我们测试了秀丽线虫可以作为使用紫外线辐射研究RIBE的动物模型，因为紫外线诱导的损伤秀丽线虫特征鲜明4在液体S-培养基中培养的野生型（N2）动物受到100 J/m的辐射2紫外线或假辐射。这种紫外线剂量导致显著的胚胎死亡()在年加剧了cep-1（gk138）动物在秀丽线虫参与DNA损伤修复的p53同源CEP-14–6用于培养辐照和假辐照动物的培养基分别称为“紫外线条件培养基”（UV-CM）和“紫外线对照”（UV-Ctrl），用于治疗未辐照的动物(). 与UV-Ctrl处理的动物相比，UV-CM处理的N2动物的胚胎死亡率增加()表明UV-CM含有能够对未暴露动物造成伤害的物质。UV-CM还减少了ced-1（e1735）动物体内有许多未吞噬的凋亡细胞，这些细胞以依赖UV剂量的方式使凋亡检测变得敏感()，在100 J/m时达到最大死亡抑制活性2这些结果与已发表的报告一致，即未暴露细胞的凋亡减少或存活率增加是RIBE的终点之一三,7–9.
识别RIBE因子一，RIBE分析的示意图秀丽线虫（方法）。b、 c、，
ced-1（e1735）L4幼虫在UV-CM中培养，来自以指定剂量照射的N2动物(b条)或UV-CM（100焦耳/米2)用胰蛋白酶处理（50 ng/μL）(c). 48小时后对生殖细胞尸体进行评分。数据为平均值±标准偏差。性腺臂的得分显示在横杆内*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，“ns”，无显著性，双侧，未配对t吨测试。d、 e、，质谱分析。浓缩>10 kD的UV-CM和UV-Ctrl组分在SDS聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上溶解并银染(d日). 显示了UV-CM（用数字标记）特有带中的蛋白质身份(e（电子）).（f），CPR-4:：标记从P分泌到UV-CMcpr-4:：cpr-4：：标志动物。在SDS-PAGE上解析UV-CM和UV-Ctrl（1μg/μL），并通过免疫印迹（IB）检测。有关凝胶源数据，请参见补充图1.
我们通过用破坏DNA、RNA或蛋白质的酶处理UV-CM来探索RIBE因子的性质。UV-CM中的凋亡抑制活性对DNase或RNase的处理是耐药的()，但被胰蛋白酶消除()，表明RIBE因子是蛋白质。从细胞死亡缺陷中收集的UV-CM塞得-3（n2433）动物，细菌缺乏glp-1（e2141）动物或用死细菌喂养的N2动物保留了死亡抑制活性()表明RIBE因子不太可能是细菌产生的因子，也不可能是辐射诱导细胞死亡的副产物，可以在没有生殖系的情况下制造。
使用10 kD分子量截止过滤单元，我们将UV-CM分为两个部分，一个部分含有可能大于10 kD的蛋白质，另一个部分的蛋白质小于10 kD。RIBE活性出现在>10 kD部分()在SDS聚丙烯酰胺凝胶上溶解(). 通过质谱分析UV-CM特有的蛋白质带，从中鉴定出19种蛋白质(;和).
我们使用RNA干扰（RNAi）检测19个基因中是否有一个与RIBE有关。UV-CM来自cpr-4型RNAi处理的动物显示出RIBE活性显著降低，而其他基因RNAi治疗的动物的UV-CM保留了RIBE的活性().cpr-4型编码哺乳动物组织蛋白酶B溶酶体蛋白酶的同源物，该蛋白酶被分泌用作细胞外蛋白酶10–12。因为一个缺失突变(tm3718（tm3718）)英寸cpr-4型，可以去除三分之一的CPR-4蛋白()，消除了RIBE活性和携带cpr-4型带有羧基末端标记的基因组片段（Pcpr-4:：cpr-4：：标志)将RIBE恢复为cpr-4（tm3718）动物(),cpr-4型UV-CM中的RIBE活动需要。
CPR-4是一个RIBE因素a、 d、e、，来自指示菌株的条件培养基（0.1μg/μL）(a、 电子)或2.8μM重组tCPR-4蛋白(d日)用于治疗ced-1（e1735）动物，如b、c、f，来自指示菌株的条件培养基（0.1μg/μL）的蛋白酶活性(b、 （f）)或2.8μM tCPR-4蛋白(c). tCPR-4蛋白的免疫印迹图像如下c.克，CPR-4:：Flag从P分泌到IR-CMcpr-4:：cpr-4：：标志动物。免疫印迹法检测SDS-PAGE上分离的IR-CM和IR-Ctrl（1μg/μL）。小时，相对cpr-4型通过定量RT-PCR测定所示菌株的mRNA水平（折叠变化），并与假辐射样品（Ctrl）进行比较。数据为平均值±标准误差(a–f，h). 性腺臂的得分显示在横杆内(a、 d、e)对于其他测定，每组n=6(b、 c、f、h); ***P（P）<0.001，“ns”，无显著性，双侧，未配对t吨测试(a、 d、e、h). 有关凝胶源数据，请参见补充图1.
我们检测了紫外线照射后CPR-4是否分泌到培养基中。CPR-4:：在UV-CM中检测到标记，但在UV-Ctrl中未检测到标记cpr-4:：cpr-4：：标志动物(). CPR-4:：P的UV-CM标记的免疫耗竭cpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3718）动物取消了RIBE活动()，证实分泌的CPR-4是UV-CM中的RIBE因子。因为UV-CM来自cep-1（gk138）动物失去了RIBE活动()和来自cep-1（gk138）；P（P）cpr-4:：cpr-4：：标志动物显示CPR-4:：Flag的分泌大大减少()，CPR-4-介导的RIBE通过cep-1-依赖性机制，如一些报道的哺乳动物p53依赖性RIBE三,13.
RIBE通常指动物内部的旁观者效应。我们测试了动物头部的局部紫外线照射（LUI）是否会在未暴露于辐射的动物的其他区域引起旁观者效应(). 使用压力反应报告员，Phsp-4：：gfp(zcIs4号机组)，对辐射也有反应14,15，我们观察到在LUI治疗的多个未暴露区域GFP表达增加zcIs4号机组动物辐射后24小时，包括后部强烈的GFP表达(). 这种旁观者反应在L4幼虫中最强()，但迷失在cpr-4（tm3718）和cep-1（gk138）突变体(;)，表明两者cpr-4型和cep-1动物内RIBE需要。LUI还导致未暴露子代的胚胎死亡率增加()和减少未经照射后性腺的生殖细胞死亡cpr-4型-依赖方式(),表明LUI诱导的动物内RIBE与UV-CM诱导的动物间RIBE相似，CPR-4是一个真正的RIBE因子。
CPR-4和DAF-2在局部紫外线照射（LUI）模型中介导RIBEa、，用于分析RIBE的动物模型示意图。对动物的咽部进行照射，并对三个未暴露区域的RIBE进行分析（方法）。b、 c、，P的代表性图像（至少20张）hsp-4：：gfp有或没有LUI的动物。动物尾巴在右上角。比例尺，50μm。日期：，P的测定hsp-4:：绿色荧光蛋白不同发育阶段对LUI的反应。例如，对指示菌株进行Phsp-4：：gfp响应(e（电子）)，F1胚胎致死率(（f）)和后性腺中的生殖细胞尸体(克)LUI后24小时。一些实验e（电子）都在里面（f）在25°C下进行。数据为平均值±标准偏差动物数量(d、 e（电子）)，个装有胚胎的盘子(（f）)或性腺臂(克)分数显示在条形图内*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，“ns”，无显著性，双侧，未配对t吨测试(d–g).
CPR-4和组织蛋白酶B高度保守，具有相同的催化残基()包括活性位点半胱氨酸和组氨酸残基16使用组织蛋白酶B特异性荧光底物z-Arg-AMC，我们在N2动物的UV-CM中检测到组织蛋白酶B-like蛋白酶活性，但在UV-Ctrl中检测不到(). 这种活性在UV-CM中缺失cpr-4（tm3718）动物，UV-CM大大减少cep-1（gk138）动物，但在P中恢复cpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3718）动物，证实CPR-4通过cep-1-依赖机制。
我们测试了重组CPR-4是否能重现RIBE活性。缺失其信号肽（残基1-15）的截短型CPR-4（tCPR-4）显示出与重组人组织蛋白酶B（rhCTSB）类似的蛋白酶活性(). 改变保守的催化残基C109A和H281A的突变使tCPR-4的蛋白酶活性消失()，而改变非催化残基的突变（N301A）不会影响tCPR-4蛋白酶活性16像来自N2动物的UV-CM一样，tCPR-4、tCPR-4（N301A）和rhCTSB减少了生殖细胞尸体(;)增加胚胎死亡率()，而tCPR-4（H281A）和tCPR-3（C109A）未能做到这一点，表明CPR-4蛋白酶活性对其RIBE活性至关重要。
我们测试了受不同辐射源照射的动物的条件培养基，即电离辐射（IR-CM）及其假辐射对照（IR-Ctrl）。来自N2或P的IR-CMcpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3718）动物减少生殖细胞尸体ced-1（e1735）动物，而IR-CM来自cpr-4（tm3718）或cep-1（gk138）动物没有这种活动(). 同样，来自N2动物的IR-CM（而非IR-Ctrl）导致胚胎死亡率增加()并含有组织蛋白酶B样活性，该活性在IR-CM中丢失cpr-4（tm3718）或cep-1（gk138）动物，但在P中恢复cpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3718）动物(). 此外，Pcpr-4:：cpr-4：：标志动物(). 因此，CPR-4是由不同辐射源诱发的共有RIBE因子。
通过定量RT-PCR分析，我们发现cpr-4型与假辐射对照组相比，紫外线或红外线照射后N2动物的基因升高了约1.6倍(). 相比之下，cpr-4型转录cep-1（gk138）这两种辐射都没有改变动物。这些结果表明电离和非电离辐射增加cpr-4型通过CEP-1依赖机制转录，导致更多CPR-4蛋白的合成，并增强CPR-4的分泌。
使用携带中央处理器-4与绿色荧光蛋白（GFP）和核定位信号（Pcpr-4:：nls:：gfp)，我们检查了时间和地点cpr-4型表示为。在N2动物中，胚胎中未检测到NLS:：GFP表达，在早期幼虫（L1至L3）的肠道中观察到，在L4幼虫期达到峰值，当动物进入成年期时下降(). 类似的时空NLS:：GFP表达模式在cep-1（gk138）；P（P）cpr-4:：nls:：gfp动物(). 用紫外线、氮气照射动物时cep-1（gk138）携带P的动物cpr-4:：nls:：gfp，显示NLS:：GFP表达升高()，证实辐射诱发的cpr-4型通过cep-1-依赖机制。
研究分泌型CPR-4的作用体内，我们产生了转基因P肌氨酸-2：：CPR-4：：m表达CPR-4的樱桃动物：：m樱桃秀丽线虫咽部受肌氨酸-2基因启动子(). 正如预期的分泌蛋白一样，CPR-4:：mCherry由咽部制造并分泌，并被全身细胞包括吞噬体腔细胞（箭头，). 去除CPR-4信号肽阻断转基因动物从咽部分泌tCPR-4：：mCherry(). 与UV-CM、IR-CM或LUI治疗一样，CPR-4:：mCherry的咽部表达增加了胚胎死亡率，减少了生殖细胞死亡，此外，还导致了大量幼虫的死亡()在表达tCPR-4:：mCherry蛋白或催化活性CPR-4：：mCherly蛋白的动物中未发现或显著减弱。这些来自CPR-4异位表达的结果提供了进一步的证据来支持CPR-4作为RIBE因子的长程信号传导作用。
鉴于CPR-4介导的各种RIBE效应，我们通过检测影响多个细胞过程的基因，研究了CPR-4如何影响未暴露的细胞或动物。这个daf-2型基因，编码秀丽线虫人胰岛素/胰岛素样生长因子受体的同源序列并调节多种信号通路17–20，被检查为减少daf-2型活动可以延长寿命，增强抗压能力17,18减少基因毒性和缺氧应激引起的生殖、肌肉和神经细胞死亡19,20类似地，减少daf-2型温度敏感突变的作用(e1370（电子1370）)减少生理性生殖细胞死亡(). 有趣的是，纯化的tCPR-4并没有进一步降低ced-1（e1735）；daf-2（e1370）突变体()，表明tCPR-4和daf-2型以相同的途径影响生殖细胞死亡。此外，tCPR-4并没有减少生殖细胞死亡ced-1（e1735）；pdk-1（sa680）PDK-1激酶（DAF-2的一个关键下游信号成分）缺陷的动物21，但可以在daf-16（mu86）ced-1（e1735）缺乏DAF-16的动物22,23，作用于DAF-2下游的主要转录因子之一(). 我们使用LUI分析观察到类似的结果，其中daf-2型和pdk-1型，但不是daf-16，阻止P增加GFP表达hsp-4：：gfp在后部未暴露区域(和)和损失daf-2型阻止未暴露组织中胚胎死亡率的增加和生殖细胞死亡的减少(). 因为daf-2型似乎不影响CPR-4在UV-CM中的分泌或UV-CM的凋亡抑制活性()这些结果支持一种模型，其中分泌的CPR-4通过DAF-2胰岛素/IGF受体和PDK-1激酶发挥作用,但不是DAF-16转录因子,以在未暴露的细胞中发挥RIBE。
CPR-4通过DAF-2发挥RIBE作用a、 b、，用2.8μM的tCPR-4或缓冲液对照处理所示菌株的L4幼虫48小时。数据为平均值±标准偏差。性腺臂的得分显示在横杆内**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，“ns”，无显著性，双侧，未配对t吨测试。
因为daf-2型也影响生殖细胞增殖24,25，我们通过计算生殖系有丝分裂区的细胞核数量来检测tCPR-4治疗是否改变生殖细胞增殖24tCPR-4处理N2动物后，在有丝分裂区产生更多的生殖细胞核和更多的中期细胞核()，表明有刺激作用。减少daf-2型活动或损失cep-1阻断tCPR-4诱导的生殖细胞增殖增加(和)表明tCPR-4通过DAF-2和CEP-1促进生殖细胞增殖。
RIBE是决定放射治疗在癌症治疗中的疗效和成功的主要因素2,26,27不仅因为它影响并导致未受照射细胞的损伤，而且因为它可以通过旁分泌信号影响受照射细胞。因此，识别RIBE因子是癌症放射治疗和放射防护中的一个基本问题1.使用秀丽线虫动物模型中，我们确定组织蛋白酶B同源物CPR-4是导致多种典型RIBE效应的主要RIBE因子1,27包括凋亡抑制和细胞增殖增加、致死性和应激反应。在哺乳动物中，组织蛋白酶B由溶酶体分泌，发挥细胞外活性，包括调节凋亡，并在肿瘤和炎症疾病状态中发挥作用28,29最近的研究表明，细胞外组织蛋白酶B增强了乳腺癌在化疗期间对药物诱导凋亡的抵抗力30，这与我们在秀丽线虫。我们表明辐射增加cpr-4型转录和CPR-4蛋白的产生和分泌秀丽线虫通过p53/CEP-1依赖机制。然后，分泌的CPR-4通过调节DAF-2胰岛素/IGF受体的活性，直接或间接地诱导多种RIBE反应，DAF-2受体对从衰老、应激反应、代谢到凋亡的多种保守信号通路至关重要17,18因此，我们的研究为难以理解的RIBE现象提供了关键的见解，不仅涉及RIBE是如何产生的，RIBE因子是什么，而且还涉及RIBE因子如何影响非辐照细胞。这个秀丽线虫该模型将有助于识别蠕虫和其他生物体中的其他RIBE因子和潜在机制。
方法
菌株和培养条件
我们培养了秀丽线虫使用标准程序在20°C下的菌株31，除非另有通知。我们使用N2 Bristol菌株作为野生型菌株。遗传分析中使用了以下染色剂：LGI、，cep-1（gk138）、daf-16（mu86）、ced-1（e1735）; LGII，P的单拷贝插入cpr-4:：cpr-4：：标志32,P的单拷贝插入cpr-4:：nls:：gfp; LGIII、，daf-2（e1370），glp-1（e2141）; LGV、，cpr-4（tm3718），zcIs4（Phsp-4：：gfp); LGX、，pdk-1（sa680）。每个单拷贝插入转基因在使用前至少与N2动物回交四次。
辐照
使用紫外线交联剂或钴在室温下对生长在线虫生长培养基（NGM）板或带有液体培养基的塑料管中的成年动物进行辐照60辐射源。紫外线照射剂量为100 J/m2.钴的用量60照射为500Gy，剂量率约为33.3Gy/分钟。辐照后立即将平板放回20°C培养箱。辐照后，将塑料管置于20°C的摇床中，以产生调节介质。在所有辐照实验中均使用假辐射对照。
从辐照动物中产生条件培养基
秀丽线虫将濒临饥饿的动物从三个NGM板（直径6 cm）上洗净，并在250 mL S-培养基（100 mM NaCl，5.8 mM K）中培养6天2高性能操作4，44毫微米千赫2人事军官4，0.013 mM胆固醇，1 mM柠檬酸一水，9 mM柠檬酸三钾一水，0.05 mM EDTA二钠，0.025 mM FeSO4，0.01 mM氯化锰2，0.01 mM硫酸锌4，0.001 mM硫酸铜4，1.5 mM氯化钙2，3 mM硫酸镁4、0.13 mM氨苄西林、0.007 mM硫酸链霉素、0.16 mM硫酸新霉素和0.02 mM制霉菌素）大肠杆菌菌株HB101作为食物来源。将动物在4°C的温度下沉淀10分钟，其中大多数是成年动物，然后用S-Medium清洗三次。我们将S-Medium中的动物密度调整为大约2只/μL，将其转移到石英板（带盖）中，并使用所需剂量的紫外线或假辐射对其进行照射。对于IR照射，将相同密度的动物转移到15mL康宁离心管中，并使用500Gy IR或假照射进行照射。用新鲜S-培养基清洗辐照或假辐照的动物，将其转移到15 mL康宁离心管中的6 mL S-培养液中，补充有HB101细菌，并在20°C的摇床中培养24小时，持续200 rpm摇晃。然后，我们以3000 rpm离心10分钟，去除动物和细菌，并用0.22μm过滤装置过滤培养基，获得条件培养基。然后通过10 kD的超滤管（Amicon Ultra-15，Millipore）浓缩经处理的培养基，并使用S-medium将其调节至0.1μg/μL总蛋白浓度。从P生成UV-CM和UV-Ctrlcpr-4:：cpr-4:：标志；daf-2（e1730）；cpr-4（tm3718）将装有这些动物的饥饿板切成300块新的NGM板，在20°C下放置2天，然后再移至25°C下再放置一天。将紫外线照射或半紫外线照射的动物在25°C的摇床中培养24小时，以获得UV-CM和UV-Ctrl。
局部照射秀丽线虫
秀丽线虫L4幼虫被安装在含有10nM叠氮化钠的琼脂糖垫（2%）上，并使用尼康A1激光扫描共聚焦仪在倒置Ti-E显微镜上用40x/0.9 NA Plan-Apo-Lambda物镜照射头部区域。安装时，405 nm的激光功率非常接近紫外线的波长，在光纤处测量为23.32 mW。使用60%405 nm激光功率，512×512，像素尺寸为0.58微米×0.58微米，进行2.2微秒/像素的辐照。使用托尔实验室功率计（PM100D）和光电传感器（S140C），我们测量到样品平面的功率约为0.25–0.30 mW。这相当于约0.75–0.89 mW/微米2在样品上。对于假辐射控制，琼脂糖垫上距离动物稍远的一个区域受到辐射。照射后，立即将动物从琼脂糖垫中救出，转移到常规NGM板中，在20°C下恢复24小时，或在25°C下回复20小时（胚胎致死率测定），然后进行动物内旁观者效应测定。进行了三项检测，以监测未暴露区域的动物内旁观者效应。它们是后性腺的生殖细胞尸体分析、受照动物F1后代的胚胎致死性分析和Phsp-4：：gfp后部区域的应激反应测定。对于Phsp-4：：gfp压力反应分析，使用daf-2（e1370ts）菌株和相应的对照菌株在LUI后25°C下进行。对于胚胎致死性分析，在25°C下恢复20小时后，将辐照或半辐照动物置于NGM板上，在25℃下产卵4小时，然后转移到新的NGM板。在两次转移后，这些动物被丢弃。对未孵化的卵数（记为死卵）和发育成幼虫的卵数进行记分，并用于确定胚胎致死率。
甲醛处理菌作为食物来源
HB101细菌用3.7%甲醛处理10分钟，用S培养基洗涤三次，离心收集。细菌的死亡是通过在不含抗生素的平板上传播细菌并观察到无菌落来证实的。将细菌颗粒添加到S-培养基中以培养蠕虫。
RNA干扰（RNAi）实验
RNAi实验是使用细菌喂养方案进行的33.HT115细菌经pPD129.36转化-cpr-4型或pPD129.36质粒用于cpr-4型RNAi和对照RNAi实验。其他RNAi实验中使用的细菌克隆来自从ThermoFisher购买的RNAi库。为了在液体培养中进行RNAi实验，使用三个含有RNAi细菌的NGM培养板喂养30只4级（L4）N2幼体动物，直到培养板几乎饿死。然后，我们将动物从平板上冲洗下来，并将它们转移到装有250mL含有0.5mM异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和RNAi细菌的S培养基的玻璃烧瓶中，并使它们再生长一代。获得条件培养基的程序与上述类似。
增长的秀丽线虫96-well板块中的动物
将HB101细菌与100μL条件培养基（0.1μg/μL）或含有2.8μM重组tCPR-4蛋白（野生型或突变型）或0.27μM重组人组织蛋白酶B的100μL S-培养基混合在96 well平板中。大约60只L4幼虫被转移到平板的每个孔中。在液体培养基中培养48小时后，对这些动物的生殖细胞尸体和有丝分裂细胞核的数量进行评分。
条件培养基的酶处理
通过用不同的酶处理条件培养基来分析RIBE因子的性质。将1μL DNase（1单位/μL，QIAGEN）、1μL RNase（100μg/μL，QUIAGEN。然后使用经处理或未经处理的条件培养基进行培养ced-1（e1735）动物在20°C的96-well板中放置48小时。
生殖细胞尸体的量化
如上所述，L4动物在96-well板中的液体培养基中培养。48小时后，将其转移到NGM板上，并在20°C下恢复1小时。然后用20mM NaN麻醉动物三安装在2%琼脂垫上，并在Nomarski光学下进行评分。对于在咽部表达CPR-4的转基因动物，L4动物在20°C的NGM平板上生长24小时，然后对生殖细胞尸体进行评分。只对完整性腺的后臂进行评分。所有生殖细胞尸体定量实验均进行了盲检。
有丝分裂核的定量
在液体培养中用2.8μM纯化tCPR-4蛋白处理48小时的L4动物被转移到NGM板上，并在20°C下恢复1小时。然后按照前面描述的方案对它们进行解剖，露出性腺24.将切除的性腺固定并用DAPI染色34用Zeiss-Nomarski显微镜和DAPI过滤器对每个性腺有丝分裂区的生殖核数和中期核数进行评分24.
表达水平的量化cpr-4型通过GFP记者
P的单拷贝插入cpr-4:：nls:：gfp转基因32用于确定cpr-4型照射前后。中期L4 Pcpr-4:：nls:：gfp和cep-1（gk138）；P（P）cpr-4:：nls:：gfp幼虫受到100焦耳/米的辐射2在成像前，在20°C的温度下进行2小时的紫外线照射。通过在Nomarski光学下拍摄图像，记录动物的GFP表达模式。所有图像的曝光时间固定为100 ms。使用Image J软件（NIH）量化每只动物的GFP荧光强度。的表达式级别cpr-4型在未经辐照的不同发育阶段（胚胎、L1、L2、L3、L4幼虫、L4后24小时和48小时的成虫），使用相同的方法进行测定。
胚胎致死率和幼虫滞留试验
对于直接辐射引起的胚胎致死性分析，在100 J/m辐射后2将紫外线或500 Gyγ射线照射下的妊娠成虫置于NGM板上，在25°C下产卵4小时，然后从板上取出。在液体培养基中进行胚胎致死性分析时，L4幼虫在含有纯化蛋白的条件培养基或S-培养基中培养48小时，从液体培养基转移到新鲜的NGM平板中，并在25°C下产卵4小时，然后取出成年动物。为了对在咽部表达CPR-4的转基因动物进行胚胎致死性分析，将L4后24小时的转基因妊娠成人置于NGM板上，在25°C下产卵4小时，然后从板上取出。在所有情况下，在25°C的NGM平板上放置24小时后，对未孵化的卵数（记为死卵）和发育成幼虫的卵数进行记分，并用于确定胚胎致死率。
在幼虫停止试验中，将妊娠的转基因成虫置于NGM板、对照RNAi板或cpr-4型RNAi平板在25°C下产卵4小时。在将平板返回20°C培养箱之前，在荧光立体镜下对孵化出来的转基因幼虫的数量进行评分。3天后，对未进入成体阶段的转基因动物数量进行评分，并用于确定幼虫滞留率。
分子生物学
全长cpr-4型通过聚合酶链反应（PCR）从秀丽线虫cDNA文库。使用SignalP 3.0 Server预测CPR-4的信号肽35为了构建pGEX4T-2-tCPR-4质粒cpr-4型用PCR扩增出编码残基16-336的cDNA片段cpr-4型cDNA克隆并通过其亚克隆到改良的pGEX4T-2载体NdeI公司和XhoI公司位点，在GST编码序列后插入一个PreScission蛋白酶裂解位点LEVLFQGP。为了构建pGEX4T-2-tCPR-4（C109A）、pGEX4-2-tCPR-4（H281A）和pGEX44T-2-tGPR-4（N301A）载体，使用两步PCR产生携带所示突变的tCPR-4cDNA片段，该片段通过其子克隆到相同的修改过的pGEX4.4T-2载体中NdeI公司和XhoI公司地点。构造P肌2型：CPR-4:：m樱桃，P肌2型：tCPR-4：：m樱桃色，P肌-2：CPR-4（C109A）：：m樱桃，P肌-2：：CPR-4（H281A）：：mCherry和P肌-2：：CPR-4（N301A）：：mCherry表达载体、编码全长CPR-4的cDNA片段（C109A）、CPR-4和CPR-4。对编码CPR-4:：mCherry、tCPR-4::：mCherly、CPR-4（C109A）：：mCherry、CPR-4（H281A）：mChery和CPR-4NheI公司地点。
制备质粒pCFJ151-Pcpr-4:：cpr-4：：标志为了产生单拷贝整合转基因cpr-4型基因组片段（Pcpr-4:：cpr-4：：utr)，含有4018 bp的cpr-4型启动子序列，1196bpcpr-4型基因组编码序列和2267bpcpr-4型3′非翻译区（UTR）是从一个磷酰胺WRM0619bH11中通过用PmlI公司和BssHII公司然后通过其BssHII公司网站和一个钝化AvrII公司现场。本Pcpr-4:：cpr-4：：utr然后通过阿富汗和NheI公司消化并通过其亚克隆到质粒pSL1190中阿富汗和NheI公司地点。标志标记（DYKDDDDK）被立即插入cpr-4型通过QuickChange方法编码区域。修改后的Pcpr-4:：cpr-4：：标志：：utr基因组片段通过its亚克隆回pCFJ151阿富汗和NheI公司获得质粒pCFJ151-P的位点cpr-4:：cpr-4：：标志.
构建质粒pSL1190-Pcpr-4:：nls:：gfp对于单拷贝插入，4114bp的片段包含cpr-4型启动子和前58bpcpr-4型编码区，包含NLS:：GFP编码序列和unc-54号机组3′UTR、一个1337bp的LGII-MosI位点上游同源重组片段（ttTi5605）和一个1418bp的LGII-MosI位点下游同源重组片段通过其磅/平方英寸和巴米希使用Gibson结扎法的部位。
为构建质粒cpr-4型RNAi，全长cpr-4型cDNA片段经PCR扩增并通过其亚克隆入pPD129.36载体Nhe I公司和Xho一地点。所有克隆均经DNA测序证实。
转基因动物
使用标准方案培育转基因动物36.P型肌-2：：CPR-4:：m樱桃，P肌-2：：tCPR-4：：m樱桃，P肌2型：CPR-4（C109A）：：m樱桃，P肌2型：CPR-4（H281A）：：mCherry或P肌-2：CPR-4（N301A）：：m将樱桃注入ced-1（e1735）；cpr-4（tm3718）动物以20 ng/μL（用于生殖细胞尸体的定量）或2 ng/μL（用于胚胎致死率和幼虫滞留分析）以及pTG96质粒（20 ng/微升）作为共注射标记。pTG96质粒含有苏尔-5:：gfp在许多细胞和大多数发育阶段表达的翻译融合37.单副本插入Pcpr-4:：cpr-4：：标志转基因与Pcpr-4:：nls:：gfp转基因是使用前面描述的方法产生的32.
分泌型CPR-4:：Flag的免疫印迹检测
来自辐照N2，P的调节介质cpr-4:：cpr-4：：标志，Pcpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3178）,cep-1（gk138）；P（P）cpr-4:：cpr-4：：标志，或Pcpr-4:：cpr-4：：标志；daf-2（e1370）；cpr-4（tm3178）使用10 kD分子量截止（MWCO）离心过滤柱对动物进行浓缩（1μg/μL最终蛋白质浓度）。浓缩的条件培养基在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上溶解，并转移到PVDF膜上。使用Flag标签的单克隆抗体（Sigma，目录号F3165，1:2000稀释度）和与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠二级抗体（HRP，Bio-Read，目录号1705047，1:5000稀释度）检测分泌型CPR-4:：Flag。
CPR-4:：标志损耗
来自P的UV-CM或UV-Ctrlcpr-4:：cpr-4：：标志；cpr-4（tm3718）动物在4°C的旋转摇床上用20μL床容量的反Flag M2亲和凝胶（Sigma，目录号A2220）孵育过夜。通过以10000 rpm离心2分钟的方式将防标记珠旋转下来，收集上清液并用作防标记缺失条件培养基。
蛋白质表达和纯化
tCPR-4或突变tCPR-4proteins（C109A、H281A或N301A）在大肠杆菌具有N-末端GST标签和C-末端His的菌株BL21（DE3）6-标签。使用谷胱甘肽Sepharose柱（GE Healthcare，目录号17-0756-01）纯化细菌的可溶部分，并在室温下用PreScission蛋白酶裂解2小时以去除GST标签。然后用镍亲和纯化蛋白质2+Sepharose柱（GE Healthcare，目录号17-5268-01）并用250 mM咪唑从柱中洗脱。使用5 kD MWCO离心过滤装置将纯化的蛋白质浓缩至约200 ng/μL最终浓度，并使用含有25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、1mM DTT和10%（v/v）甘油的透析缓冲液在4°C下透析4~6小时，并进行磁搅拌。通过高速离心去除透析后的不溶性聚集体。然后用透析缓冲液将蛋白质稀释至100 ng/μL最终浓度，并将其保存在-80°C的小份中。纯化蛋白的浓度通过抗-His测定6免疫印迹法，使用tCPR-4-His6以已知浓度作为标准化控制。
质谱分析
从银染凝胶中提取的感兴趣的蛋白带被1%铁氰化钾和1.6%硫代硫酸钠脱色，并在25 mM NH中通过10 mM DTT和55 mM碘乙酰胺进行还原和烷基化4HCO公司三，然后用胰蛋白酶（20μg/mL，25 mM NH中）在凝胶内消化4HCO公司三)在37°C下放置16小时。使用线性离子阱质谱仪（LTQ-Orbitrap，Thermo-Fisher），通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析反应产物。样品通过捕集柱（Zorbax 300SB-C18，0.3×5 mm，安捷伦科技公司）装载，肽在分析柱（毛细管RP18柱，Synergy hydro-RP，2.5μm，0.075×100 mm，室内包装）上分离，梯度为2-95%HPLC缓冲液（99.9%乙腈，含0.1%甲酸），分离时间为75分钟。对于MS分析，我们使用了一个数据相关程序，该程序交替进行一次MS扫描和六次MS/MS扫描，以检测六种最丰富的前体离子。所得光谱用于搜索sprot_20140416数据库（选择用于秀丽隐杆线虫，3466个条目）假设消化酶为胰蛋白酶。MASCOT搜索引擎(http://www.matrixscience.com; v.2.2.2矩阵科学），允许两个缺失的切割位点，其电荷态为2+至3+对于固定修饰（半胱氨酸的氨基甲酰化）和可变修饰（蛋白质N末端的乙酰化、蛋氨酸的氧化和Gln转变为焦-Glu），母体离子质量容限设置为10 ppm，片段离子质量容量设置为0.5 Da。使用Scaffold 3搜索引擎（v.3.06.01；http://www.proteomesoftware.com). 如果蛋白质概率>95%，并且包含至少两个肽，肽预测算法概率>95%时，则接受蛋白质鉴定。
蛋白酶活性测定在体外
CPR-4酶分析是按照前面描述的方法进行的，并进行了一些修改38将组织蛋白酶B特异性荧光底物Z-Arg-Arg-7-amido-4-甲基香豆素盐酸盐（Z-Arg-AMC；Peptanova，目录号88937-61-5）溶解在2×反应缓冲液中，该反应缓冲液含有25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、10%（v/v）甘油、0.8 mM醋酸钠（pH6.0）和8 mM EDTA。对于分析，在测量发光之前，将10μL蛋白质（100 ng/μL）或10μL条件培养基（100 ng/μL）与10μL 20μM z-Arg-AMC在25°C下孵育10分钟。酶活性测定为双发光荧光仪EnVision（Perkin-Elmer）在25°C下在380 nm激发波长和460 nm发射波长下的平均速度，并表示为以千相对荧光单位（kRFU）表示的相对强度。将重组人组织蛋白酶B（rhCTSB；Sino Biological Inc.，目录号10483-H08H-10）溶解在制造商推荐的缓冲液中[25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、10%（v/v）甘油、5mM DTT和0.1%Triton-X]。还使用相同的程序测量了CPR-4蛋白或rhCTSB蛋白或sham-照射条件培养基所特有的缓冲液控制。每个实验中使用S-Medium作为背景对照。
定量RT-PCR分析cpr-4型转录水平
N2和cep-1（gk138）将L4幼虫转移到新鲜NGM平板上，在20°C下培养24小时。在他们接受100 J/m的试验后两小时2使用RNAiso试剂盒（TaKaRa，目录号9108）对紫外线或500 Gyγ射线照射或半辐射进行裂解，以提取总RNA。使用ImProm II将分离的总RNA用作逆转录（RT）中的模板™逆转录系统（Promega，目录号A3800），根据制造商的说明获得第一链cDNA。
定量PCR分析使用Bio-Rad CFX96 Touch实时PCR检测系统，使用iTaq™SYBR公司®带有ROX的绿色Supermix（Bio-Read，目录号1725151）。每个PCR反应包含12.5μL Bio-Read超混合溶液、50 nM正向和反向引物以及最终体积为25μL的5μL cDNA（150 ng/μL）。在实时PCR检测系统96周内放置的实时PCR试管（Bio-Read，目录号TLS0851）中进行扩增。循环条件如下：95℃下变性3分钟，然后在95℃下50次循环20秒，在60℃下30秒，在72℃下20秒。在最后一个循环后进行熔化曲线分析，以检查每个反应中引物的特异性。PCR反应分三次进行，并进行三次独立实验。转录pmp-3型由于其在成人中异常稳定的表达水平，被用作内部参考39.数据采用Livak方法进行分析。要检测的引物cpr-4型为5′-TCGGAAGAGGTCCAGAT-3′（正向引物）和5′-GGGTAGAAGTCCTCTAGACAGTGAAT-3′（反向引物）。要检测的引物pmp-3型为5′-GTTCCGTTCATCACTCAT-3′（正向引物）和5′-ACACCGTCGAGAGCTAGA-3′（反向引物）。
数据可用性
墨迹的非裁剪版本如下所示补充信息（SI）中的补充图1本文中图表的大部分原始数据也在硅根据合理要求，可从相应作者处获得支持本研究结果的其他数据。
