HRD4/NPL4泛素化ER蛋白的蛋白酶体加工需要

酵母菌株

表中列出了本研究中使用的酵母菌株的基因型​表1。1以下等位基因如前所述：hrd1–1、hrd2–1和hrd1Δ：：TRP1，ubc6Δ：：KanMX，ubc7Δ：：HIS3. (汉普顿等。, 1996;汉普顿和巴克塔，1997年;威尔霍夫斯基等。, 2000). 这个编号116Δ等位基因通过转化引入RHY400编号116前面描述的Δ删除构造用于创建RHY877(温特和布洛贝尔，1993年). 删除核能116经抗Nup116p抗体免疫印迹证实。有机发光二极管1⁺和机油1Δ应变如前所述NPL4号机组⁺/npl4–1/npl4-2,CDC48型⁺/cdc48–2，和不明飞行物1/不明飞行物1–1菌株(斯图基等。, 1990;约翰逊等。, 1995;Latterich（锁存器）等。, 1995;德霍雷修斯等。, 1996). 所有菌株均按照标准技术构建(Guthrie和Fink，1991年). 如前所述，酵母菌株在酵母最少的培养基中生长(汉普顿等。, 1994)，图中的板除外​图4，4，使用合成完整介质（面板C中的-尿嘧啶），按说明制备(Guthrie和Fink，1991年). 将油酸和棕榈油酸添加到培养基中，从10%的无水乙醇储备到每个不饱和脂肪酸（UFA）的最终浓度为0.5 mM。将百分之一的Tergitol NP-40（西格玛，密苏里州圣路易斯）添加到含有UFA的板中以进行溶解。（Tergitol NP-40与Nonide NP-40[sigma]不同，后者对酵母有一定毒性[我们未公布的结果和个人沟通，Charles Martin]）

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图4

不饱和脂肪酸或有机发光二极管1过度表达不能抑制hrd4–1档细胞。（A-C）在标记每个面板的条件下培养所示菌株的系列稀释液。“+UFA”表示将0.5 mM油酸和棕榈油酸添加到标记板中。“洛伐他汀”表示添加200μg/ml洛伐他丁。

质粒

酵母着丝粒质粒pRH590（YCpNPL4号机组)通过PCR扩增NPL4号机组基因文库质粒pRH562的基因座，使用Vent DNA聚合酶(新英格兰生物实验室，Beverly，MA）和引物oRH571:5′-AAGCTATGTGATTTTGGTAGGGGACG-3′和oRH572:5′-GGTACGGCAA-ACTCAAGTAGTGCGTAC-3′。然后用Hin公司dIII和千磅I和连接成pRS416，用相同的酶消化。p的积分形式NPL4号机组（pRH617）通过结扎千磅我-囊pRH590的I片段包含NPL4号机组到pRS406中。这个P（P）_TDH3型-1度-GFP（绿色荧光蛋白）融合是通过对GFP编码基因的PCR扩增创建的^S65T系列（包含在pRH465中），带有以下引物：oRH1219 5′-CGCGGGGATCAAAATGGGTAAGGAGAGAACATT-3′和oRH1220 5′-CAAATGTGGTGATCTGAT-3′。产品被消化巴姆HI和萨尔I并连接到pRH421（包含1度序列）切割Bgl公司II和萨尔一、。

N-末端规则和UFD途径底物的构建如下。泛素-X-GFP融合（X表示泛素的甘氨酸76之后的氨基酸残基）先前构建用于在哺乳动物细胞中表达(丹图马等。2000年). 基于pEGFP-N1的（商业载体：Clontech公司)泛素M-GFP结构被消化Nhe公司我和BsaHI公司然后将含有泛素M-GFP-orf的2.4 kb片段连接成Spe公司我-克拉我消化了pRH1556，这是一个先前描述的ARS/CEN质粒，用于驱动来自TDH3型发起人(芒伯格等。, 1995). 由此产生的质粒pRH1561用作泛素-R-GFP、泛素-L-GFP，泛素-P-GFP和泛素的受体载体^G76伏-GFP或之前描述的(丹图马等。, 2000). 每个orf都是通过消化从哺乳动物表达载体中提取的生态RI和不是I.然后将1000个碱基对片段连接到pRH1561的7.3kbp主干，形成pRH1562（泛素-R-GFP）、pRH1563（泛素-L-GFP^G76伏-GFP）。以下质粒如前所述：CPY*-HA，P（P）_KAR2标准-GFP公司,编号116Δ：：URA3，和2μ有机发光二极管1(温特和布洛贝尔，1993年;波拉德等。, 1998;张等。, 1999;Ng公司等。, 2000).

蛋白质降解检测

如前所述进行固定槽和环己酰亚胺槽(汉普顿等。, 1994;克罗宁和汉普顿，1999年)和方法在图形图例中进行了总结。使用BectonDickinson FACScalibur™仪器进行流式细胞术。流式细胞术数据的统计分析如下所述(杨，1977年). 图形的图形​图6B6B和​和7D7创建D是为了量化图中所示实验中免疫反应性的损失​图6A6A和​和7C，7C、 分别是。免疫印迹后获得不同曝光的x射线胶片，并使用NIH Image 1.61 MacOS软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）、UMAX PowerLook 1100扫描仪和Power Macintosh G4计算机以600 dpi分辨率进行扫描。然后根据提供的说明，使用适用于MacOS的NIH Image 1.61程序对这些扫描图像进行密度分析。该分析确定每个像素的灰度（x射线胶片曝光度），并确定单个波段的总曝光度。对每个频带使用“阈值”测试，以确保没有像素饱和，因此可以在时间点之间进行有效的线性比较。然后，这些数据表示为随着时间的推移免疫反应性的丧失，在时间0时的暴露设置为100%免疫反应性。

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图6

Deg1-GFP的降解不受hrd4–1档突变。（A） 通过在采集前的指定时间向对数相细胞中添加环己酰亚胺，对Deg1-GFP进行环己酰氨追踪。用SDS-PAGE对等量的细胞进行裂解和分析，然后用抗GFP抗体进行GFP免疫印迹。（B） 环己酰亚胺追踪期间Deg1-GFP免疫反应性的丧失。对（A）中获得的数据进行密度分析，以确定0、30和60分钟时每个指示菌株中GFP免疫反应性的损失。（C）通过流式细胞术测定指示菌株的Deg1-GFP蛋白的稳态荧光。以下菌株的荧光相同：人力资源4⁺ 1度-GFP,hrd4–1度1-GFP，和a人力资源4⁺完全没有GFP结构的菌株转化（细胞自体荧光）。所有实验均在30°C的允许温度下进行。

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图7

几种细胞溶质蛋白的降解需要26S蛋白酶体，但不需要Hrd4p。（A） 用流式细胞术检测含不同N端氨基酸的GFP融合子的稳态荧光。（B） UFD底物泛素的降解^G76伏-采用环己酰亚胺追踪法和流式细胞术检测GFP。（C） 泛素的环己酰亚胺追踪^G76伏-GFP随后使用抗GFP抗体进行免疫印迹。（D） 泛素损失^G76伏-通过对（C）中获得的数据进行密度分析，确定放线菌酮追踪期间的GFP免疫反应性。

核进出口受阻不影响ERAD

npl4号机组突变体在核进出口中有缺陷，最初是由于这种缺陷而被分离出来的。然而npl4号机组核进口/出口的突变缺陷出现在转换到37°C的限制温度后(德霍雷修斯等。, 1996). 在30°C的温度下，核运输似乎没有明显缺陷npl4-1、npl4-2或小时4–1细胞。相反，相同的npl4/小时4在30°C的允许温度下，细胞表现出ERAD的实质性缺陷，几乎没有可检测的生长缺陷。（注：本文中的所有降解试验均在30°C的允许温度下进行，图中的试验除外​图3）三.）因为核进出口在30°C时没有受到重大影响npl4/小时4核进口/出口不足不足以解释ERAD缺陷npl4/小时4细胞。毕竟，ERAD缺陷存在于hrd4/npl4型细胞在30℃时，而核转运缺陷在30℃下不存在。尽管如此，我们测试了用一个明显的突变阻断核输入/输出是否会对ERAD产生任何影响。为了阻断核质运输，我们使用了对温度敏感的菌株编号116Δ等位基因。损失真诚地核孔蛋白Nup116p(霍等。, 2000;路线等。, 2000;斯特朗等。, 2000)导致核运输在转换到37°C的限制性温度后严重受阻(Wente和Blobel，1993年). 我们选择了编号116Δ等位基因有几个原因。首先，我们可以通过使用编号116Δ细胞，为ERAD核转运的任何要求提供了严格的测试。其次，核转运受阻和核膜疝的出现编号116Δ细胞与npl4号机组非允许温度下的突变细胞(温特和布洛贝尔，1993年;德霍雷修斯等。, 1996). 因此，更新116Δ在核交通中提供了一种相当于npl4号机组与此一致的是，核能116和NPL4号机组也显示出影响类似功能的遗传迹象，如NPL4号机组可以部分抑制编号116Δ应变(德霍雷修斯等。, 1996). 这些众多的相似之处使得编号116Δ特别适用于测试核交通阻塞是否是ERAD表型的基础npl4号机组突变体。

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图3

核转运阻滞对内质网膜蛋白的降解没有影响。（A） 表达组成降解6MYC-Hmg2p的指示菌株在23°C的允许温度下生长。日志阶段（OD₆₀₀=0.1）在添加环己酰亚胺之前，将细胞移动到37°C的限制温度下3.5 h，然后在指定时间进行后续追踪。在此期间，野生型细胞以正常速度加倍，而对温度敏感hrd4–1档和编号116温度变化后，Δ电池甚至未能完成一次额外的倍增。在添加环己酰亚胺后的指定时间收集等量的细胞并进行裂解。然后通过SDS-PAGE分离这些裂解物，并进行myc表位标签的免疫印迹。（B） Nup116蛋白缺失于nup116Δ 细胞。使用Nup116p抗体对所示菌株的裂解液进行SDS-PAGE和免疫印迹。

我们介绍了编号116Δ等位基因转入表达6myc-Hmg2p的菌株。免疫印迹法证实Nup116蛋白缺失。Nup116p免疫反应在野生型菌株中存在，但在nup116Δ应变（图​（图3B）。三B） ●●●●。正如之前对nup116Δ等位基因(温特和布洛贝尔，1993年)，缺乏Nup116p的菌株对温度敏感（我们未发表的结果）。编号116Δ细胞对洛伐他汀无耐药性，表明Nup116p的缺失并未导致6myc-Hmg2p降解的显著缺陷（我们的未发表结果）。此外，使用6myc-Hmg2p的生化分析，我们发现编号1166myc-Hmg2p稳定性Δ。在这些分析中，野生型，hrd4–1档和编号116Δ细胞在23°C的允许温度下生长。在添加环己酰亚胺和随后追踪6myc-Hmg2p免疫反应之前，将细胞移到37°C下3.5小时。这一向37°C的转变引发了年核进口/出口的快速而深刻的阻碍nup116Δ单元格(温特和布洛贝尔，1993年). 尽管核质交通受阻，nup116Δ细胞在6myc-Hmg2p降解中没有检测到缺陷（图​（图3A）。三A） ●●●●。hrd4–1档在相同条件下，细胞显示6myc-Hmg2蛋白几乎没有降解（图​（图3A）。三A） ●●●●。因此，尽管由于编号116Δ等位基因和尽管有许多表型相似性更新116Δ和npl4/小时4突变体。

不饱和脂肪酸和Npl4p

在酵母中，不饱和脂肪酸（UFA）是通过Ole1p的作用合成的，Ole1p是一种Δ9脂肪酸去饱和酶，催化棕榈酰辅酶a（16:0）和硬脂酰辅酶a（18:0）分别生成棕榈油酸（16:1）和油酸（18:1）(斯图基等。, 1990). 这个有机发光二极管1基因是必不可少的，但添加棕榈油酸或油酸可以恢复生长机油1Δ电池(张等。, 1999). 的转录有机发光二极管1该基因需要两个相关且冗余的转录因子：Spt23p和Mga2p(张等。, 1999). 最近，有研究表明，Spt23p和Mga2p是作为驻留在内质网/核膜中的非活性蛋白质制造的。为了成为活性转录因子，Spt23p和Mga2p在UFA调节的过程中被处理，需要26S蛋白酶体(霍普等。2000年). Mga2p和Spt23p的处理需要HRD4/NPL4(希区柯克等。, 2001). 由于UFA对整个细胞膜的功能至关重要，并且ERAD发生在ER膜上，我们不得不问hrd4/npl4型突变菌株是不饱和脂肪酸（UFAs）缺乏的结果。我们首先通过测试UFA是否可以逆转小时4突变菌株。

为了测试温度灵敏度的反转，人力资源4⁺和hrd4–1档细胞被置于含有或不含不饱和脂肪酸的培养基上。然后在一系列允许和限制温度下培养这些平板。在35°C时，hrd4–1档即使在含有不饱和脂肪酸的培养基上，细胞也无法生长（图​（图4A）。4A） ●●●●。人力资源4⁺细胞在两种培养基上均在35°C下生长（图​（图4A）。4A） ●●●●。使用一系列限制温度，我们发现当hrd4–1档细胞在33°C的UFA培养基上培养（我们未发表的结果），但在没有温度的情况下，我们观察到hrd4–1档细胞仅在UFA培养基上生长，在缺乏不饱和脂肪酸的培养基上不生长。因此，添加不饱和脂肪酸对Ts的影响很小（如果有的话）⁻表型hrd4–1档细胞。在相同的实验中机油1Δ添加不饱和脂肪酸后，细胞完全逆转。我们还测试了npl4–1和npl4–2不饱和脂肪酸抑制的等位基因，注意这些等位基因是在不同的亲本菌株中分离出来的hrd4–1档等位基因。然而，两者都是npl4–1和npl4–2型即使将UFA添加到培养基中，细胞也无法在37°C下生长（我们尚未公布的结果）。尽管UFA未能恢复野生型增长npl4型突变菌株，添加UFA确实允许npl4号机组突变菌株能够耐受限制温度升高1°C，如npl4–1和npl4–2细胞只有在含有UFA的培养基上才能在34°C下生长（我们尚未公布的结果）。因此，确实存在部分抑制npl4号机组UFA的温度敏感性，但没有完全抑制。这些结果与希区柯克等。(2001)谁发现UFA可以部分抑制npl4–1和npl4–2菌株。

我们还寻找抑制npl4/小时4使用有机发光二极管12μ（多拷贝）质粒。抑制npl4/小时4突变体有机发光二极管12μ质粒是对Npl4p和Spt23p/Mga2p之间遗传关系的重要测试，因为有机发光二极管12μ质粒完全抑制a的生长和UFA表型镁2Δspt23型^ts秒双突变株(张等。, 1999). 尽管镁2Δspt23型^ts秒突变株不能产生有机发光二极管1在限制温度下转录，用油12μ质粒产生丰富的有机发光二极管1信使核糖核酸，允许完全互补(张等。, 1999). 如果失去Npl4p/Hrd4p功能的唯一影响是无法处理（并因此激活）Mga2p和Spt23p，那么npl4/小时4功能丧失突变体的表型应与mga2 spt23功能丧失突变体，因此会被过度表达的有机发光二极管1。我们通过转换人力资源4⁺和hrd4–1档2μ的菌株有机发光二极管1作为高拷贝抑制因子分离的质粒镁2Δspt23型^ts秒突变。在35°C下电镀时，hrd4–1档即使携带有机发光二极管12μ质粒，尽管死亡前在带有有机发光二极管1质粒。（图​（图4C）。4C） ●●●●。对于npl4–1和npl4–2等位基因，我们只看到补充UFA后出现的部分抑制-有机发光二极管1过度表达使限制性温度升高1°C，但不能恢复野生型生长npl4–1或npl4–2菌株（我们未发表的结果）。相比之下有机发光二极管12μ质粒能够完全恢复生长机油1Δ细胞。

我们还测试了不饱和脂肪酸和油1过度表达以抑制hrd4–1档菌株。人力资源4⁺和hrd4–1档细胞被放置在含有或不含洛伐他汀的培养基上。hrd4–1档即使添加UFA，细胞对洛伐他汀的电镀效率也相同（图​（图4B）。4B） ●●●●。同样，hrd1–1档无论平板是否添加了UFA，细胞也表现出对洛伐他汀的耐药性（图​（图4B）。4B） ●●●●。人力资源4⁺两例患者的细胞均对洛伐他汀敏感。同样hrd4–1档含2μ有机发光二极管1质粒未能恢复降解，因此逆转了洛伐他汀耐药表型（图​（图4C）。4C） ●●●●。人力资源4⁺细胞同样对洛伐他汀敏感，无论是用空的还是有机发光二极管12μ质粒。这些结果表明hrd4/npl4型降解缺陷不是由于细胞中低不饱和脂肪酸浓度的间接影响。

Hrd4p在泛素-蛋白酶体途径中的泛素化后-蛋白酶体前步骤中的功能

Hmg2p和其他蛋白质的ERAD通过泛素蛋白酶体途径进行。先前描述的Hrd蛋白在该途径中的两个不同步骤中起作用：它们是E2/E3泛素化机制（例如Hrd1p、Ubc7p、Ubc1p）或26S蛋白酶体本身（例如Hrd 2p/Rpn1p）的组成部分(汉普顿等。, 1996;海湾等。, 2001). E2和E3蛋白是蛋白质泛素化所必需的，因此它们的丢失会消除泛素化。相反，26S蛋白酶体组分的缺陷使蛋白质完全泛素化。我们通过测试Hmg2p在泛素介导的降解过程中的泛素化，来检测Npl4p/Hrd4p在何处发挥作用npl4/小时4突变菌株。

Hmg2p的泛素化受到反馈调节，改变Hmg2p（甲羟戊酸）途径的药物也会改变Hmg 2p的泛素化。Zaragozic acid是一种途径酶角鲨烯合成酶的抑制剂，通过积累Hmg2p降解的自然信号，增加Hmg 2p的泛素化。（图​（图55和汉普顿和巴克塔，1997年;Gardner和Hampton，1999年). 当在野生型中检测泛素化时人力资源4⁺菌株，Hmg2p泛素化通过添加5分钟的zaragozic酸而显著增加（图​（图5，5，“ZA”）。这也是hrd4–1档和小时2–1菌株，显示Hmg2p的全调节泛素化（图​（图5）。5). 相比之下hrd1型Δ菌株显示Hmg2p没有泛素化，即使在最大限度地受到扎拉果酸刺激时（图​（图5）。5). 因此，Hrg2p的实际泛素化并不需要Hrd4p/Npl4p，但与Hrd2p/Rpn1p一样，Hrd4p/Npl4p也需要降解完全泛素化的Hmg2p。

因为两者都是小时4和蛋白酶体hrd2/rpn1型突变体允许Hmg2p的泛素化但不降解，我们询问Hrd4p/Npl4p是否是一般蛋白酶体降解所必需的。为了测试hrd4–1档等位基因对26S蛋白酶体的活性，我们评估了几种细胞溶质蛋白的降解。第一个蛋白质Deg1-GFP是GFP的一个变体，在其N末端具有Deg1序列（Deg1-GFP）。Deg1序列源于快速降解的Matα2蛋白，符合“degron”的经典定义，因为它可以转移到许多不同的稳定蛋白质，通过泛素蛋白酶体途径将其靶向降解(曲棍球运动员等。, 1991;陈等。1993年). 事实上，将Deg1序列添加到GFP中导致蛋白质迅速降解（图​（图6A6A和我们未公布的结果）。事实上，这种Deg1-GFP融合被迅速降解，流式细胞术中的稳态荧光几乎无法检测到野生型细胞的正常细胞自体荧光（图​（图6C6C和我们未发布的结果）。只有当Deg1-GFP降解受到ubc6型Δubc7型Δ双突变是Deg1-GFP表达细胞明亮（图​（图6C）。6C） ●●●●。两组之间的荧光无差异人力资源4⁺和hrd4–1档单元格，表示人力资源4降解Deg1 GFP不需要（图​（图6C）。6C） ●●●●。我们通过环己酰亚胺追踪检测Deg1-GFP的稳定性，然后进行免疫印迹而非流式细胞术来证实这一点。Deg1-GFP确实迅速降解（图​（图6A6A和​和6B）。6B） ●●●●。这种降解在ubc6型Δubc7型Δ应变（图​（图6A6A和​和6B），6B） ，符合这些要求的观察结果UBC公司Deg1介导降解中的基因(陈等。1993年). 同样，26S蛋白酶体基因的功能丧失HRD2/RPN1型也损害了Deg1-GFP的降解（图​（图6A6A和​和6B），6B） ，这也符合前面描述的Deg1介导降解中26S蛋白酶体的要求(德马里尼等。, 1995). 与此形成鲜明对比的是，Hrd4p/Npl4p功能的丧失对Deg1-GFP的降解率没有明显影响（图​（图6A6A和​和6B）。6B） ●●●●。因此，我们得出结论，蛋白酶体功能在hrd4–1档因为蛋白酶体依赖性底物Deg1-GFP的降解不受hrd4–1档突变。我们通过测试hrd4–1档关于泛素介导的蛋白酶体降解的另外两条途径：N端规则和UFD（泛素融合降解）途径(约翰逊等。, 1995;瓦沙夫斯基，1996). 为了测试对N端规则通路的影响，在细胞中表达泛素-R-GFP、泛素-L-GFP和泛素-P-GFP融合物人力资源部⁺，hrd4–1和小时2–1菌株。正如预期的那样，泛素-R-GFP因体内泛素部分裂解产生的精氨酸氨基末端残基的存在而不稳定（图​（图7A7A和我们未公布的结果）。泛素-R-GFP在两种药物中的降解速度相同人力资源部⁺和hrd4–1档菌株，但在小时2–1应变（图​（图7A7A和我们未发表的结果）。其他N端规则底物，泛素-L-GFP和泛素-P-GFP也有相同的结果（图​（图7A7A和我们未发表的结果；注意，泛素P-GFP也因泛素部分的缓慢裂解而受到UFD降解）。

与泛素P-GFP一起，我们检测了另一种UFD底物泛素的降解^G76伏-GFP。（泛素中羧基末端甘氨酸的突变阻断了泛素部分的裂解，并使整个融合不稳定。）^G76伏-GFP在两种情况下都迅速降解人力资源部⁺和hrd4–1档菌株（图7B-7D），但其降解速度因小时2–1突变。尽管泛素^G76伏-GFP降解对26S蛋白酶体的缺陷非常敏感，其降解不受Hrd4p/Npl4p功能丧失的影响。综上所述，对三种不同类别的可溶性蛋白酶体底物的研究表明，Hrd4p/Npl4p的丢失不会影响一般蛋白酶体功能。此外，hrd4–1档与之前测试的大多数蛋白酶体突变体不同，菌株对氨基酸类似物卡纳凡尼的敏感性没有改变（我们未发表的结果）(希尔特等。1993年;海涅梅尔等。, 1994;傅等。, 1998;鲁宾等。, 1998).

ERAD中新步骤的Hrd4p/Npl4p函数

我们之前在ERAD中的遗传学研究确定了两大类突变体：阻止靶蛋白实际泛素化的突变体和影响蛋白酶体功能的突变体。例如，Hrd1p和Hrd3p是ERAD专用泛素连接酶的组成部分，而Hrd2p/Rpn1p是26S蛋白酶体的亚单位(汉普顿等。, 1996;加德纳等人，2000年;海湾等。, 2001).HRD4/NPL4Hmg2p的泛素化并不需要，这与观察结果一致HRD4/NPL4用于降解具有不同E3和E2要求的基板。因为npl4号机组突变体不属于第一类突变体，我们测试了是否hrd4/npl4型突变体的蛋白酶体功能有缺陷。我们发现蛋白酶体在hrd4/npl4型突变细胞降解多种细胞溶质、蛋白酶体依赖性底物在hrd4/npl4型突变细胞。我们还观察到hrd4/npl4型与其他蛋白酶体突变体不同，突变体对卡那凡尼的敏感性没有改变(希尔特等。1993年;海涅梅尔等。, 1994;傅等。, 1998;鲁宾等。, 1998). 此外，为鉴定26S蛋白酶体的所有成分而进行的几项雄心勃勃且彻底的生物化学和遗传学研究从未表明Hrd4p/Npl4p是蛋白酶体亚单位，甚至是蛋白酶体相互作用蛋白。(海涅梅尔等。, 1994;格利克曼等。, 1998;维玛等。, 2000)泛素化和蛋白酶体功能似乎都不缺乏hrd4/npl4型突变细胞，表明hrd4/npl4型突变体在靶蛋白的ER泛素化和26S蛋白酶体降解之间的一步被阻断降解。这些结果表明Hrd4p/Npl4p在内质网泛素化蛋白的蛋白酶体加工中具有有趣的新作用。

我们将Hrd4p/Npl4p的功能置于泛素化和蛋白酶体降解之间，但Hrd4p/Npl4p可能在构建和/或编辑添加到靶蛋白的多泛素链的泛素化步骤中发挥作用。在这种情况下，Hrd4p/Npl4p功能的丧失将以某种方式导致多泛素链的形成，这些链不能被26S蛋白酶体识别。Hmg2p泛素化的速率和模式在hrd4–1档突变株可能会对这个模型提出一些异议，但不能排除Hrd4p/Npl4p可能以某种方式影响多泛素链结构的可能性。

蛋白质降解的一个持续研究领域涉及蛋白酶体是否能够直接识别泛素化蛋白质。虽然这是一个基本问题，但最终的答案仍然难以捉摸。在npl4号机组^-26S蛋白酶体不能识别泛素化ER蛋白，尽管蛋白酶体完全能够降解模型细胞溶质底物。这表明，至少对于ERAD底物而言，蛋白酶体本身不能识别泛素化蛋白质，需要一些在体内失去的功能hrd4/npl4型突变细胞。Hrd4p/Npl4p是否直接将泛素化ER蛋白呈现给蛋白酶体尚不清楚，但对其功能缺失的进一步研究小时4^-/npl4型^-细胞可能会提供非常必要的信息，了解蛋白酶体如何识别泛素化蛋白质。

第4小时⁻/Npl4型⁻蛋白质降解缺陷导致的表型

因为Hrd4p/Npl4p是蛋白质降解、核转运和不饱和脂肪酸生物合成所必需的，我们不得不问，在hrd4/npl4型突变以及这一功能的丧失能否解释所观察到的另一功能hrd4/npl4型表型。我们首先考虑了核运输是否是hrd4/npl4型变种人，但我们发现这个模型不令人信服，因为hrd4/npl4型突变体在核转运功能正常的允许温度下表现出蛋白质降解的严重缺陷。此外，我们还发现，由编号116Δ突变体对ERAD没有影响。因此，核输运损失不会导致一般ERAD缺陷。相反，有几份报告表明，核运输需要蛋白质降解。例如，编码蛋白酶体亚单位Rpn2p的基因突变会导致核转运的严重阻滞，泛素蛋白连接酶Tom1p的突变也会导致核运输的严重阻滞(横田等。, 1996;Utsugi公司等。, 1999). 综合起来，合理的模型是npl4号机组突变体是这些细胞中降解缺陷的结果。

最近关于Hrd4p/Npl4p参与不饱和脂肪酸（UFA）生物合成的研究促使对其原因的另一项调查hrd4/npl4型表型。希区柯克等。(2001)向大家展示npl4号机组突变菌株在UFA调节的两种转录因子（Spt23p和Mga2p）的处理中存在缺陷，这两种转录因素是产生Ole1p，aΔ9-脂肪酸去饱和酶所必需的(张等。, 1999). 因为UFA水平会对整个细胞的功能产生深远的影响，尤其是在像ER膜这样的细胞膜上(斯图基等。, 1990;Stewart和Yaffe，1991年;张等。, 1999)，我们测试了不明飞行物对我们的hrd4–1档应变，但仅发现Ts受到轻微抑制⁻通过补充UFA和不抑制洛伐他汀耐药表型获得表型。尽管Hrd4p/Npl4p显然在转录因子Spt23p和Mga2p的处理中起着重要作用，但Spt23p和/或Mga2p的处理不能是Hrd4p/Npl4p的唯一功能，因为即使镁2Δspt23型^ts秒突变体被过表达的有机发光二极管1在其限制温度下。hrd4/npl4型突变体并没有被完全抑制有机发光二极管1因此，并不是仅仅缺乏功能性Mga2p和/或Spt23p的细胞的现象副本。此外，我们找不到UFA或有机发光二极管1在ERAD缺陷中hrd4/npl4型突变体。

ER中泛素化蛋白的蛋白酶体加工缺陷最能解释所报道的hrd4/npl4型表型-hrd4/npl4型突变体缺乏合成不饱和脂肪酸所需的ER-结合转录因子的蛋白酶体依赖性加工。这种细胞UFA水平的降低导致了一些生长缺陷，似乎至少部分导致了hrd4/npl4型突变体(希区柯克等。, 2001). 这个npl4/小时4蛋白酶体加工缺陷也影响ER蛋白的降解，因为ERAD通过泛素-蛋白酶体途径的作用进行。因此，我们认为蛋白质降解是hrd4/npl4型突变体和报道hrd4/npl4型苯妥英钠的最佳解释是泛素介导的降解损失。

作者感谢Susan Wente（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）提供的菌株、质粒、抗体和建议；Martin Latterich（Diversa Corp.，San Diego，CA）提供菌株、质粒和建议；Charles Martin（新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学），提供菌种、质粒以及生长培养基中UFA补充剂和洗涤剂的建议；Pamela Silver（马萨诸塞州剑桥哈佛大学）、Heike Krebber（德国马尔堡菲利普斯大学）和Amy Hitchcock（马萨诸塞诸塞州坎布里奇哈佛大学），研究菌株、质粒、建议和共享宝贵的未公开数据；Davis Ng（宾夕法尼亚州立大学，宾夕法尼亚州大学公园）检测CPY*-HA质粒；Michael Yaffe（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）提供菌株、试剂和建议；道格拉斯·福布斯（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）授课；汉普顿实验室的成员进行了有价值的讨论。这项工作得到了美国心脏协会（N.B.）、加州圣地亚哥ARCS基金会（N.B。