介绍
微小RNA（miRNA）是一个小的非编码RNA家族（约21-25个核苷酸），来源于内源性长转录物（pri-miRNA），其通过翻译抑制作为基因表达调节因子的功能已被证明1,2中枢神经系统（CNS）富含这些小分子，在神经发生、神经发育和突触可塑性方面发挥着重要作用三然而，miRNAs水平的放松调节可能导致神经退行性变和神经疾病4微RNA也被认为是免疫系统反应的重要类似调节因子5但持续的异常表达水平与神经炎症和免疫相关的神经退行性疾病有关，包括多发性硬化6,7、阿尔茨海默病（AD）8，帕金森氏症9或神经元过度兴奋10.
近年来，在酒精滥用领域出现了一个新的参与者，他们证明了神经炎症参与了酒精的神经毒性和行为效应。对人类和实验动物的研究表明，酒精会导致酒精依赖、行为、认知和精神障碍，从而改变大脑功能和结构11最近的研究结果表明，神经免疫系统反应不仅参与酒精诱导的神经退行性变，还参与酒精消费和成瘾12,13事实上，先天免疫受体的激活，如Toll-like（TLRs）和NOD-like受体（炎症组NLRs），似乎是酒精作用于大脑神经免疫反应的重要靶点11,14实验证据表明，酒精可以通过促进TLR和NLR刺激反应和增强下游通路，诱导线粒体ROS生成和氧化应激。转录因子的激活，如核因子卡帕B（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3）触发炎症基因的诱导，导致神经炎症和行为功能障碍15杏仁核突触神经体的最新研究16和额叶皮层17慢性酒精摄入小鼠的研究表明，miRNAs参与了酒精摄入和依赖性的调节。其中一些miRNAs也在死后酗酒者的前额叶皮层中检测到18同样，小鼠小脑miR-155的变化19,20也有人认为酒精引起的神经炎症。
我们以前的研究结果表明TLR4反应在酒精诱导的神经炎症反应中起着关键作用，并且它对与酒精滥用相关的脑损伤和行为功能障碍有贡献14,21因此，通过考虑miRNAs作为免疫系统调节器的影响，本研究的目的是通过大脑中TLR4反应，探讨慢性饮酒诱导的miRNAss的调节作用。为此，我们使用WT和TLR4-KO的皮层（有无慢性酒精治疗）和下一代测序（高通量测序）技术来确定可能差异表达的miRNA谱。生物信息学管道确定了几个与TLR4反应和免疫系统改变相关的miRNAs和调控途径网络。该结果将为miRNAs酒精诊断和治疗的未来应用提供新的方向。
材料和方法
动物
雌性野生型（WT、TLR4+/+)（哈兰·伊贝里卡S.L.，巴塞罗那）和TLR4淘汰赛（TLR4-KO、TLR4−/−)使用了S.Akira博士（日本大阪大学）善意提供的C57BL/6 J遗传背景的小鼠。将动物置于温度为23°C、湿度为60%的受控光照和黑暗条件下（12/12小时）。动物实验是根据欧洲共同体理事会指令（86/609/ECC）和西班牙皇家法令1201/2005中规定的指南进行的，并得到了CIPF动物实验伦理委员会（西班牙巴伦西亚）的批准。
酒精治疗
对于慢性酒精治疗，44只（11只动物/组）7周龄的WT（C57BL/6 J）和TLR4-KO小鼠，体重18–20 g，被饲养（4只动物/笼）并用水（WT和TLR4-KO对照）或含10%（v/v）酒精的水维持。他们被安排吃固体食物随意持续5个月。在此期间，WT和TLR4-KO小鼠以及酒精处理/未处理组的每日食物和液体摄入量相似。如前所述，在5个月结束时，WT（C57BL/6 J）和TLR4-KO小鼠在接受或不接受酒精治疗后的体重增加相似14慢性乙醇治疗5个月后，乙醇处理的WT小鼠的血液酒精浓度峰值（BAL）分别约为≈125 mg/dl（范围为87–140 mg/dl）和≈122 mg/dl，范围为98–135 mg/dl。获得的BAL与之前描述的BAL相似14在慢性酒精治疗后，通过颈部脱位杀死小鼠，利用小鼠脑图谱坐标移除并解剖感兴趣的脑区22立即在液氮中进行snap冷冻，直到用于进一步的测定分析。
微小核糖核酸和总核糖核酸分离
冷冻皮层样品（100–200 mg）用于提取总RNA和小RNA（sRNA）；miRNeasy迷你套件（德国希尔登市齐根市附录A）按照制造商的说明进行了微小修改。使用该方案，我们获得的富含miRNA的部分富含<200个核苷酸的各种RNA，并缺乏rRNA。简单地说，用1毫升QIAzol（Qiagen，Maryland，USA）破坏100-200毫克的组织，然后用苯酚-氯仿法23使用Qiagen试剂盒中的miRNeasy柱分离总RNA和sRNA，以获得每种RNA类型的单独样本。sRNA用于深度测序和RT-qPCR miRNA评估。最后，用总RNA进行基因表达分析。
RNA数量和质量测定
使用NanoDrop™测定每个总RNA样品的数量，并在安捷伦2100生物分析仪中测量数量和质量。使用RNA Nano6000试剂盒（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）分析总RNA完整性，sRNA试剂盒用于sRNAs（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。选择并组合每个条件下的最佳9个样本，以获得4种条件下的3个样本池，生成总共12个样本池的sRNA样本。之后，我们按照制造商的说明，使用小型RNA试剂盒（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）再次测量sRNA图谱，并使用RNA Nano6000试剂盒（安捷伦科技，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）测量总RNA完整性。
小RNA文库制备
从收集的皮层样品中提取100 ng的sRNA部分，用Truseq文库制备小RNA样品制备试剂盒（美国圣地亚哥Illumina）制备sRNA文库。按照Illumina池制造商的指南，这些样品用于HiSeq测序。miRNAs的cDNA通过Superscript II逆转录酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA，USA）获得，在PCR扩增15个周期期间引入了独特的指标。sRNA文库在安捷伦2100生物分析仪中进行可视化和定量。制备了由等摩尔量的sRNA衍生文库组成的复合池。在HiSeq中对库进行50个单次读取周期的排序。2000年（Illumina）。
逆转录（RT）
使用来自大脑皮层组织的2µg总RNA。样品经过处理DNA酶I（Invitrogen，美国加利福尼亚州福斯特市），以避免基因组DNA污染。cDNA转换使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Foster City，CA，USA）进行。反应在主循环ep中进行。5341（德国汉堡Eppendorf AG），在25℃下进行10分钟，然后在37℃下进行2小时，最后在85℃下进行5分钟。
基于逆转录（RT）的TaqMan（®）MicroRNA分析
所选miRNA的表达水平通过定量实时PCR（RT-qPCR）进行确认，所选miRNAs使用TaqMan MicroRNA检测试剂盒检测特定成熟miRNA和TaqMan-Advanced miRNA cDNA合成试剂盒（西班牙巴塞罗那Applied Biosystems），并遵循制造商的协议。
实时定量PCR
RT-qPCR在LightCycler中进行®480系统（德国曼海姆罗氏公司）。包含的反应LightCycler 480 SYBR Green I Master（2个）（罗氏应用科学，德国曼海姆），5μM正向和反向引物和1μL cDNA。根据方程式E=[10（−1/斜率）]，根据Cq值与cDNA输入的关系图计算引物的扩增效率（E）。根据Pfaffl方程计算目标/参考基因的相对表达率24管家亲环素-A（Ppia）被用作内部控制。引物基因序列详见表.
表1
| 基因 | 引物序列（5′-3′） | 大小（bp） |
|---|
| 福沃德 | 反向 |
|---|
| 座椅模块组件3 |
CAG GGC TTT GAG GCT GTC TA公司
|
GGT GCT GGT CACT GTCT GTC
| 105 |
| 地图14 |
广汽CGT TTC AGT CCA TCA TTC
|
AAC ACA TCC AAC AGA CCA ATC A
| 100 |
| PP1-伽马射线 |
GAG AAC GAG ATC CGA GGA CTC
|
CGT ATT CAA ACA GAC GGA GCA A公司
| 142 |
| TPRV1型 |
GCA GGA CAA GTG GGA CAG AT
|
TCG CCT CTG CAG GAA ATA CT公司
| 235 |
| BDNF公司 |
ATT GGC TGG CGA TTC ATA AG公司
|
CTG TTT CCT TTC AGG TCA TGG公司
| 250 |
| 导航1.3 |
CAT TCA AAG GCT GGA TGG AT公司
|
TGA TGA CGC CGA TGA ATA GA
| 159 |
| SIRT1公司 |
AGT TCC AGC CGT CTC TGT燃气轮机
|
CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA
| 198 |
| 轻轨6号线 |
CCA GGA ATG TCT CGA GGC AA
|
GCG ATG GTG GTG GGT TCA AA
| 163 |
| 白细胞介素-1R1 |
TGA AGA GCA CAG AGG GGA CT
|
CAT TGA TCC TGG GTC AGC TT公司
| 169 |
实时定量PCR miRNAs
RT-qPCR在LightCycler®480系统（德国曼海姆罗氏）中进行。根据制造商的方案，使用TaqMan和TaqMan-Advance分析（Applied Biosystems）量化特定miRNAs水平。该反应包含3.5µl DEPC处理过的水（Thermo-Scientific）、1µl cDNA模板、0.5µl TaqMan miRNA分析或TaqMan-Advance miRNA分析引物，以及5µl TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）。miRNA探针的序列如表所示miR-181a和miR-181b用作内部对照。
表2
| 探查 | 地区 | 顺序 |
|---|
| mmu-miR-183-5p | 第7章：129774905-129775014[−] |
UAUGGCACUGUAGAAUUCACU公司
|
| mmu-miR-351 | 变更。十： 53053255-53053353[−] |
UCCCUGAGGAGCCCUUGAGCCUG公司
|
| mmu-miR-150* | 第7章：45121757-45121821[+] |
CUGGUACAGGCCUGGGGAUAG公司
|
| mmu-miR-1981 | 第1章：184822407-184822488[−] |
GUAAAGGCUGGCUUAGACGUGGC公司
|
| hsa-miR-143 | 第五章：149428918-149429023[+] |
UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC公司
|
| hsa-miR-9 | 第1章：156420341-156420429[−] |
UCUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA大学
|
| hsa-miR-21-5p | 第17章：59841266-59841337[+] |
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA公司
|
| mmu-miR-96型 | 第7章：129774692-129774769[−] |
UUGGCACUAGCACAUUUUUGCU
|
| mmu-miR-182-5p | 第6章：30165918-30165992[−] |
UUGGCAAUGGUAGAACACCG公司
|
| mmu-miR-200a-5p | 第1章：1167863-1167952[+] |
CAUCUACCGGACAGUGCUGGA（考古加加古古加）
|
| mmu-miR-200b-5p | 第1章：1167104-1167198[+] |
CAUCUUACUGGGCAGCAUGGA公司
|
| hsa-miR-125b | 第11章：122099757-122099844[−] |
成功
|
| mmu-miR-7224-5p | 第二章：67675457-67675516[+] |
GGGUAGGCCCUCAGUGAAGA公司
|
| mmu-let-7b-5p | 第22章：46113686-46113768[+] |
乌干达
|
生物信息学/管道分析
数据预处理
使用版本0.11.6的FastQC对产生的fastq测序文件进行质量控制分析25然后对Cutadapt版本1中的适配器序列进行修剪826根据Bowtie 2.2.5版的同源非编码RNA（ncRNAs）数据库映射修剪的读取27和TopHat软件2.1.0版28使用归一化和校正后过滤器去除低质量读数、以测序错误或多重不匹配为特征的比对。读取计数是使用Python和PERL编程软件生成的，该软件允许检测和注释感兴趣的假定miRNA。在获得计数矩阵后，通过主成分分析和聚类方法探索基因表达数据29使用M值的修剪平均值对原始计数数据进行标准化30.
差异表达
从生物导体包edgeR分析设计31通过拟合负二项广义线性模型，其中设计矩阵包含所有实验组的一个因子。该测试检测实验组之间差异表达的基因。常规多次测试p值使用Benjamini-Hockberg提出的校正程序导出调整后的p值32.
功能分析
功能富集分析可以确定在大量基因或蛋白质中过度或不足表达的基因或蛋白质类别，并可能与病理学有关。这一步是为基因本体（GO）执行的33使用Sartor及其同事描述的Logistic回归模型的术语34，已调整35–37找出在任何条件下富集的功能块。通过Benjamini–Hochberg程序纠正了多次测试32。我们对DIANA-miRPath v3.0中选定的microRNA簇进行了补充分析38和STRING数据库工具39.
统计方法
我们使用了SPSS 17.0版和R 3.4.3版软件40用于验证分析和生物信息学。Western blot和qPCR数据由学生的t吨-测试。P<0.05的差异具有统计学意义。
结果
利用NGS进行皮层miRNAs的实验设计和初步分析
大脑皮层是酒精作用的重要目标大脑区域14为了评估经酒精处理和未经处理的小鼠皮层中差异表达的miRNAs，采用了深度测序分析。图显示了所采用的方法方案（图). 对于RNA分离，使用了44个皮层样品，尽管其中只有36个具有最佳质量（见补充表S1（第一阶段）)用于深度测序分析。在检查RNAs的质量控制后，生成了12个对应于三池样品/条件（WT、WT+EtOH、TLR4-KO和TLR4-KO+EthOH）的样品。每个条件汇集三个样本，以最大限度地降低成本效益采样策略，因为一些研究表明，汇集可以最大限度地减少低于检测阈值的信息丢失量41.
实验NGS工作流和小RNA质量控制。从44只小鼠（11只小鼠/条件）的皮质中制备小RNA文库。样品用于Illumina平台上的深度测序协议。利用生物信息学一级和二级管道检测miRNAs谱和差异表达miRNAs-分析（A）). 质量控制得分，即测序的所有核苷酸中的Q值均大于39，Q值最佳的长度为51个核苷酸(B类). 通过核苷酸长度映射读取和分布MAPQ的质量（21–25nt代表miRNA读取）(C类). 参考基因组序列中多个位点或唯一位点中对齐的读取数(D类). 读取映射RNA物种的百分比(E类).
生物信息学分析揭示了所获得序列的高质量控制（QC）（补充表S2系列)使用Cutadapt版本1.8过滤数据后26对于序列映射，短阅读比对和获得的序列QC，Bowtie v.2.2.527和TopHat v.2.1.028分别使用。然后，使用Python和PERL编程软件，可以在GO之后检测到假定的miRNAs(www.geneontology.org)（图).
高质量读取序列分布的初步分析三在12个分析样品中，Q值高于39（图). 此外，通过NGS获得的sRNA读取的长度分布显示出一个一致的模式，在19-25nt之间有一个大的峰值，这与miRNAs相对应（图). 图中所示的图表还说明了MAPQ质量相对于非编码sRNA数据库的百分比。该图显示了所有样本中MAPQ≥30的值高达60%，这表明特定sRNA富集。最后，序列的映射分布百分比表明，70%以上的读取映射回基因组中的多个位置，这是miRNAs的固有特征42图中的数据还表明，在所有分析样本中，大约20%的序列是以单个映射的形式分布的。
深度测序后，从12个皮层样本中识别出总共[42.897.767±417609]个原始读数。完成修剪后，95%的序列具有足够的质量水平，可用于进一步分析，共获得[41.461.124±406609]个修剪读数。12个样品的原始、修剪、长度和质量水平也进行了说明（补充表S1（第一阶段）)所有样本的Q值均高于39，这表明sRNA读取的Q值参数良好。数据还表明，在我们的NGS测序样本中获得的总读取数中，约19%的读取与miRNAs序列相对应。尽管snoRNAs是最丰富的群体，但我们获得的miRNAs读数足以评估我们的研究目标（图，补充表第3章).
大脑皮层中最丰富的miRNAs
按照我们的方法学方案，我们通过将读码与miRBase对齐来确定皮层区域的miRNAs谱。通过Burrows-Wheeler比对（BWA）将序列映射到sRNAs数据库，以有效地对齐短序列43。这为12个样本产生了总计2.615.887个miRNA读数（补充表S4系列).
图结果表明，在样品中表达最丰富的miRNAs为：mmu-mir-181a、mmu-mir-26a、mmu-mir-125a、mmu-mir-30d、mmu-mir-125b、mmumir-486a和mmu-mil-486b。这些miRNA约占所发现的总miRNA的50%。
miRNA图谱和差异表达分析。该图显示了小鼠皮层样本中最丰富的miRNA，其中50%的读数被鉴定为七种miRNA（miR-181a、miR-26a、miR-30、miR-125a/b、miR-486a/b）(A类). 我们展示了小鼠皮层样品中miRNAs表达的条件特异性模式(B类). 通过NGS和RT-qPCR技术的敏感性水平验证高通量数据表明，miR-181a是最丰富的miRNA物种，而miR-96在这两种方案中是最低的(C类). miRNAs在我们特定条件下的稳定性分析(D类). 三项研究比较中差异表达的miRNAs的分布（TLR4-KO+EtOH与.KO；我们与.重量；击倒对手与.WT）进行评估。
我们还鉴定了590个miRNAs，它们在所有使用的实验条件下都在皮层中表达（补充表第5页). 因此，我们发现：i）在WT组中表达351个miRNAs，其中21个针对这种情况；ii）在WT+EtOH处理中表达345个miRNAs，其中18个是特异性的；iii）TLR4-KO组中336个miRNA，其中15个是特异性的；iv）314个miRNAs在TLR4-KO+EtOH中表达，其中6个对该实验组特异（图).
图显示了通过RT-qPCR TaqMan miRNA分析验证的miRNA水平，我们对比了NGS数据（黑色条）与.TaqMan（白色条）值。特异性miR-181a主要表达于大脑皮层（图)而miR-96在NGS中的表达最低，如TaqMan RT-qPCR所示（图). 结果还表明，在我们的实验条件下，RT-qPCR的敏感性高于NGS数据。例如，miR-96的RT-qPCR信号优于NGS。
利用生物信息学工具，我们进一步评估了哪些miRNAs在不同实验条件下表现出稳定的水平，以将其用作RT-qPCR分析的内部对照。如图所示，我们选择mmu-mir-181a/-181b作为管家对照，因为这些miRNAs在我们的样本中非常稳定。
大脑皮层中与酒精治疗相关的miRNAs差异表达
我们还评估了实验组中miRNAs的差异表达水平。读取次数/条件分布如下：WT为[701103±20626]；WT+EtOH为[633986±101718]；TLR4-KO为[699894±172107]，TLR4-GO+EtOH为[580904±79332]。表5-S系列显示了三种比较中miRNAs的差异表达：WT与.重量+乙醇，重量与.TLR4-KO和TLR4-KO与.TLR4-KO-EtOH型。还包括比较之间的折叠变化和p值。
补充表S6系列和图在四次比较中显示了miRNAs的差异分布。数据显示，酒精处理上调了7个miRNA，但降低了WT中14个miRNA的水平与未经处理的对照小鼠（图). 我们还注意到，当进行基因型比较时（TLR4-KO与WT），14个miRNA下调，9个上调，这表明TLR4的存在或缺失与小鼠皮层miRNA谱的变化有关（图); 当TLR4受体缺失时，酒精处理只上调了8个miRNA，下调了2个miRNA（图). 此外，TLR4在乙醇条件下的贡献（TLR4-KO-EtOH与WT-EtOH）显示TLR4-KO-EtHO中两个miRNA上调，一个miRNA下调（图).
酒精处理和未处理的WT和TLR4-KO小鼠皮质miRNA表达的热图。热图显示每个研究比较中miRNAs上调（红色）或下调（蓝色）：WT+EtOH与.重量(A类)、TLR4-KO与.重量(B类)，TLR4-KO+乙醇与.TLR4-合格(C类)和TLR4-KO+EtOH与.WT-EtOH（水-乙醇）(D类).
为了验证生物信息学平台获得的NGS数据，我们使用TaqMan RT-qPCR评估miRNAs的相对表达。特别是，我们评估了一些失调（上调或下调）或未被乙醇处理改变的miRNAs。图中的条形图说明酒精处理是如何下调一些miRNAs（mmu-mir-183、mmu-mir-143和mmu-mar-96），而上调其他miRNA（mmu-mir-351、mmu-mir-150、mmu/mir-125b和mmu/mir-1981；mmu-mil-7224和mmu-let7b）或只是没有改变（mmu.mir-9和mmu-mir-21a）。值得注意的是，虽然miR-7224在NGS分析中表现出最高的折叠变化值，但RT-qPCR数据在比较WT中显示出上调的趋势与.WE，RT-qPCR获得的Ct值显示出非常低的扩增。数据还表明，尽管RT-qPCR和NGS有相似的结果，但观察到了变化（图)在一些miRNAs中（例如mmu-mir-351和let-7b）。
RT-qPCR和NGS差异表达分析。图中显示了在WT和TLR4-KO小鼠的皮层中进行的NGS和RT-qPCR比较，无论是否进行乙醇处理(A类–L（左）). NGS黑条表示三个独立生物样本的miRNAs原始读数的平均值（右刻度条）。白色条表示通过RT-qPCR分析在9个组织中获得的miRNAs的平均比率。使用miR-181a和miR-181b对数据进行标准化。条形图表示为[平均值±扫描电镜]*NGS数据的p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，以及#p<0.05，##p<0.01(学生t检验).
图中的结果此外，当比较TLR4-KO和TLR4-KO+EtOH时，酒精处理对大多数分析的miRNAs没有显著影响。然而，与野生型相比，TLR4-KO中mmu-mir-96的表达急剧下降，这表明该miRNA可能是基因型特异性靶标（图). 同样，酒精处理也显著降低了miR-96的表达（图). 如上所述，mmu-mir-181a和mmu-mir-181b均被用作内部控制。
酒精解除对miR-183C簇和miR-200家族的调控
当我们查看NGS和生物信息学分析结果时（图)，我们注意到一组miRNAs在神经疾病、炎症和免疫紊乱中发挥特殊作用，这表明酒精处理的WT小鼠的皮层系统性下调。此外，TLR4-KO小鼠皮层中miRNAs的下降不太明显，这表明受体受到影响。图显示了miR-96、miR-182和miR-183的结构、序列和位置。这些miRNAs属于多顺反子miRNA簇，位于小鼠6q染色体的4kbase区域（图)44.
涉及酒精滥用和TLR4免疫反应的miR-183和miR-200基因簇的基因组组织、结构和表达。(A类)具有保守种子的同源序列121组装小鼠（染色体（Chr.）6，Chr.7人类同源物）mmu-miR-183簇（miRs-183，-96，-182）的miR成分。(B类)miR-200家族形成了位于不同基因组区域的两个簇：簇I miR-200s（miR-200b，-200a，-429）和簇II miR-200（−200c，−141），它们分别位于组装小鼠（第4章和第6章）中，并根据种子序列分为两个功能群121. (C类)NGS数据显示，乙醇处理导致所选miR（miR-96、-182、-183、-200a和-200b）的统计显著表达（倍数变化、统计、p值（pval）、p值调整（padj））。(D类)RT-qPCR显示，在乙醇处理的小鼠皮层中，miR-183、miR-182、miR96（miR-183C）、miR-200a和miR-200b的表达水平存在差异与未经治疗的WT和TLR4-KO小鼠。n=9–11个独立实验*p<0.05，**p<0.01(学生t检验).
第二个需要研究的miRNAs组是miR-200s家族。这组miRNAs由五个成员组成，分为两个簇，miRs-200b/a/429和miRs-2001c/141（图). 五个miR-200s家族成分包含非常相似的种子序列，因为miR-200b/c/429包含AA公司U型ACU公司位于第4染色体上，而miR-200a/141的种子序列为AA公司C类ACU公司，位于第6染色体45因此，我们评估并验证了miR-183C（miR-96、-182和-183），它与神经和自身免疫性疾病相关46以及miR-200s家族中参与炎症途径的miR-200a和miR-200b47通过NGS和生物信息学分析获得的数据表明，酒精处理下调了这些microRNA（图). 特别是，与未经治疗的WT对照组相比，miRNA-96、miR-182、miR-183、miRNA-200a和miR-200b分别减少了-20.69倍、-36.21倍、-32.79倍、-19.34倍和-25.44倍（图). 使用来自WT和TLR4-KO小鼠皮层的新的和独立的RNA样本，以及有无酒精治疗和TaqMan miRNAs RT-qPCR分析，对这些miRNAss进行验证。NGS数据和RT-qPCR验证获得的结果证实，酒精处理下调了miR-183C和miR-200家族（图). 我们还证实，TLR4受体的缺失减弱了酒精滥用诱导的下调作用。
miR-183C和miR-200s家族的相互作用
接下来，我们评估了miR-183C和miR-200a/b靶向的潜在基因/蛋白质，它们与酒精滥用和TLR4免疫反应的影响有关。我们首先从DIANA-miRPath v3.0工具中获得这些miRNAs的靶基因，然后使用STRING数据库工具预测蛋白质-蛋白质相互作用网络显示了蛋白质之间的显著相互作用（p值<1.0e-16），这表明它们作为一个群体存在生物联系。这种方法揭示了63个更多连接的基因中的25个核心组，这些基因是这些差异表达miRNA的靶点，显示出基于证据的共表达和/或共定位。
WT和TLR4-KO小鼠皮层酒精诱导神经炎症中miR-183C和miR-200家族的相互作用体PPI（蛋白质相互作用）网络。(A类)该图显示了miR183C和miR-200家族调节的不同蛋白质，以及参与酒精效应的主要蛋白质（红色），包括TLR4（蓝色）。(B类)RT-qPCR结果显示Nav1.3、Trpv1、Bdnf、Cdca2、Sirt1、Smad3、Mapk14、Lrp6和Il1r1的mRNA表达水平。n=10-11个独立实验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(学生t检验) (B类).
图揭示了miR-183C和miR-200s家族调控的不同基因。在这些基因中，我们选择了Nav1.3（Scn3a）、Bdnf、Tprv1、PP1-γ（Cdca2）和Lrp6，因为它们参与炎症反应和神经病理48–51使用RT-qPCR，我们观察到酒精治疗上调了WT小鼠皮层中Nav1.3表达mRNA的水平，但在TLR4-KO小鼠中未观察到这种上调（图). 酒精治疗也上调了WT小鼠钠通道Tprv1的mRNA表达水平，但不影响TLR4-KO的水平。然而，与WT中的表达水平相比，TLR4受体的缺失增加了皮层中Tprv1基因的表达水平，表明存在基因型效应。
接下来我们评估PP1-γ、Bdnf和Lrp6的表达，这些也由miR-183C直接调节。尤其是，PP1-γ是中枢神经系统中普遍存在的磷酸酶，通过影响这些基因的表观遗传状态，特别是通过组蛋白的翻译后修饰，参与许多脑功能52LRP6基因，一种参与内吞过程的低密度脂蛋白受体相关蛋白653以及通过WNT/β-catenin信号通路调节炎症49图中的结果结果表明，PP1-γ的表达仅在慢性酒精处理的WT小鼠的皮层中增加，而在TLR4-KO小鼠中没有增加。此外，慢性酒精治疗显著增加了WT中Bdnf和Lrp6的水平，但TLR4-KO小鼠的Bdnf与Lrp6水平与对照组相比没有增加。然而，我们注意到Bdnf表达水平的基因型差异。
我们还检测了Smad3、Sirt1、Mpak14和Il1r1，因为这些基因参与神经炎症信号通路并受miR-200a/b家族调控。SIRT1参与细胞凋亡过程，而SMAD3与TNF-α途径相关54酒精处理增加了WT和TLR4-KO小鼠皮层中Smad3的基因表达，而相同的酒精处理降低了WT中Sirt1的基因表达。我们还观察到，酒精处理上调了酒精处理的WT小鼠皮层中Mapk14和Il1r1受体的基因表达，而相同的酒精处理对TLR4-KO没有显著影响（图). 值得注意的是，TLR4-KO小鼠皮层中Il1r1的基础mRNA水平高于WT小鼠，这表明一些基因型效应可能会弥补TLR4的缺失。
miR-183C和miR-200a/b家族靶基因的功能富集鉴定了酒精滥用的分子通路网络
接下来，我们进行了补充分析，以进一步确定酒精滥用、TLR4免疫反应和miR-183C/miR-200s家族的主要生物学功能和关键途径（图). 为此，使用STRING生物信息工具进行功能富集。基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径富集分析是用于研究参与常见生物反应或获得相关功能的基因组的主要过程。KEGG通路富集分析表明，前15条通路增强，包括MAPK-、AMPK-、FoxO-、TGF-β-和Wnt-信号通路、内吞过程、非酒精性脂肪肝和病毒感染等（图). 此外，丰富的GO术语选择了前20个丰富的生物过程，如细胞对酒精的反应、细菌入侵、凋亡、MAPK级联调节、典型Wnt信号通路、小胶质细胞激活和组蛋白修饰等（图).
酒精滥用中差异表达miR-183C和miR-200s家族的KEGG通路和GO富集分析。(A类)显示了前15个最富集的KEGG途径。所有编码功能都根据miR-183C和miR-200家族的KEGG数据库进行注释，其中显示了调控途径，包括这些簇的功能网络。(B类)计算并绘制了前20个富集的GO框架，显示了与生物过程相关的分子基因功能及其与miR-183C和miR-200家族的关系。
上述功能途径（图)高度参与miR-183C和miR-200家族在慢性酒精滥用中的调节作用。事实上，有证据表明miR-200b/c通过靶向ZEB1/2发挥保护作用，这可能与抑制p38 MAPK和TGF-β/Smad3信号通路有关55我们还观察到其他重要通路，如FoxO和MAPK信号通路，在细胞凋亡和神经元发育功能中发挥重要作用，并受一些评估基因调控，如Mapk14、Sirt1、Smad3和Bdnf。此外，TRPV1刺激已被证明可导致小胶质细胞和星形胶质细胞的激活56并且通过c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK在感觉神经元中诱导TRPV1也与神经损伤后的机械性超敏反应有关57.
此外，在表中观察到通路相互作用6-S系列特别是其中一些通路可能通过基因或基因组合相互作用。例如，MAPK和FOXO信号通路可能通过磷酸化P38（MAPK14）相互作用。补充表中提供了KEGG途径和GO术语中基因富集的详细信息第7部分.
简而言之，研究结果强调了miR-183C和miR-200s家族控制的调节性基因过程直接参与了与神经炎症和脑损伤相关的TLR4天然免疫信号反应。
讨论
我们和其他人已经证明了先天免疫系统和TLR4信号反应在乙醇诱导的神经炎症中的关键作用14,20以及与神经死亡相关的神经变性14髓磷脂断裂58和蛋白水解途径的损伤（泛素蛋白酶体和自噬溶酶体）59由于miRNAs是基因表达的重要调节器，在神经退行性疾病中起着关键作用60免疫反应和神经炎症61，我们的目标是评估miRNAs在酒精诱导的免疫TLR4反应和大脑皮层神经炎症中的潜在调节作用。通过进行NGS和生物信息学研究，确定受慢性酒精摄入影响的miRNAs以及TLR4反应在小鼠大脑皮层中的作用，我们确定了一些在慢性酒精治疗小鼠皮层中不同表达的miRNAs，靶向神经元兴奋性，TLR4信号反应和炎症。特别是，我们发现了一组miRNAs簇，miR-183C（miR-183，-96，-182）和miR-200s家族，它们调节MAPK和IL1-R1等靶基因，并且在WT小鼠的大脑皮层上调，但在TLR4-KO中没有上调。这些发现表明TLR4信号在酒精诱导的miRNAs表达中的特殊作用。
MiRNAs在大脑中大量表达60,62,63并且由于单个miRNA结合多个mRNA的能力，在基因表达中起主要调节作用64通过允许细胞快速适应新环境。几项研究表明，酒精滥用解除了miRNAs的调控，并且在人类酗酒者死后额叶皮质和其他区域发现了miRNAs的变化18,65甚至在酒精依赖小鼠的皮层17,66–68例如，miR-152、let-7、mirR-15、miR-140和miR-7等已在人类酗酒者和慢性饮酒小鼠的前额叶皮层中检测到18我们的研究还发现了一些miRNAs（miR-183C、miR-96、miR-451、miR-200、miR-182、miR-146、miR127和let-7b）在酒精依赖早期小鼠大脑皮层上调17虽然我们观察到长期饮酒后这些miRNAs下调，但let-7b上调除外。长期饮酒（5个月）后miRNAs的适应性与短期20天），以及酒精范式和用于评估miRNAs（NGS）的方法的差异与.微阵列）69，可以解释观察到的差异。其他miRNAs，如miR-411，与饮酒有关70而小胶质细胞衍生的let-7b被认为与酒精诱导的神经免疫病理学有关71.使用慢性饮酒小鼠杏仁核突触体（SN）微阵列进行的最新研究和生物信息学分析16已确定一些microRNA-mRNA突触相互作用可能参与酗酒者突触可塑性的异常。这项研究还确定了与星形细胞、小胶质细胞和神经元模块相关的酒精反应性miRNA16不幸的是，通过使用我们的实验方法和全大脑皮层，我们无法检测到乙醇敏感的miRNAs，如之前所报道的那样，这些miRNA与突触神经体、胶质细胞或神经元相关。然而，我们的主要目的是确定与TLR4信号反应相关的酒精神经炎作用相关的皮质miRNAs。
使用高通量数据，以及对小鼠皮层的综合生物信息学分析，我们确定我们样品中50%的原始miRNA对应于七种miRNA（mmu-miR-181a、mmu-miR-26a、mmu-miR-125a、mmu-miR-30d、mmu-miR-125b、mmu-miR-486a和mmu-miR-486b）。其中一些miRNAs，如miR-181a，与多发性硬化的发病机制和TNF-α信号转导有关72,73或miR-125，控制功能性突触整合并参与先天免疫信号的调节74,75然而，当评估与慢性酒精治疗相关的miRNAs的差异表达时，我们注意到，与酒精治疗和未治疗的WT小鼠相比，虽然有14个miRNA下调，但有7个上调。在其他比较中，我们观察到9个miRNA上调，但TLR4-KO+EtOH和TLR4-KO小鼠之间只有一个miRNA下调，酒精对无受体小鼠的影响较小（见表5-S系列).
因此，尽管我们获得了一些因慢性酒精滥用而被解除调控的miRNAs，但当我们观察酒精治疗后差异表达的miRNA的原始和折叠变化时，我们确定并重点研究了在WT小鼠大脑皮层下调的簇miR-183C（miR-182/96/183），但在TLR4-KO小鼠中没有发现显著差异，尽管在一些miRNAs中观察到基因型效应（例如mmu-miR-96）。有趣的是，簇miR-183C代表一个具有同源序列的基因家族46与多种病理学有关，如自身免疫性疾病76神经和神经退行性疾病77,78、神经病理性疼痛79和视网膜变性80值得注意的是，构成上述簇群miR-183C的miRNAs在小鼠早期酒精成瘾阶段的额叶皮层中也被解除了调控17.
我们的结果进一步证明，长期饮酒降低了WT小鼠大脑皮层中miR-200s家族（miR-200a/b）的表达，而同样的酒精治疗只显著影响了TLR4-KO小鼠大脑皮质中这些miRNAs的表达水平。miR-200s家族参与TLR4/NF-κB炎症信号通路81，调节小胶质细胞诱导的神经炎症通过cJun/MAPK信号通路82也在神经病理性疼痛中起作用83因此，一些作者描述了神经免疫疾病相关基因的诱导84,85小胶质细胞活化与神经炎症14,86，TLR4/NF-κB炎症信号11,14和神经变性85在慢性酒精滥用的人类和动物模型中观察到。因此，miR-183C和miR-200a/b家族的下调有望触发上述过程。其他研究进一步证明，慢性饮酒小鼠小脑中miR-155的诱导有助于神经炎症。值得注意的是，这些效应依赖于TLR4反应，因为酒精喂养的TLR4-KO小鼠可以免受小胶质细胞miR-155的诱导，这支持TLR4信号反应在酒精诱导的神经炎症中的作用20.
证据表明miR-200家族和miR-183C可以协同工作。事实上，STRING数据库工具预测了一个常见的蛋白质-蛋白质相互作用网络（图). 这些miRNA家族成员协调人类胚胎干细胞的神经诱导87通过促进朊病毒疾病的终点88或病毒感染后大脑损伤47MiR-200和MiR-182也通过在缺血预处理后上调其表达而参与缺血，并在后期具有神经保护作用89.
MiRNAs具有通过碱基对互补影响不同目标的能力90当我们观察由两个簇、miR-183C和miR-200s家族调控的靶基因时，通过使用功能富集，我们可以识别相关病理学中过度或红外表达的基因类别（参见图)，我们选择了一些受miR-183C调控的靶基因，如Nav1.3、BDNF和TPRV1。因此，我们发现慢性酒精滥用增加了WT小鼠皮层中这些基因的表达，与未经治疗的对照小鼠相比，TLR4-KO略有变化。
早期研究还表明，高麻醉酒精浓度会抑制钠通道Nav1.391，尽管在慢性酒精治疗中出现的较低的酒精水平可以通过增加其表达水平来促进适应，因为Nav1.3的上调与大鼠创伤性脑损伤的严重程度有关92另一个基因是香草酸受体TRPV1，一种传入神经元的多模离子通道，似乎在与炎症相关的痛觉过敏中起作用93,94酒精增强TRPV1的反应，而Hirota的研究等.提示酒精引起炎症组织的感觉反应95该通道还参与酒精的特定行为行为，因为小鼠TRPV1的缺失会改变酒精的行为效应96.
miR-183C调节的另一个靶基因是BDNF，它是突触可塑性的一个重要调节剂，与信号机制相关，并通过调节与饮酒行为相关的突触可塑性在特定脑回路中发挥作用97事实上，在大鼠内侧额叶皮质中的miR-206被认为可以调节BDNF和饮酒98而BDNF多态性增加了小鼠的强迫饮酒99值得注意的是，乙醇处理不会影响TLR4-KO小鼠BDNF mRNA的水平，因为这些小鼠的BDNF水平高于WT小鼠，这表明存在一些基因型差异。因为BDNF是一种神经保护剂100,101如之前的研究所报道的，增加这种营养因子可能会对乙醇诱导的神经病理学提供一些保护14,58，但不影响饮酒行为102.
同样，LRP6是由miR-183调节的Wnt-protein结合，有助于调节糖异生、胰岛素分泌和糖尿病103LRP6是Wnt-Fzd-LRP5-LRP6复合物的一个成分，它触发Wnt/β-catenin信号通路，可以调节TNF-α诱导的炎症反应。事实上，Wnt和NF-kB信号传导是相互关联的，因为重组Wnt蛋白诱导NF-kB核移位及其靶DNA结合49一些研究表明，产前酒精暴露通过导致胎儿酒精谱紊乱，抑制Wnt信号在人类NSC分化中的作用104尽管我们发现慢性酒精治疗的WT小鼠的皮层中LRP6增加（图). 其他功能表明LRP6是细胞表面内吞受体53也与阿尔茨海默病有关105.
最后，蛋白磷酸酶PP1-γ是大脑中普遍存在的一种磷酸酶，参与许多功能，包括通过组蛋白翻译后修饰影响这些基因的表观遗传状态来调节记忆形成相关基因52最近的研究表明，PP1-γ涉及miR-183C及其在记忆形成过程中的选择性调节106引人注目的是，最近一项关于人类酗酒的研究表明，PP1-γ的抑制与巨噬细胞TLR4/TRIF激活的抑制相关107此外，还发现其他核基因磷酸酶（如PPM1G基因座）的高甲基化与酗酒障碍患者早期饮酒升级和冲动性之间存在关联108.
本研究进一步证明了miR-200a/b家族调控的基因，如SIRT1、MAPK14、SMAD3和IL1-R1，在长期饮酒的WT小鼠的皮层中上调，并且对酒精处理的TLR4-KO小鼠皮层中的表达几乎没有或没有显著影响，尽管IL1-R1的表达显示出一些基因型效应，如该受体的基因表达增加所揭示的，这可能是为了补偿TLR4的缺失。这些靶基因提示在调节大脑中的酒精作用中很重要，并且参与神经免疫信号和昼夜节律。例如，p38 MAPK（MAPK14）参与TLR4/IL-1R1通路，并导致促炎细胞因子的产生109一些研究表明，p38 MAPK信号通路调节酒精诱导的神经退行性变110类似地，酒精激活IL1-R1111,112通过触发与TLR4响应相同的信号通路。事实上，TLR4导致细胞因子和炎症介质的产生，参与与饮酒相关的神经炎症、脑损伤和行为反应11,14,113,114服用抗炎化合物或阻断TLR4可大大改善酒精的神经炎效应115,116长期饮酒也会增加大脑中的IL-1β14,20IL-1β和IL-1RN（拮抗剂）的遗传多态性与人类酒精依赖风险相关117,118.
miR-200家族调控的另一个基因是SIRT1，它编码一个高度保守的NAD家族+-依赖性脱乙酰酶作为细胞传感器检测能量可用性并调节代谢过程。SIRT1是哺乳动物sirtuins中研究最深入的成员，在大脑中表达，是调节树突和轴突生长的多个相互连接的调节网络的关键组成部分。SIRT1通过调节BDNF调节突触可塑性119也是防止衰老的神经保护剂，控制能量代谢和昼夜节律120,121因此，一些研究表明，酒精通过影响生物钟与昼夜节律相互作用，而一些基因，如PER2，促进饮酒122据报道，慢性酗酒者的几个昼夜节律钟基因发生了改变123引人注目的是，我们观察到TLR4-KO如何显示一些基因型效应，因为SIRT1水平高于WT小鼠。TLR4-KO小鼠中较高水平的BDNF和SIRT1可以促进对乙醇诱导的神经病理学变化的保护。
总之，目前的结果强调了大脑皮层中新的推测miRNAs，它们参与酒精诱导的神经炎症和TLR4信号反应。NGS数据显示miR-183C和miR-200s家族可以调节与酒精滥用相关的神经炎症途径。我们进一步提出了丰富的GO和KEGG功能网络分析，这些分析开辟了可能的新治疗基因靶点，以防止与大脑TLR4免疫反应相关的酒精滥用的有害影响。
