先天免疫与酒精性肝病

介绍

据估计，美国有1760万酗酒者，全球有1.4亿；虽然并非所有酗酒者都会出现症状性肝病，但美国每年约有12109人死于酒精性肝病[1,2]. ALD的临床谱包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝炎伴或不伴纤维化和肝硬化[2]. 急性酒精性肝炎是最严重的疾病，死亡率高，治疗选择有限。先天免疫系统过度激活是急性酒精性肝炎的主要特征之一，在疾病发病机制中起着重要作用。即使在亚临床脂肪性肝炎中，肝脏炎症的存在也会导致疾病的进展和纤维化的发展。

先天免疫与炎症

炎症是先天免疫系统对病原体或受损自身发出的危险信号的反应[三–6]. 这些病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子（DAMP）被先天免疫系统的细胞通过各种模式识别受体识别。近年来，模式识别受体的几个主要家族被鉴定出来，包括Toll-like受体、Nod-like受体和解旋酶受体（RIG-I，Mda5）。有13种不同的哺乳动物TLR，其中TLR1、2、4、5、6在细胞表面表达，TLR3、7、8、9在内体中表达[4,7]. 每个TLR都有特定的配体识别模式。在模式识别受体（PRR）的帮助下，对危险信号进行免疫识别。在与组织损伤相关的“无菌”炎症中，受损的宿主细胞释放损伤相关的分子模式“DAMP”，这些分子模式被相同的TLR和PPR识别为外源性危险信号[6]. 在某些病理学中，PAMPs和DAMPs可参与并放大炎症反应。

Toll样受体是PAMP进化上保守的传感器。在13个TLR中，大多数在人体内功能活跃。细胞表面表达的TLR（TLR1，2，4，5，6）识别细胞外PAMP，而细胞内定位的TLRs（TLR3，&，8，9）识别核酸序列[4,7]. TLR的细胞质TIR域与适配器分子的TIIR域相互作用，例如除TLR3外，所有TLR使用的My88通用适配器。MyD88募集通过IRK1/4激酶和IKK激酶激活触发下游信号传导，最终导致NK公司-ϰB类促炎细胞因子基因的激活和诱导。TLR3和TLR4利用TRIF适配器激活IKK-ε/TBK-1，导致IRF3或IRF7磷酸化，并在其核移位后诱导I型IFN[4,5,7].

Nod-like receptors（NLRs）是炎症小体复合体的传感器，激活后会导致caspase-1裂解，活化的caspase-1裂解前IL-1，使其具有生物活性并分泌（17 kD IL-1）[6]. 分泌的IL-1通过IL-1受体发挥自分泌作用，增加自身的产生，并通过诱导其他促炎细胞因子来放大炎症[8].

酒精性脂肪性肝炎的炎症与先天免疫

ALD的病理机制涉及酒精及其有毒代谢物对肝脏各种细胞类型的影响、活性氧的诱导以及炎症级联的上调之间的复杂相互作用[9–13]. 使用抗生素对肠道进行“消毒”的研究和消除库普弗细胞（KC）的实验确定，肠源性因子，如脂多糖（LPS）和库普夫细胞活化是ALD发展的核心成分(图1) [14–18]. 研究表明，饮酒会导致肠道屏障功能受损，导致肠源性LPS通过门静脉血输送至肝脏的量增加[19–22]. LPS，也称为内毒素，激活免疫细胞，包括Kupffer细胞（肝脏常驻巨噬细胞），并调节肝细胞、窦内皮细胞和星状细胞的功能[三,23]. 在细胞和分子水平上，LPS被Toll样受体（TLR）4复合物识别，并诱导特定的细胞内激活途径。慢性酒精暴露使巨噬细胞对脂多糖诱导的炎症细胞因子产生敏感，但这种作用的分子机制尚待充分研究[24–26].

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图1。

ALD中的先天免疫激活

急性酒精性肝炎是一种全身前炎症级联激活状态，不仅存在肝内炎症症状，还存在全身炎症症状，伴有肝细胞/肝脏功能障碍。先前的研究确定TNFα是ALD的中心调节剂[27,28]. 免疫组织化学染色显示，人酒精性肝炎患者血清和肝脏中TNFα升高[29,30]. 然而，由于感染并发症，使用抗肿瘤坏死因子抗体阻断肿瘤坏死因子α的人类临床试验被中止[31,32]. 目前用于治疗酒精性脂肪性肝炎、皮质类固醇或己酮可可碱的药物都具有抗炎作用，但疗效有限[33,34]. 研究表明，除TNFα外，促炎细胞因子也增加，包括IL-6、IL-8和IL-1[26,30].

TNFα和IL-1均由与疾病相关和/或损伤相关的危险信号（PAMP和DAMP）通过模式识别受体（TLR和/或炎症小体）诱导[三–6]. 此外，TNFα和IL-1会相互放大其产生和炎症[4–6,8]. 虽然许多细胞产生促炎细胞因子，但单核细胞和巨噬细胞是TNFα和IL-1最强大的来源。在肝脏炎症中，单核细胞通过血液循环从骨髓聚集到肝脏，在那里成为巨噬细胞[7]. 事实上，在AH中，循环单核细胞的表型已经表明炎症级联反应过度激活，因为这些细胞产生TNFα，并显示NF-κB活化增加。因此，在酒精性肝炎中，包括血单核细胞在内的先天免疫系统细胞很可能被过度激活，无法激活限制炎症的稳态调节机制。ALD中单核细胞/巨噬细胞缺乏IL-10的产生支持了这一假设[35]. 在正常单核细胞中，由于TLR耐受性，重复LPS攻击导致TNFα产生减弱，而在暴露于慢性酒精的单核细胞中，TLR耐受性丧失[36]. TLR耐受性的丧失与慢性酒精暴露后单核细胞和饮酒小鼠KCs对LPS的高反应性有关[36].

IL-1在ALD中的作用

酒精性肝病患者血清中炎症细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1增加[27,30,37,38]. 我们评估了用Lieber-deCarli或配对对照饮食喂养C57Bl/6小鼠4周的酒精喂养的效果，发现显著诱导肝脏脂肪变性，并有证据表明肝脏中存在促炎细胞因子诱导。此外，我们发现酒精喂养小鼠的血清和肝脏中IL-1β浓度增加，但IL-1α浓度没有增加。Pro-IL-1β被多蛋白细胞质复合体炎症小体激活的半胱氨酸蛋白酶-1切割[39]. 炎症小体由不同的NOD样受体、危险信号的细胞内传感器、适配器分子（如ASC和cleave pro-Caspase-1）组成，以诱导Caspase-1激活[6]. 我们发现，酒精摄入后，肝脏中Caspase-1活性增加，炎症小体的一些关键成分（包括前天冬氨酸酶1、ASC和NALP3）的mRNA表达也增加(图2). 这些结果表明，IL-1和炎症小体的上调是酒精性肝病发病机制的主要组成部分。

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图2。

小鼠酒精性肝病中炎症成分上调

野生型小鼠喂食对照组（双喂）或酒精组（乙醇-饲料），4周后处死。用qPCR检测肝脏中炎性体成分前半胱氨酸蛋白酶-1、ASC和NLRP3的表达。N=每组5-10只小鼠。图中的数字表示p值。

微RNA在炎症调节中的作用

TNFα生成的调节涉及多个水平，包括有助于微调细胞反应的microRNA。MicroRNAs（miRNAs）是一类进化上保守的、由19-24个核苷酸组成的单链非编码RNA，通过与目标RNA的3'非翻译区（3'-UTR）不完全碱基配对，在转录后水平上控制基因表达，通过抑制其翻译或加速mRNA降解来防止蛋白质积累[40,41]. 来自编码miRNA的基因的转录物称为初级miRNA（pri-miRNA），被加工成前体miRNA（pre-miRA），在转移到细胞质中时，它们被Dicer切割成21–23个核苷酸miRNA双链[41]. 然后将miRNA链加载到RNA诱导沉默（RISC）复合物中[41].

先天性免疫应答由miR-155、miR-125b和miR-146a进行微调，这些miRNAs在其中发挥积极或消极调节靶基因/蛋白质的作用。MiR-155通过增强TNF-α的翻译对其发挥正调控作用[42]. 相反，miR146a作为炎症介质生成的负调节因子，参与TLR耐受，并抑制IRAK-1和TRAF6[43]. MiR-125b作为TNF-α转录后阻遏物发挥作用[42]. MicroRNA-155是一种多功能miRNA，参与多种生物过程，包括炎症、免疫和造血[43]. MiR-155被认为是巨噬细胞炎症反应的组成部分，由TLR配体LPS（TLR4）或poly I:C（TLR3）、包括TNF-α和IL-1B的细胞因子或IFNB诱导[43]. 酒精性肝损伤时，所有这些细胞因子均增加[27,30,37,38]. 相反，抗炎细胞因子IL-10对miR-155的诱导具有负调控作用[5]然而，在肝脏长期饮酒后，这种细胞因子减少[35]. 我们最近证实miR-155的诱导涉及巨噬细胞和Kupffer细胞中NF-kB的激活[44]. 肿瘤坏死因子-α是miR-155研究最多的靶基因，通过转录调控被miR-155s上调[45]. 我们还发现，miR-155介导的TNFα生成增加涉及巨噬细胞中TNFαmRNA稳定性的增加[44].

miRNAs的重要性不仅限于调节细胞内过程，因为它们代表了诊断和治疗干预的新方法。由于其在血清和血浆中的稳定性，miRNAs可以作为包括肝病在内的疾病的生物标记物[46–49]. Mir-122是肝脏特异性的（占肝脏总miRNAs的80%[50])并且在肝细胞中大量表达，在肝细胞中调节脂肪代谢。我们的初步数据和最近的报告表明，循环miR-122在肝损伤中增加，因此可能是一个有吸引力的生物标志物[49,51]. 我们的临床前研究还表明，循环miR-155水平与肝脏炎症相关，因此需要进一步研究miRNAs作为酒精性肝病的生物标志物(图3).

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图3。

酒精相关肝损伤中微核糖核酸的示意图

酒精诱导的肠道通透性增加导致LPS暴露增加，Kupffer细胞致敏，产生促炎细胞因子，如TNFα。Micro-RNA-155是TNFα生成的关键调节因子，酒精增加KC中的miR-155，这导致LPS诱导的KC TNFα产生增加。酒精还使肝细胞对TNFα诱导的细胞损伤敏感。Micro-RNA-122，一种肝细胞特异性miRNA以及miR-155在小鼠酒精诱导肝损伤的血清中增加。

酒精诱导的MiR-155使Kupffer细胞对LPS诱导的TNF-α过度表达敏感

正如我们最近发表的文章所详述的，RAW 264.7细胞中长时间酒精暴露，巨噬细胞型细胞系导致miR-155的表达选择性增加，而不是miR-125b或miR-146a[44,49]. 此外，与未经处理的对照细胞相比，酒精暴露或正常巨噬细胞中miR-155过度表达使LPS致敏，并导致TNFα的产生显著升高。通过使用抗miR-155抑制剂，我们发现通过抑制miR-55可以防止巨噬细胞对LPS的酒精致敏。我们证明，酒精单独增加TNFa mRNA的半衰期，miR-155抑制可以阻止这种作用[44]. 我们发现，体外LPS刺激C57/Bl6小鼠Kupffer细胞可增加miR-155的表达(图4). 此外，小鼠长期酒精喂养导致分离的Kupffer细胞中miR-155水平增加，与配对喂养小鼠的KC相比，这些KC在体内对LPS诱导的miR-55表达增加致敏(图4). 总的来说，这些结果表明慢性酒精增加KC中miR-155，这可能有助于酒精暴露的KC对LPS刺激的敏感性增加，LPS刺激是炎症放大的机制。

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图4。

miRNA-155在酒精喂养小鼠Kupffer细胞中的诱导作用

Leiber DeCarli饮食5周后，从配对喂养或酒精喂养小鼠（n=8–10/组，将两个小鼠的细胞合并）中分离出的Kupffer细胞被置于24孔板上。在电镀2–3小时后去除非粘附细胞，向粘附细胞中添加新鲜培养基，并放置一夜。第二天，用100ng/ml LPS刺激或不刺激细胞6h，用PBS洗涤并在噻唑（Qiagen）中裂解。使用miRNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）通过实时PCR定量miRNA-155的表达。SnoRNA202用于正常化，显示了成对对照组的折叠增加。数据表示平均值±S.E.M.非参数Mann-Whitney检验用于统计分析。

治疗意义

正在出现评估miR作为新治疗干预潜在靶点的证据[49,52,53]. 我们最近报道了酒精诱导的miR-155在KCs对LPS致敏中的调节作用，这为今后在酒精性肝病中应用抗miR-155的策略提供了基础。酒精性肝病的临床谱包括脂肪变性、炎症和酒精性脂肪性肝炎，后者与50%的死亡率相关[54]. 目前可用的治疗方法对酒精性肝炎的疗效有限。使用皮质类固醇的益处有限，并且有感染的风险[31,32]. 抗肿瘤坏死因子-α阻断抗体的早期临床试验基于血清和肝脏肿瘤坏死因子–α水平升高的临床观察，以及TNFR1缺陷小鼠对酒精性肝病的保护。然而，由于感染频率增加，使用抗肿瘤坏死因子α阻断抗体的临床试验中断。Pentoxyfillin是一种抑制肿瘤坏死因子α生成的抑制剂，在临床应用中获益不大[33]. 虽然TNFα和炎症级联的调节仍然是天然免疫系统调节的诱人靶点，而不是完全抑制促炎介质的产生，这对于改善ALD中异常的细胞因子环境是可取的。鉴于miRNAs的微调潜力，它们对炎症过程具有适度的调节作用，它们可能是ALD未来理想的治疗靶点。

致谢

参考文献：