ponceau-stain用于评估总蛋白质负荷。左侧MW标记的位置。

因此，我们转而研究了Chm7-GFP在核膜聚集条件下的相互作用组，例如vps4Δpom152Δ我们之前已经证明的细胞会导致Chm7-GFP在富含畸形NPC的核膜域内积聚(韦伯斯特等人，2014年;韦伯斯特等人，2016年). 用Shot-gun MS对Chm7-GFP结合蛋白衍生的肽进行鉴定，发现其与包括Snf7和Vps36在内的多种ESCRT有特异性相互作用(图3B). 最有趣的是，鉴定出了几十种Heh1特有的光谱。考虑到Heh1是一种低丰度的完整膜蛋白（测得低至428个分子/细胞；Kulak等人，2014年)，这一结果尤其引人注目。此外，另一个低丰度（约354个分子/细胞；Kulak等人，2014年)还检测到完整的INM蛋白Nur1。已知Nur1在CLIP（染色体连锁INM蛋白）复合体中与Heh1相互作用(Mekhail等人，2008年)这些数据表明，至少在缺乏细胞的情况下，Chm7在更广泛的INM平台中与Heh1结合VPS4系列值得注意的是，没有专门检测到NPC的成分，Heh2也没有。

接下来我们测试了chm7的绑定伙伴_打开-GFP公司(图3——补充图1B)，这也提供了当Chm7被招募到核膜时生理环境的潜在模拟。在这种情况下，Heh1是最热门的(图3C). 除了Nur1之外，CLIP的其他成员也被特别确定，包括Lrs4和Csm1。奇怪的是，还发现了Gsp1（芽殖酵母Ran）(图3C). 此外，除了Snf7，还检测到其他ESCRT III，包括Vps2、Vps24和Did2(图3C). 与用Chm7-GFP纯化的结合蛋白相比vps4Δpom152Δ我们没有检测到任何ESCRT-II亚单位的特异性肽。我们推测这可能是因为Chm7-GFP可以在vps4Δ单元格（请参见韦伯斯特等人，2016年和图5A），而chm7_打开-GFP只局限于核包层。作为chm7相互作用特异性的进一步测试_打开-GFP和完整的INM蛋白，我们观察到Heh1和Nur1荧光融合蛋白（内源性水平产生）在chm7的近定量积累_打开焦点，而Heh2的分布没有改变(图3D)。

我们注意到，尽管我们在chm7的亲和纯化中检测到了几个额外的ESCRT-III蛋白_打开-GFP，我们没有检测到Vps4的任何肽。因此，我们研究了功能性Vps4-GFP融合(Adell等人，2017年)也可以专门招募到chm7_打开聚焦于几乎所有细胞的核膜(图3E). Vps4-GFP的荧光强度可能与chm7的荧光强度相关_打开-mCherry焦点，表明被招募到该核膜位点的Chm7和Vps4分子数量之间存在密切关系(图3——补充图1C)。

因此，我们接下来评估了Vps4-GFP向chm7募集的分子决定因素_打开首先重点删除chm7中编码ESCRT-III亚单位的基因_打开-GFP亲和纯化包括序号F7,VPS24、VPS2、和DID2型(图3C). 在所有这些缺失菌株中，Vps4-GFP招募到chm7_打开-樱桃病灶减少，或snf7Δ细胞完全消除，对chm7的积累影响最小_打开-mCherry本身(图3E;图3——补充图1D、E); 尽管我们注意到chm7所包围的平均面积_打开-麦克里的注意力在snf7Δ单元格(图3E;图3——补充图1F). 这些数据支持一种模型，即Vps4可能被招募到核膜中，使用与在内体中观察到的类似的ESCRT-III相互作用队列(Babst等人，2002年). 根据这个想法，我们还测试了ist1Δ和vps60Δ编码影响Vps4募集的蛋白质的细胞(Dimaano等人，2008年;Rue等人，2008年)和ATP酶激活(Azmi等人，2008年;Yang等人，2012年)在内涵体。在这两个菌株中，chm7处的Vps4-GFP荧光都有适度降低_打开-mCherry病灶(图3E;图3-图补充1D)。

与作用于Snf7下游的ESCRT-III组件的中断形成鲜明对比的是，删除了VPS20系列作用于内体Snf7的上游(Teis等人，2008年)并且不在核膜上(韦伯斯特等人，2014年;韦伯斯特等人，2016年)，我们观察到核chm7的Vps4-GFP显著增加了约3倍_打开焦点(图3E,图3——图补1D). 这些数据表明，在没有内体ESCRT臂的情况下，有更大的Vps4池可与chm7相互作用_打开网络在核外壳上。重要的是，在所测试的ESCRT缺失背景中，总Vps4-GFP蛋白水平没有显著改变(图3——补充图1G). 总之，这些数据强化了内体和核膜ESCRT途径的独特成分，但Vps4仍然可以在Snf7的旁边或下游被招募到INM中。

荧光ESCRT靶向和激活（FETA）分析

有趣的是，如所示图3D，chm7_打开能够将Heh1和Nur1的分布从均匀分布的核外围定位转变为与chm7共定位_打开集中。这提出了一种正式的可能性，即Chm7招募到核膜可能实际上独立于Heh1，并在Heh1之前对其具有约束力；在这样一个模型中，Heh1是其焦点聚集所必需的，我们将其解释为“激活”。因此，这一结果说明需要开发一个更好的控制实验系统，使Chm7的招募和激活机制解耦。因此，我们设想了一种实验方法，我们称之为F类荧光的E类SCRT公司T型瞄准和A类活化分析（FETA；图4A). FETA对Chm7-GFP的表达进行时间控制（通过镀锌1启动子），并通过与Heh2附加的GFP纳米体（GFP-binding protein/GBP）结合，对其募集到核膜进行空间控制。因此，在不干扰核膜屏障的情况下，我们可以监测核膜处Chm7-GFP的募集和激活，后者被我们解释为Chm7的局部聚集，是荧光显微镜水平上Chm7聚合最合理的视觉结果。

在单独的窗口中打开

图4。

Heh1需要诱导Chm7的局部聚集。

(A类)“荧光ESCRT靶向和激活分析”示意图，其中Heh2表达为与GFP结合蛋白（GBP；红色）的融合。通过向生长培养基中添加半乳糖来表达Chm7-GFP。Heh2-GBP-mCherry的局部聚集被解释为Chm7活化。(B类)向生长培养基中添加半乳糖后，在指定的时间点对Chm7-GFP和Heh2-GBP-mCherry的荧光显微照片进行解卷积。比例尺为5μm。(C类)作为Heh2-GGBP-mCherry聚类的度量，计算了Heh2-GGBP-mCherry荧光沿着中段核膜随时间的变化系数（CV）。显示了归一化为0时间点的平均值和SD。n=25。

图4——图补充1。

在单独的窗口中打开

Heh1需要诱导Chm7的局部聚集。

(A类)Chm7-GFP的过度表达不会影响Heh2-mCherry的分布。Heh2-mCherry和Chm7-GFP在产生（半乳糖）或抑制（葡萄糖）条件下的去卷积荧光显微照片。还显示了绿色和红色荧光的合并。星号表示真空自荧光。比例尺5μm。(B类)根据图像和条件绘制Heh2-mCherry荧光沿核膜的CV图(A类). 误差条表示大于50个细胞的三个独立重复的平均值SD。P（P）-Student t检验的数值，其中ns为p≥0.05。(C类)在Heh2-GBP环境下，Chm7-GFP的过度表达导致Heh1-mCherry在核包膜处的Chm7-GFP病灶中积累。在产生Chm7-GFP（半乳糖）或抑制（葡萄糖）的条件下，Heh1-mCherry和Chm7-GFP（在同样表达Heh2-GBP的菌株中）的去卷积荧光显微图。还显示了绿色和红色荧光的合并。星号表示真空自荧光。比例尺5μm。

通过将细胞转移到含有半乳糖的培养基中，我们诱导了Chm7-GFP的表达，并通过时间推移显微镜监测其分布。如所示图4BChm7-GFP首次在细胞液中观察到，但在20分钟内积聚在核膜上。重要的是，这种核膜结合是由于它与Heh2-GBP-mCherry的相互作用，因为在缺乏Heh2-GBP-mCherri的菌株中，Chm7-GFP过度表达(图1C)或缺少英镑(图4补充图1A、B)Heh1-mCherry被纳入Chm7-GFP-Heh2-GBP病灶(图4——补充图1C). 有趣的是，几乎在更广泛的核膜定位的同时，Chm7-GFP和Heh2-GBP-mCherry在整个核膜的多个病灶中累积（见40分钟箭头）。这些病灶在整个时间过程（90分钟；视频1). 作为量化这种焦点聚集的一种方法，我们计算了沿着中层核膜的mCherry荧光的变异系数（CV），并绘制了随时间变化的曲线(图4C). 这种方法忠实地代表了观察到的聚类，聚类在50到60分钟之间达到最大值(图4B、C)。

凭借临时解决招募和“激活”的能力，我们接下来询问了Heh1如何影响这些步骤。引人注目的是，Chm7-GFP在heh1Δ细胞导致其在与野生型细胞相似的时间点积聚在核膜上，然而，在90分钟的时间过程中，我们没有观察到任何局部积聚，CV保持在~1(图4B、C、和视频1). 因此，向INM招募Chm7不足以导致Chm7-GFP聚集。相反，激活需要Heh1。

接下来，我们研究了在从Nur1开始的FETA分析中，其他Chm7-相互作用的伙伴是否影响了Chm7-GFP聚类。有趣的是，删除1号机组导致Heh2-GBP-mCherry在FETA分析终点的CV显著下降，这表明它也可能促进Chm7活化(图5A、B). 与这个想法一致，我们还观察到chm7明显减少_打开-GFP在核包膜的累积努尔1Δ单元格(图5——补充图1A、B). 然而，我们也注意到Heh1的总水平在努尔1Δ单元格(图5——补充图1C)，表明该效应可能是间接的，并最终通过Heh1介导。我们进一步研究了删除两者的影响序号F7和VPS4系列FETA分析中Heh2-GBP-mCherry聚集程度。在这两种情况下，Heh2-GBP-mCherry的CV没有改变(图5B). 然而，定性地，我们观察到，除了细胞质中的一些病灶（缺乏Heh2-GBP-mCherry）外，在这两种遗传背景下的核膜上还有更多离散的病灶(图5A). 因此，这些下游组件可能会影响其他无法用这种方法进行测量和解释的事件。

在单独的窗口中打开

图5。

Heh1 WH结构域和跨膜锚定对于Chm7激活来说是必要的和充分的，Chm7的激活也受到Nur1、Snf7和Vps4的调节。

(A类)删除NUR1型,序号F7和VPS4系列影响FETA分析中Heh2-GBP-mCherry聚集。Heh2-GBP-mCherry和Chm7-GFP在指示遗传背景下的去卷积荧光显微照片，在半乳糖中（葡萄糖）之前或90分钟后，以驱动Chm7-GFP的产生。显示合并的绿色和红色通道。比例尺为5μm。(B类)Heh2-GBP-mCherry荧光的CV图（如图4C)在添加半乳糖之前（葡萄糖）或90分钟之后诱导Chm7-GFP产生。数据来自三个独立的重复，其中计算了50个细胞/基因型/重复。P（P）-数值来自Dunnett检验的双向方差分析，其中ns为p>0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。(C类)Heh2-GBP-mCherry和Chm7-GFP在半乳糖中产生90分钟的去卷积荧光显微照片。所有图像均来自heh1Δ表达编码指示基因的菌株嘿1和几个缺失结构（在脂质双层中图示）。(D类)Heh2-GBP-mCherry荧光的CV图（如图4C)在中heh1Δ表达菌株HEH1型或heh1（1-735）添加半乳糖90分钟后诱导产生Chm7-GFP。数据来自每个菌株50个细胞的三个独立重复。P（P）-数值来自Dunnett检验的双向方差分析，其中ns为p>0.05，***p≤0.0001。

图5——图补充1。

在单独的窗口中打开

Heh1 WH结构域和跨膜锚定对于Chm7激活来说是必要的和充分的，Chm7的激活也受到Nur1、Snf7和Vps4的调节。

(A类)删除1号机组冲击chm7_打开-GFP在核膜上的积累。chm7的去卷积荧光显微照片（反转）_打开-指示菌株中的GFP。(B类)chm7富集水平图_打开-指示菌株核膜焦点处的GFP由核膜焦点的平均荧光与背景荧光的比值反映。误差条代表三个独立重复中>100个焦点的平均值SD。(C类)Heh1水平在努尔1Δ细胞。所示菌株中Heh1-3xHA融合总水平的Western blot。Heh1-3xHA和肌动蛋白用作总蛋白负荷参考，使用抗HA抗体或抗肌动蛋白抗体检测，然后使用HRP-结合二级抗体和ECL。左侧分子量（MW）标准的位置。(D类)Heh2-GBP-mCherry和Chm7-GFP的去卷积荧光显微照片heh1Δ表达菌株HEH2公司添加半乳糖90分钟后，导入质粒以诱导产生Chm7-GFP。显示绿色、红色和合并通道。比例尺为5µm。

Heh2-GBP-mCherry聚类的缺失heh1Δ细胞也为更全面地研究Chm7激活机制提供了遗传背景。首先，介绍HEH1型关于质粒拯救的Chm7-GFP和Heh2-GBP-mCherry在heh1Δ菌株，证实缺乏聚类确实是由于缺乏Heh1(图5C、D). 相反HEH1型旁白，HEH2公司，未能拯救聚类支持Heh1中存在与Chm7接口的唯一序列元素(图5——补充图1D). 与此一致heh1（1-735）缺乏C-末端WH结构域，未能恢复Chm7局部聚集和Heh2-GBP-mCherry聚集，表明WH结构区是激活Chm7所必需的(图5C、D). 然而，有趣的是，仅WH结构域不足以拯救聚集，而是需要通过Heh1跨膜结构域的膜锚(图5C，底部面板）。在后一种情况下，我们还观察到细胞质中有Chm7-GFP病灶，可能在内质网膜中，因为heh1（703-834）结构不包含INM靶向序列，这与图2A因此，Heh1 WH结构域和Chm7活化所需的膜之间存在明显耦合。

Chm7-Heh1相互作用导致核包膜疝和扩张

我们的数据支持一个模型，其中Chm7和Heh1在空间上分离，但在结合后，Chm7在膜界面局部激活。为了研究Chm7活化如何转化为能够封闭核包膜孔的机制，我们采用相关光EM（CLEM）方法研究了Chm7激活位点的核包膜形态。虽然我们最初的尝试集中于检查Chm7-GFP在NPC装配缺陷株中的定位位置，这些NPC装配缺损株具有核包膜疝，如apq12Δ和nup116Δ细胞，这些核包膜病灶处Chm7-GFP的低丰度（和短暂性），再加上通过冷冻替代过程导致GFP荧光丧失，使得这成为一种可行的方法。因此，我们再次转向chm7_打开-GFP（和Chm7-GFP英寸vps4Δpom152Δ细胞）作为检测（超）激活部位膜形态的代理。

如面板所示我属于图6A和B，我们可以有效地将荧光图像和电子断层图关联起来(Kukulski等人，2012年)，显示chm7_打开-GFP病灶与INM相邻。值得注意的是，这种荧光消除了侵入细胞核的INM的延伸，形成了INM池的有窗网络——池的腔与核膜的腔连续，并呈蓝色或紫色以便于观察。在图6A和B、面板ii-iv（三）表示沿层析图Z轴的切片；三维模型是通过等值面渲染生成的，可以可视化为静止帧(图6A、B、v–viii)在电影中(视频2和三). 这些3D视图有助于观察核孔（以恒星表示），以及INM处有窗池膜网络的范围。我们解释为ER的开窗膜附近也出现了有趣的频率(图6A、vii、viii;图6B，iii; 14张断层照片中有6张）。

在单独的窗口中打开

图6。

chm7码_打开伴有核内开窗池网络，通常位于核包膜疝下方。

(A、 B类)使用300 nm厚切片的相关光镜和电子显微镜检查chm7位点的核膜形态_打开-GFP积累。我.荧光和电子显微照片与标记有（*）的相关校准用四荧光基准重叠；方框区域放大ii-iv（三）.ii-iv（三）沿着断层图z轴的多个视图显示，核包膜/ER腔充满了青色或淡紫色。v-viii型生成了三维模型，并显示了几个透视图。白色箭头表示疝气，白色箭头表示囊泡，黑色箭头表示收缩或颈部突出，星星表示核孔。N是原子核。比例尺为250 nm。

图6——图补充1。

在单独的窗口中打开

chm7码_打开伴有核内开窗池网络，通常位于核包膜疝下方。

(A和B)序号F7对于chm7中核内开窗膜网络的形成是不必要的_打开. (我)利用~220nm厚切片的相关光镜和电子显微镜检查chm7位点核膜的形态_打开-m樱桃积累snf7Δ细胞。i、。荧光（红色）和电子显微照片的叠加；方框区域被放大ii、。ii、。核膜呈蓝色或绿色，内质网呈紫色的层析切片。三三维模型视图。恒星是核孔，Chr是染色质，N是细胞核。比例尺英寸我为1µm，标尺为ii（ii）,三为250 nm。

INM相关的池网通常（14张断层照片中有11张）位于核膜（即INM和ONM）气球状突出物下方，延伸数百纳米进入胞浆(图6A、B). 疝腔向核质开放，并逐渐变细为直径约45 nm的膜“颈部”：如图所示图6A，ii，可以观察到两个“颈部”（黑色箭头）。通常（在14张断层图中的10张中）在疝气部位附近出现水泡，其中一些水泡可以与ONM融合或从ONM分裂(图6，白色箭头）。在串联阵列中观察到额外的INM外翻（延伸至核包膜腔，黑色箭头），这表明它们可能是疝气的前兆(图6A，iii). 事实上，通常在一张断层照片中可以观察到几个核包膜疝，如图中的白色箭头所示图6B有趣的是，在没有序号F7(图6补充图1A、B,视频4)。

当CLEM应用于Chm7-GFP的局部积聚时，也观察到类似的膜形态vps4Δpom152Δ单元格(图7A，i,). 与INM扩张和核包膜疝不需要同时发生的想法一致图7A显示了一个单一疝的例子（有两个脖子；见黑色箭头）。核透视图（自下而上，图7,v（v）)该视图可以直接比较Chm7-GFP信号下的颈部疝气和充满NPC（星星）的核孔。最后，一个更生动的例子vps4Δpom152Δ核包膜，其中INM和池板层膜之间的连接具有多重变形图7B有趣的是，在这一厚厚的切片中，没有观察到核包膜突出，这表明INM网络和核包膜疝之间没有隐含的联系；这两种形态可能是随机出现的，不一定朝着一个或另一个方向。综上所述，这些数据支持一个模型，其中Chm7和Heh1的相互作用以及Chm7的激活可导致INM的扩张和核包膜疝的形成。

在单独的窗口中打开

图7。

Chm7与核包膜疝和核内膜相关。

(A、 B类)利用300 nm厚切片的相关光镜和电子显微镜检查Chm7-GFP积聚部位的核膜形态vps4Δpom152Δ细胞。我.荧光和电子显微照片的叠加；方框区域放大ii（ii）和三.ii（ii）,三。所示断层图z轴上的多个视图。iv-vi（静脉-静脉）生成了3D模型，并显示了所示的透视图。核膜/内质网腔呈蓝色或红色。黑色箭头表示疝颈或膜收缩部位，星形为核孔。N是原子核。比例尺为250 nm。

Leptomycin B和BAPTA-AM治疗

测试抑制核输出对稳态分布的影响Chm7-GFP、Chm7-MGM4、Chm7_打开-GFP、GFP、NES1_CHM7公司-GFP、NES2_CHM7公司-GFP或NES1-2_CHM7公司-GFP，我们使用KWY175（B.Montpetit和Karsten-Weis的礼物），其中XPO1型覆盖有pRS413，表达xpo1-T539C型对链霉素B（LMB）敏感的等位基因。这些菌株在YPAR中生长，并在生长培养基中添加半乳糖（最终浓度为1%）以诱导GFP融合蛋白表达2小时，然后添加2%的D-葡萄糖以抑制蛋白生成。然后用溶于7:3 MeOH:H中的50 ng/mL LMB处理培养物₂成像前，在O溶液（Sigma）中放置45分钟，同时控制等效体积的甲醇。

测试Ca²⁺在Chm7向核膜的生理募集中发挥作用，apq12Δ表达Chm7-GFP（DTCPL567）的细胞在30°C下培养过夜，稀释至OD₆₀₀0.2，并在室温下额外生长2小时。用25µM处理细胞(Li等人，2011年)细胞渗透性钙螯合剂BAPTA-AM（Tocris Bioscience）溶于DMSO或DMSO中30分钟，然后在RT或37°C下培养45分钟，然后成像。

质粒

所有质粒均列于补充文件2.

为了生成pRS406-ADH1-GFP，通过PCR扩增GFP编码序列，并将其插入pRS406-1ADH1（p406ADH1是Nicolas Buchler和Fred Cross-Addgene质粒#15974的礼物；http://n2t.net/addgene:15974; RRID：添加_15974)使用生态RI和后面的III限制场所。

要生成pCHM7-MGM4CHM7公司ORF通过PCR扩增克拉pPP004中的I限制位点和亚克隆用线性化克拉I（L Veenhoff的礼物；Popken等人，2015年)，放置附件7在第一个MBP基因和GFP之间。

为了生成pRS406-ADH1-NES1-GFP，我们合成了一个基因块（IDT），该基因块具有Chm7的370–390个氨基酸的编码序列，其同源臂包含40个碱基对侧翼序列，位于pRS406-ADH1-GFP的多克隆位点之外。利用吉布森组装反应（新英格兰生物实验室）将基因块组装成pRS406-ADH1-GFP。

为了生成pRS406-ADH1-NES2-GFP，设计了互补的4 nmol Ultramers（IDT），以编码Chm7的409-424氨基酸，这些氨基酸将由Xba公司我或巴姆你好。通过在Taq聚合酶PCR缓冲液（Invitrogen）中加热至95°C并持续5分钟，使其缓慢冷却至RT，对超分子单体进行退火。然后使用T4连接酶（Invit罗gen）将退火的引物连接到pRS406-ADH1-GFP中，并用Xba公司我/巴姆HI（新英格兰生物实验室）。

生成pRS406-ADH1-NES1-2_CHM7公司-GFP，编码Chm7的370–429氨基酸的序列，用含有Xba公司我或巴姆HI限制场所。PCR产物用Xba公司我/巴姆HI和凝胶纯化（Qiagen），然后用T4连接酶（Invitrogen）连接成pRS406-ADH1-GFP，用线性化Xba公司我/巴姆你好。

吉布森组件（新英格兰生物实验室）用于生成pFA6a-3xHA-GFP-his3MX6，用于Vps4的功能标记(Adell等人，2017年). 3xHA表位是从pFA6a-3xHA-his3MX6经PCR-扩增得到的(Longtine等人，1998年)使用Q5 DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）的质粒并组装到pFA6a-GFP-his3MX6(Longtine等人，1998年)用…消化萨尔我和派克靴I（新英格兰生物实验室）。

蛋白质印迹

对于全细胞蛋白提取物，约2 OD₆₀₀通过离心收集对数中期的细胞，在1 mM EDTA中洗涤，再次造粒，并在2 M NaOH中再次悬浮/溶解10 min。通过在冰上添加50%三氯乙酸沉淀20分钟，然后通过离心收集蛋白质。沉淀的蛋白质在冰镇丙酮中洗涤，风干，然后再悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。然后将样品在95°C下变性5分钟。在预制SDS-PAGE、4–20%梯度凝胶（BioRad）上分离变性蛋白质，并转移到0.2µm硝化纤维素膜（BioRad）上。使用Ponceau S溶液（Sigma）观察相对蛋白质负荷。随后在TBST中洗涤膜，并在室温下在TBST中的5%脱脂乳中封闭1小时。然后将膜与HRP缀合的抗HA（Roche 3F10）或在TBST中稀释的抗肌动蛋白（mAbcam 8224）孵育。直接用ECL（ThermoFisher）或抗兔HRP缀合的二级抗体检测一级抗体，然后是ECL，并使用VersaDoc成像系统（Bio-Read）进行可视化。

荧光显微镜

除下文所述的相关光电显微镜实验外，所有荧光显微照片均使用配备100x、1.4 NA物镜（奥林巴斯）的DeltaVision显微镜（Applied Precision/GE Healthcare）采集。使用CoolSnapHQ拍摄图像²CCD摄像机（光度学），除了图2和图4B，这是使用Evolve EMCCD相机（Photometrics）获得的。

对于年FETA测定中Heh2-GBP-mCherry聚类的时间进程评估图4B细胞在ONIX微流控平台（CellASIC）的微流控板（Y04C/CellASIC）中成像。用2%棉籽糖将细胞装入CSM中的微流控室。在实验过程中，将含有2%半乳糖的CSM以0.25 psi的压力灌注到微流控室中。每隔10分钟采集一次Z堆叠（0.4µm切片）90分钟。

图像处理和分析

在softWoRx（6.5.1；Applied Precision GE Healthcare）中使用迭代算法对所有呈现的荧光显微照片进行解卷积。背景相减后的未处理图像用于荧光强度的量化。

通过计算单个核膜荧光的变异系数（SD/平均值x 100）来量化Heh2-GBP-mCherry或Heh2-mCherri聚类的评估(Fernandez-Martinez等人，2012年). 使用FIJI/ImageJ在中间平面部分的整个核膜上绘制了一条四像素宽的手绘线(Schindelin等人，2012年)并测量了示踪区域内的平均荧光。定量时排除核膜处荧光模糊的空泡自体荧光细胞。此外，在一些heh1Δ在Chm7-GFP诱导前，Heh2-GBP-mCherry细胞呈斑簇状。因此，由于该表型不是由Chm7-GFP的表达触发的，因此将其排除在聚类分析之外。

关联共定位Vps4-GFP和chm7的荧光强度_打开-mCherry，Vps4-GFP和chm7的综合密度_打开-mCherry被测量并绘制在相关曲线上。在Prism（GraphPad 8.0）中计算线性相关系数（皮尔逊系数，r）。

类似地，Vps4-GFP和chm7的积分密度和平均荧光强度的量化_打开-mCherry通过选择chm7周围的感兴趣区域（ROI）进行测量_打开-mCherry信号和测量mCherri和GFP通道中的平均荧光强度。

测量GFP、NES1的相对核排斥_CHM7公司-GFP、NES2_CHM7公司-GFP和NES1-2_CHM7公司-GFP在稳定状态下构建，根据dsRed-HDEL定位确定，在每个细胞核上追踪到3.75µm线（线穿过核膜边界时都包含细胞质）。使用FIJI/ImageJ中的Plot Profile函数测量GFP荧光(Schindelin等人，2012年). 在平均之前，将记录道归一化为每条记录道内测量的最大值。

统计分析

使用Prism（GraphPad 8.0）生成图形和统计分析。P（P）-所有图表中的值都是通过图图例中所示的测试生成的，表示如下：ns，p>0.05*p≤0.05**p≤0.01***p≤0.001，***p≤0.0001。所有误差条表示平均值的标准偏差。MS/MS分析的光谱计数散点图图3A、B和C使用Excel（Microsoft）生成。

核出口信号预测

使用LocNES预测Xpo1/Crm1 NES序列(Xu等人，2015年)具有默认阈值设置。

重组蛋白结合实验

GST、GST-Chm7和GST-heh1（735-834）（heh1 WH结构域）蛋白质如前所述重组生产和纯化(韦伯斯特等人，2016年)溶解缓冲液中（50 mM Tris pH 7.4，500 mM NaCl，2 mM MgCl₂，2 mM氯化钙₂、10%甘油、0.5%NP-40、1 mM DTT、完整蛋白酶抑制剂（罗氏））。将可溶性部分与谷胱甘肽-葡聚糖（GT）珠在4°C下培养1小时以进行结合。通过离心收集GT珠，并用裂解缓冲液洗涤三次。用10 mM还原型谷胱甘肽从GT珠中洗脱GST和GST-Chm7蛋白，并在裂解缓冲液中透析。通过与HRV3C蛋白酶（Thermo Scientific）在4°C下孵育过夜，将Heh1 WH从GT珠中分离出来。对于结合实验，Heh1 WH与GST和GST-Chm7在透析盒（3.5K Slide-a-Lyzer，Thermo Scientific）中孵育，结合反应在结合缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM MgCl）中透析过夜₂，2 mM氯化钙₂，10%甘油，0.5%NP-40，1 mM DTT）。收集反应物，在4°C下用GT珠培养1小时，用结合缓冲液洗涤三次，并在2X Laemmli样品缓冲液中洗脱。蛋白质在SDS-PAGE凝胶上溶解，并通过SimpleBlue Safe-Stain（Invitrogen）进行可视化。

免疫亲和纯化

酿酒酵母表达Chm7-GFP（DTCPL81）、Chm7-GFP的细胞vps4Δpom152Δ（DTCPL133），chm7_打开-GFP（DTCPL413）在30°C的YPD中生长到对数相，并通过离心收集。用冰水清洗细胞一次，通过离心收集，并将其重新悬浮在小体积的冷冻缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.4，1.2%聚乙烯吡咯烷酮和蛋白酶抑制剂[SigmaOeffinger等人，2007年])并在液氮中快速冷冻。将冷冻酵母颗粒在Retsch MM400搅拌机中以30 Hz的频率粉碎6次，持续3分钟。为了进行免疫亲和纯化，将200 mg冷冻酵母粉溶解在4体积的均质缓冲液（400 mM柠檬酸三钠，pH 8，0.5%n-十二烷基β-D-麦芽糖苷）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）中。将可溶性部分与涂有GFP纳米体的10µl磁珠（Dynabeads，M-270环氧树脂，Invitrogen）浆料在4°C下孵育1小时(Cristea等人，2005年;LaCava等人，2016年). 将珠子收集在磁架上，并用500µl均质缓冲液洗涤三次。通过在20µl 1X NuPAGE LDS（十二烷基硫酸锂）样品缓冲液（Invitrogen）中在70°C下孵育珠子10分钟，洗脱结合蛋白。洗脱液在磁力架上分离，然后在70°C下用50 mM DTT孵育10分钟。洗脱物在4–12%NuPAGE凝胶（Novex）上运行，直到染料前沿刚刚进入凝胶。凝胶用Imperial蛋白质染色法（Thermo Scientific）染色，并切除一条蛋白质带（由所有洗脱的蛋白质组成）进行MS分析。

质谱和分析

MS/MS在耶鲁-凯克蛋白质组学设施进行。将上述切除的条带转移到清洁的1.5 mL Eppendorf试管中，并用胰蛋白酶消化。随后，使用Waters nanoACQUITY超高压液相色谱仪（UPLC）对肽进行色谱分离，并在Waters/Micromass AB QSTAR Elite上检测肽。使用Scaffold 4.8.7（Proteome Software Inc）完成MS/MS肽结果分析。肽由SEQUEST和吉祥物使用X！串联(Craig和Beavis，2003年;Searle等人，2008年)并使用肽营养素进行验证(Keller等人，2002年;Nesvizhskii等人，2003年)在Scaffold软件中（Proteome software Inc）。蛋白质通过与SwissProt数据库的比较进行鉴定，其中肽鉴定要求每个复制品中的肽≥2个，且分析中包含正确鉴定的概率≥95.0%。利用两个重复的总光谱计数，采用Fischer精确检验进行定量分析，以确定样品间富集的显著性，显著性阈值p<0.05(图3A、C)，或在一个复制中存在/不存在时(图3B)。

相关荧光和电子断层扫描

如前所述进行相关荧光和电子显微镜检查(Kukulski等人，2012年;Curwin等人，2016年). 简而言之，酵母细胞被高压冷冻（HPM010，AbraFluid），用丙酮中的0.1%乙酸铀酰进行冷冻替代（EM-AFS2，徕卡），并渗透Lowicryl。用切片机（EM UC7，徕卡）切割300 nm切片，并在碳涂层200目铜网格上拾取。将50 nm TretraSpeck荧光微球（荧光和电子密度基准，Life technologies，Carlsbad，CA）添加到网格中进行关联。用于的网格图6A、B,图6补充图1A、B,图8C,图8-图补充1A、和图8-图补充3A后用柠檬酸铅染色以增加对比度。在所有情况下，在每个网格的两侧吸附15 nm蛋白A偶联金珠，并用作覆盖高倍和低倍层析图像的基准标记。使用Serial-EM在300 kV的Technai F30（Thermofisher，FEI）上获得了60°至−60°的倾斜序列(马斯特罗纳尔德，2005年)20000x和3900x或4700x，以便于与TetraSpeck基准进行关联。

为了进行CLEM，在尼康TI-E的图像上采集EM网格的荧光图像(图6A、B)配备sCMOS PCO edge 4.2 CL摄像头和固态照明，或配备MT20（奥林巴斯）灯和CCD（Orca-ER；哈马松光电）的奥林巴斯IX81(图7A、B,图6-图补充1A、B). 为了区分蛋白质荧光信号和荧光基准，对于每个视场/网格，采集了四个通道（GFP、mCherry/RFP、Cy5和brightfield）。使用扩展景深插件在FIJI中进一步处理采集的图像(Forster等人，2004年). 使用ec-CLEM插件进行荧光和重建电子层析图的关联(Paul-Gilloteaux等人，2017年)在ICY中(de Chaumont等人，2012年). 通过点击两种成像模式中对应的TetraSpeck基准对来确定对准。

使用IMOD软件包（Windows版本6.2）和Etomo（版本4.9.8，Kremer等人，1996年). 使用补丁跟踪功能进行无基准图像对齐以进行重建。使用3DMOD软件对断层图像进行手动分割。在Adobe Illustrator（Adobe）中进行了进一步的编辑和注释。视频序列在3DMOD中编译，并在ImageJ/FIJI中进行进一步编辑后导出(Schindelin等人，2012年). 视频帧被压缩为JPG以减小文件大小。

二维电子显微镜

为了检查apq12Δ（CPL1326）和apq12Δchm7Δ（CPL1327）菌株，未固定细胞使用徕卡HMP100在2000 psi下进行高压冷冻，并使用徕卡冷冻AFS装置使用1%四氧化锇和1%戊二醛进行冷冻替代。样品用杜鹃树脂（电子显微镜科学）渗透，并使用徕卡UltraCut UC7切割成100 nm厚的切片。切片收集在formvar/碳涂层镍网格上，并用2%醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用Morada CCD相机和iTEM（奥林巴斯）软件，在80 kV的FEI Tecnai Biotwin TEM中对电网进行成像。

我们感谢Lusk、Beck和King实验室的成员，感谢他们的关键意见，以及M King对手稿的评论。我们还感谢Z Hakhverdyan和M Route在亲和纯化方面提供的宝贵帮助，以及耶鲁-凯克蛋白质组学设施、M Graham和X Liu在EM方面提供的帮助，以及EMBL电子显微镜核心设施和Y Schwab的慷慨支持。这项工作得到了NIH、GM105672对CPL的支持，DJT也得到了5T32GM007223和短期EMBO奖学金6885的资助。MA由EMBO长期奖学金（ALTF-1389–2016）资助。