简介
线粒体是一种动态结构，经常分裂和互相熔合(Bereiter-Hahn和Voth，1994年;赫尔曼和肖，1998). 细胞分裂期间需要线粒体分裂将线粒体分配给子细胞。静止细胞也在细胞分化过程中表现出线粒体分裂细胞生长或对细胞外刺激的反应。线粒体分裂和融合过程必须严格控制，因为细胞生存取决于保存足够数量的每个细胞中的线粒体。线粒体分裂和融合也可能很复杂，因为线粒体有两个膜，具有明显的拓扑结构和能量屏障。
线粒体分裂机制的第一条线索来自最近发现，这一过程是由一种与动力蛋白相关的物质控制的称为DRP-1的蛋白质秀丽隐杆线虫(拉布鲁斯等。, 1999)或酵母中的Dnm1p(布莱扎德等。,1999;Sesaki和Jensen，1999年). 失去Dnm1p/DRP-1功能会导致线粒体连接性增加秀丽线虫在酵母中，线粒体的频率降低分部(布莱扎德等。, 1999;拉布鲁斯等阿尔。, 1999;Sesaki和Jensen，1999年). 在秀丽线虫，的线粒体内膜继续分裂，表明DRP-1只需要线粒体外膜的分裂(拉布鲁斯等。, 1999). 野生型DRP-1的过度表达增加线粒体分裂事件的数量C、。雅致(拉布鲁斯等。, 1999). 免疫荧光免疫电子显微镜显示表位标记版本的酵母Dnm1p定位于线粒体或尖端的斑点线粒体的(布莱扎德等。, 1999). 时间推移照片显示绿色荧光蛋白（GFP）标记DRP-1从秀丽线虫定位于线粒体上的斑点裂变即将发生，这与线粒体分裂(拉布鲁斯等。, 1999). 拿总之，这些结果提供了强有力的证据C、。雅致DRP-1和酵母Dnm1p对最后阶段至关重要线粒体分裂过程。
哺乳动物的同源物秀丽线虫DRP-1和酵母Dnm1p或者被称为Drp1、Dlp1、DVLP或Dymple(小腿等。, 1997;伊莫托等。, 1998;卡米莫托等。, 1998;斯米尔诺娃等。, 1998;Yoon公司等。, 1998). 这里，我们将这种蛋白质称为Drp1。这个哺乳动物Drp1的功能仍然存在争议。一直以来表明Drp1有助于形成小泡，其作用类似于动态素在囊泡形成中的作用。一项研究表明，Drp1是在分泌途径的早期阶段需要(伊莫托等阿尔。, 1998). 另一项研究表明，Drp1有助于内质网之间囊泡运输或直接融合的新途径网（ER）和线粒体(皮特斯等。, 1999). 这个研究表明对分泌或内吞途径没有影响，与我们之前的结果一致，也表明对小泡运输(斯米尔诺娃等。, 1998). 相反，我们发现突变的Drp1导致线粒体坍塌进入核周簇，这表明Drp1特别影响线粒体形态学(斯米尔诺娃等。, 1998). 潜在缺陷导致线粒体聚集的原因尚不明确。
我们现在表明，线粒体簇包含高度线粒体相互连接的网络线粒体分裂。我们还能够检测到内源性Drp1定位于线粒体上的斑点，我们可以检测GFP标记的Drp1与线粒体的共定位利用延时摄影技术对赛事进行分割。我们得出结论Drp1有助于哺乳动物细胞的线粒体分裂，如它在秀丽线虫和酵母。
材料和方法
转染构建、细胞培养和转染程序
pcDNA3-HA-Drp1质粒，用于表达哺乳动物细胞中的人Drp1(斯米尔诺娃等。, 1998). K38A、V41F、T59A和G281D突变使用标准将引入Drp1编码序列聚合酶链式反应方法和Pfu聚合酶（加利福尼亚州拉霍拉市斯特拉赫纳）。通过测序检查新克隆。这个GFP:：Drp1构造是通过将GFP从pGreenLantern（马里兰州Rockville，Life Technologies）位于Drp1上游pcDNA3（Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥）。Drp1:：YFP和YFP:：Drp1通过向上游或下游倾斜Drp1来实现pEYFP-C1中YFP编码序列的(克隆技术加利福尼亚州帕洛阿尔托）。这个pECFP-Mito质粒(克隆技术公司)用作线粒体基质标记。线粒体外膜标记物是通过扩增人基质细胞cDNA中Tom20的N端73个氨基酸文库并在pcDNA3中克隆GFP上游片段（Invitrogen）。
COS-7和C2C12细胞系在添加10或20%胎牛血清。COS-7细胞暂时使用FuGENE转染试剂转染（罗氏分子生物化学，印第安纳波利斯，印第安纳州）和C2C12与SuperFect（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）。这个将转染细胞接种到玻璃盖玻片上，通过免疫荧光或玻璃底皿（MatTek，Ashland，MA）体内观察。细胞在转染和荧光显微镜分析。
抗体生产、免疫荧光染色和荧光成像
通过免疫家兔制备抗Drp1抗体南方大学在MAPS树脂上合成的肽加利福尼亚州洛杉矶微化学核心设施。两种肽（271-KKYPSLANRNGT-282和445-HCSNYSYQELLRFP-458）用于免疫兔子（加利福尼亚州雷蒙纳市罗伯特·萨根特）。抗体是用表达于大肠杆菌如前所述(斯米尔诺娃等阿尔。, 1998). 整个过程中使用的兔抗体针对445-458肽的研究有所增加。用于双重标签对于其他兔抗体，我们使用鸡抗Drp1抗体，如前所述(斯米尔诺娃等。, 1998). 这个前面也描述了用于标记ER的VSV-G KKTN结构(斯米尔诺娃等。, 1998). 检测到VSV-G来自Sigma（密苏里州圣路易斯）的单克隆抗体。兔抗核糖核酸酶-I抗体(Hortsch和Meyer，1985年)由D.I.博士提供。Meyer（加州大学洛杉矶分校生物化学）。蛋白质二硫异构酶是用来自Stressgene（维多利亚州）的小鼠单克隆抗体检测，加拿大不列颠哥伦比亚省）。
在免疫荧光固定之前，转染细胞用0.1μM MitoTracker Red培养（分子探针，尤金，俄勒冈州）在37°C下保持30分钟。细胞以3.7%的浓度孵育固定多聚甲醛在37°C的磷酸盐缓冲盐水中放置15分钟。这个细胞在冰镇丙酮中培养10分钟后渗透，用抗Drp1抗体和二级抗体染色，用标准异硫氰酸荧光素和罗丹明过滤器组件如前所述(斯米尔诺娃等。, 1998). 双精度内源性Drp1和线粒体的标记通过以下方法实现用MitoTracker培养COS-7细胞，然后固定用甲醇-丙酮（1:1）培养细胞，使其渗透在−20°C下保持3分钟。用抗Drp1抗体对这些细胞进行染色并如上所述进行进一步处理。
GFP变异体通过来自Chroma Technologies公司（Brattleboro，VT），来自Photometrics的PXL电荷耦合设备相机（亚利桑那州图森）和Inovision（北卡罗来纳州达勒姆）的软件。的图像在CFP和YFP中以5s的间隔进行延时实验频道。电荷耦合器件中线粒体的长度图像通过NIH Image软件追踪测量。
亚细胞分离和Western印迹
所有分馏程序均在冰上进行。新鲜牛将脑（50g）在冰冷的缓冲液A（250mM蔗糖，10mMTris-HCl，pH 7.5，1 mM EGTA，含蛋白酶抑制剂混合物；罗氏公司Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany）并在最后一卷中均质250 ml，使用Dounce均质器。将粗裂解液离心在1000×克.由此产生的低速含有细胞核和未破碎细胞的颗粒被丢弃。这个低速上清液（S1）在10000×g、。该步骤产生了中速上清液（S2）和颗粒（P2）。P2组分，包含线粒体和溶酶体在缓冲液中通过再悬浮和排斥作用清洗两次A.S2部分，包含胞浆和轻质膜，如ER和高尔基体在15000×克.将产生的上清液在100,000 ×克将ER和高尔基分开，它们位于P3部分，来自胞浆，属于S3部分。
P2组分中的线粒体用45%Percoll梯度（瑞典乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech AB）通过在Ti70转子中以30 krpm的速度离心30分钟建立（贝克曼仪器公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托）。线粒体带是在大量缓冲液a中稀释。线粒体被制成颗粒在10000×克并清洗通过在缓冲液A中再悬浮和排斥提纯的线粒体重新悬浮在少量缓冲液a中。
将每个级分的蛋白质（75μg）用三氯乙酸，经SDS-PAGE分离。Western blots为用我们的抗Drp1抗体和分子中的20C11-B11-B11进行检测识别NADH-泛喹啉39-kDa亚单位的探针氧化还原酶和A.Rajesekaran提供的抗微管蛋白抗体（加州大学洛杉矶分校病理学系）。这些斑点是用辣根过氧化物酶偶联二级抗体及其增强化学发光试剂（Amersham Pharmacia Biotech AB）。污点用密度计定量（分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）并对数值进行调整，以达到体积当量。值用线粒体标记获得的数据来校正Percoll梯度中的线粒体和随后的洗涤。
蛋白质表达与电子显微镜
杆状病毒纯化蛋白质的方法在别处有详细描述(斯米尔诺娃等。, 2000).简而言之，一个带有6个N末端标记的Drp1表达式构造组氨酸在pBlueBac4载体（Invitrogen）中生成，并在Sf9昆虫细胞。在TALON金属上纯化过表达的蛋白质亲和树脂(克隆技术公司). 将纯化的Drp1稀释至一定浓度HEPES缓冲液中250μg/ml（20 mM HEPES pH 7.2，2 mM氯化镁20.5 mM EGTA、0.5 mM二硫苏糖醇和160 mM氯化钠）。Drp1溶液在4°C下透析16 h有或没有200μM GDP、500μM的同一缓冲区氯化铝三和5 mM NaF（如上所述）(卡尔和Hinshaw，1997年). 样品在HEPES缓冲液中按1:10稀释，吸附在碳涂层电子显微镜格栅上用1%乙酸铀酰染色并风干。电子显微照片通过JEM 1200-EX电子显微镜获得(JEOL公司、东京、，日本）。
结果
突变型Drp1蛋白的过度表达增加线粒体连接性
研究Drp1蛋白如何影响线粒体形态学上，我们用含有人类Drp1的显性负突变。四种不同的突变进行了测试，以帮助区分中断导致的主要缺陷可能的副作用。第一个突变K38A改变了GTPase结构域G1共有基序中的关键赖氨酸丙氨酸，因此可能通过Drp1抑制GTP结合。这个我们之前对哺乳动物Drp1的研究中使用了突变(斯米尔诺娃等。, 1998). 第二个突变V41F是在基因突变秀丽线虫let-60/提供温度的rasGTP水解敏感性(艾森曼和金，1997年). 第三个突变T59A是一种保守苏氨酸的突变可能在GTP-结合蛋白的G2一致模体中(范德布莱克，1999年). 中的类似突变秀丽线虫DRP-1是表明对线粒体有强烈的显性负效应形态学(拉布鲁斯等。, 1999). 第四个突变，G281D，是根据水飞果蝇/动力蛋白基因(范德布利克和Meyerowitz，1991年). 人类动力蛋白的类似突变导致转染COS-7细胞内吞过程中的温度敏感阻滞(达姆克等。, 1995). Drp1突变体结构为瞬时转染COS-7细胞。转基因细胞用抗Drp1抗体和通过用Mitotracker染料。
我们首先测试了V41F和G281D突变是否人类Drp1对温度敏感的主要负面特性。细胞用Drp1（V41F）或Drp1（G281D）结构转染在30或40°C下生长，然后用抗Drp1抗体染色识别转染细胞，并使用MitoTracker监测线粒体形态。转染细胞线粒体突变的Drp1几乎都是异常的（图中所示的细胞)而未经转染的细胞低生长和高生长时的野生型线粒体形态温度（图，A和B，底部）。也有明确的在30或40°C下生长的转染细胞之间的差异。这个30°C下生长的转染细胞的线粒体分布整个细胞。相反，转染细胞的线粒体在40°C下生长的细胞聚集在细胞核周围（图B） 和中有些病例似乎比野生型线粒体厚得多（图D） ●●●●。因此，V41F和G281D突变似乎赋予Drp1温度敏感属性。
Drp1中温度敏感突变的影响线粒体形态。（A和B）转染细胞Drp1（V41F）并在30°C（A）或40°C（B）下生长。（C和D）细胞转染Drp1（G281D）并在30°C（C）或40°C（D）下生长。这个转染细胞通过抗Drp1的免疫荧光鉴定抗体（轮廓细胞）。线粒体形态由用Mitotracker染色。A和B也分别显示未经转染细胞，以说明生长温度不明显影响线粒体在无突变Drp1的细胞中的分布。
为了更系统地分析突变体Drp1的作用，我们还转染含有其他两种突变的Drp1的COS-7细胞（K38A和T59A）。在这些细胞中，线粒体网络无一例外坍塌成大的核周聚集物，类似于高温下的温度敏感突变（比较图中的野生型A受影响图中的单元格，C–G）。偶尔会保留一些长小管（图D） ●●●●。这些表型与之前的相似在转染COS-7细胞中用Drp1（K38A）观察(斯米尔诺娃等阿尔。, 1998). 这些细胞薄片的电子显微镜已经表明线粒体聚集体由聚集的线粒体小管。线粒体簇非常紧密无法区分连接和未连接线粒体(斯米尔诺娃等。, 1998). 帮助确定这些线粒体在我们对野生型细胞进行了多种药物治疗放松线粒体簇的能力。我们发现这种治疗诺卡唑组最有效。处理COS-7细胞1小时用5μM诺可唑解聚所有可以用抗管蛋白抗体免疫荧光检测（我们的未发表的结果），它分散了许多线粒体由突变Drp1诱导的簇。
线粒体分布缺陷的范围由Drp1的不同突变诱导。图像的左栏显示未经诺卡唑处理的转染细胞。剩下的三列显示了转染细胞的不同例子用诺卡唑治疗。（A–A‴）COS-7细胞转染野生型Drp1构建体。（B–B‴）细胞转染Tom20:：GFP构造，用作负数控制，因为它导致线粒体聚集而不影响连接性。（C–C‴）用Drp1（K38A）结构转染的细胞。（D–D‴）用Drp1（V41F）结构转染的细胞。显示的单元格D′中的细胞在30°C下生长，而D”和D‴中的细胞是在40°C下生长。（E–E‴）转染Drp1（T59A）的细胞构造。E“中的插图显示了由这个细胞中的线粒体。（F–F‴）细胞转染Drp1（G281D）在30°C下构建和生长。（G–G‴）细胞转染Drp1（G281D）结构并在40°C下生长。
线粒体簇与诺卡唑的分散使其可以看到集群内的线粒体是如何受到突变体Drp1。突变表型的示例如图所示定量评估见表用野生型Drp1转染的细胞（图，A–A‴）和转染细胞之间融合线粒体外膜蛋白Tom20和GFP（图，B–B‴）用作对照。如前所述Tom20:：GFP融合蛋白诱导线粒体聚集(亚诺等。, 1997). 在诺卡唑治疗中Tom20:：GFP诱导的簇分散，显示线粒体断裂程度与细胞中观察到的相似转染野生型Drp1。这表明Tom20:：GFP和诺卡唑治疗不会影响线粒体的程度连接性。
表1
| n个 | 弱
| 强大
| 平均表型 |
|---|
| 野生型 | 松散的网 | 折叠 | 退化 |
|---|
| 重量 | 103 | 100 | 0 | 0 | 0 | 无 |
| K38A型 | 203 | 0 | 18 | 64 | 18 | 强大 |
| V41F位于30摄氏度 | 96 | 2 | 33 | 60 | 5 | 中级 |
| V41F位于40摄氏度 | 108 | 0 | 8 | 44 | 48 | 强大 |
| 第59页 | 112 | 0 | 12 | 61 | 27 | 强大 |
| G281D位于30摄氏度 | 107 | 40 | 48 | 11 | 1 | 弱 |
| G281D位于40摄氏度 | 120 | 6 | 13 | 46 | 35 | 强大 |
相比之下，转染突变Drp1的细胞显示出一系列线粒体形态。许多转染细胞具有松散的网络相互连接的线粒体（图、C′、D′、E“和F”；在表中分类为“松散网”表型). 在一些细胞中，松散的线粒体小管显示出一个紧密的内部网络，好像在其他细胞中观察到的松散网络已被绘制出来像一块布（图2E“，插入；这些也是在表中分类为松散网表型). 我们还观察到从中央核心放射出的长线粒体丝（图，Cõ，D“和Eõ；分类为“塌陷”表中的表型). 这些丝状物中有许多具有棒状末端。其他细胞含有一个短而厚的线粒体棒状末端，表明线粒体已经融合收缩成单个巨大的线粒体（图2G‴）也在表中分类为坍塌). 在某些单元格中线粒体开始退化，这是由线粒体数量（图2D‴归类为“退化”表中的表型)以及他们的保留能力下降MitoTracker，反映线粒体膜的减少潜力（我们尚未公布的结果）。
如前所示，为了验证突变体Drp1对ER没有影响带Drp1（K40A）(斯米尔诺娃等。, 1998)，我们也染上了用带有不同ER标记的Drp1（T59A）转染的细胞（图). 我们在这里使用的标记是蛋白质二硫异构酶（图B） 和一个共同转染的ER标记（图D类；如前所述，带有C端子ER保持信号的VSV-G以前[斯米尔诺娃等。, 1998]). 转染细胞通过抗Drp1抗体染色鉴定（图、A和C） ●●●●。如前所述，转染细胞产生细胞溶质抗Drp1抗体的染色模式，可能是因为Drp1过度表达导致内源性结合位点饱和(斯米尔诺娃等。, 1998). 蛋白二硫化物染色异构酶抗体在转染和未转染细胞（图、A和B）。VSV-G抗体染色还显示了看起来很野生的ER（图、C和D）。我们得出结论ER染色强度和形态不受突变的影响图纸1。
内质网的形态不是受Drp1（T59A）影响。（A和B）转染Drp1（T59A）的细胞独自一人。（C和D）与Drp1（T59A）和外源性ER标记（VSV-G:：KKTN）实验有助于可视化内质网的网状结构(斯米尔诺娃等。, 1998). 转染细胞通过以下方法鉴定用抗Drp1抗体（A和C）染色。A中的顶部单元格显示Drp1的内源性水平，而底部细胞显示过度表达通过染色观察ER形态抗蛋白二硫异构酶抗体（B）或抗VSV-G抗体（D）。ER的强度和形态不受Drp1（T59A）（比较未转染细胞在B的顶部带有转染细胞的染色模式底部）。内质网的网状结构似乎也未受影响（将D中的染色模式与获得的类似结果进行比较之前使用野生型和Drp1（K40A）转染细胞(斯米尔诺娃等。, 1998)).
为了进一步评估突变体Drp1引起的连接性增加，我们测量用诺卡唑。线粒体的长度可以通过追踪来测量用标准荧光获得的图像，因为转染的COS-7细胞通常非常扁平，因此可以在一个焦平面。我们证实这些线粒体确实是相连的使用共焦显微镜（我们未发表的结果）。我们发现转染野生型Drp1的细胞平均有96个线粒体（SD=16.5，n=5），平均长度5.4μm（标准偏差=6.3，n=5）。相反，转染了Drp1（K38A）通常有一个相互连接的大线粒体（平均大线粒体的长度为401μm，SD=86.5，n=10） 和一些小线粒体（小线粒体的平均数量每个细胞为7，SD=6.6；小线粒体的平均长度为3.1μm，SD=3.8，n=10）。我们的结论是表达突变型Drp1的细胞线粒体几乎全部与野生型细胞中的线粒体相连接当裂变被阻断但聚变仍然可以发生时。一些细胞转染Drp1（G281D）并在30°C下生长的线粒体与野生型难以区分。其他人有一张松散的网线粒体和其他一些紧密的簇不能用诺卡唑分散。相反，所有的Drp1（G281D）细胞在40°C下生长的线粒体簇紧密被诺可达唑分散。转染Drp1（V41F）的细胞通常比转染细胞的受影响更严重Drp1（G281D），即使在30°C时，许多细胞也含有紧密簇线粒体（表). 在较低和更高的温度使我们能够确定线粒体表型强而弱。
线粒体缺陷严重程度的差异可用于将表型排列成等位序列的等价物。这个最弱的表型通常最接近原发性缺陷，而较强的表型可能是由次生缺陷引起的。这个发现Drp1（G281D）在30°C时诱导混合表型，包括看似野生型的线粒体，表明这些是最不严重的表型。在这些条件下高度互联的线粒体网络普遍存在，这表明松散网络表型是最弱的表型，因此突变型Drp1的即时效应（表). 线粒体增加连通性与两者之间平衡的转变是一致的线粒体分裂与融合此 路 不通。在40°C和更强的突变可能代表融合基因的进一步发展线粒体小管的网状结构越来越紧密结构。总之，这些结果表明具有突变Drp1的细胞是线粒体分裂的障碍。
内源性Drp1部分为细胞溶质，部分定位于线粒体
先前尝试将哺乳动物Drp1定位到特异性由于大多数蛋白质细胞溶质的(小腿等。, 1997;伊莫托等。, 1998;卡米莫托等。, 1998;斯米尔诺娃等。, 1998;Yoon公司等。, 1998). 帮助识别具有以下特征的细胞器Drp1可能相关，我们测试了各种固定和染色方法和我们测试了新开发的针对人类的抗体新抗体的免疫荧光显示扩散细胞溶质染色叠加在微弱的点状染色模式上。这些抗体对Drp1具有特异性，因为它们检测到单个总细胞Western blots上预期大小的条带（80 kDa）裂解物（我们未发表的结果）。我们试图改善点状染色模式，因为这种模式可能显示与特定细胞器相关的Drp1的一部分。我们发现用甲醇和丙酮的1:1混合物固定的细胞减少了细胞溶质染色水平，从而有助于发现斑点染色模式。通过使用MitoTracker进行双重标记，我们发现点状染色模式与线粒体一致（图，A–D）。使用ER进行双重标记标记物核糖核酸酶-I与Drp1斑点没有共定位（图,E–H），与之前公布的结果相比表明Drp1与ER有关(Yoon公司等。,1998). 我们自己对各种其他ER标记的试验表明差异可能是由于与线粒体的交叉反应引起的（我们未公布的结果）。我们的结论是内源性Drp1的一部分与线粒体共定位Drp1在胞浆和膜组分之间的分布相似而dynamin也存在于大量的细胞溶质中和较小的膜结合部分。似乎Drp1dynamin，在细胞质与其靶膜之间循环。
内源性Drp1的定位由免疫荧光。（A） 线粒体用MitoTracker染色。（B）用抗Drp1抗体免疫荧光法检测内源性Drp1。（C） Drp1染色的合并图像显示绿色和线粒体染色显示为红色。（D）C中方框区域的放大。箭头指向似乎横切线粒体的Drp1斑点。（E和F）ER和Drp1缺乏共同定位。（E） 获得ER染色模式抗核糖蛋白I抗体。（F） 使用获得的染色图案抗Drp1抗体。（G） 合并图像显示Drp1染色为绿色红色ER染色。（H）G.Bar中装箱区域扩大，5微米。
为了确定Drp1的哪一部分与线粒体相关，我们用牛脑进行亚细胞分离实验。选择大脑是因为它具有最高水平的Drp1表达(斯米尔诺娃等。, 1998). 均质组织是进行差速离心。中速颗粒，其中含有线粒体，在Percoll渐变。通过探测分析所得馏分带有抗Drp1抗体和微管蛋白抗体的蛋白质印迹追踪细胞溶质部分和氧化磷复合物I，以追踪线粒体部分。Drp1蛋白大部分位于细胞溶质中分数。在线粒体部分。线粒体Drp1几乎无法检测到当分析体积当量时，但当装载来自不同组分的等量蛋白质在凝胶上并通过Western blotting进行分析（图). 化学发光密度测定法带，然后进行校正，以获得体积当量，表示Drp1总量的～3%与中速颗粒中的线粒体共分馏Percoll渐变。
Drp1的亚细胞定位牛脑的分离。车道1，粗提取物；车道2，核后上清液（S1）；3号车道，中速上清液（S2）；第4车道，中速弹丸（P2）；通道5，线粒体部分Percoll梯度上的进一步净化；第6车道，高速上清液（S3）；7号车道，高速弹丸（P3）。亚细胞用Drp1抗体检测组分，作为细胞溶质标记物（微管蛋白）和线粒体（OxPhos复合物I的39kDa亚基）。加载相等数量的蛋白质（75μg/车道）为1×车道1，3×车道2和3，43×对于第4车道，第5车道为21×，第6车道为3×，第7车道为75×。密度测定和体积当量调整表明Drp1位于线粒体部分（通道4和5），2%位于高速颗粒，剩下的在上清液中。这个分馏实验重复五次，每次给药类似的结果。
Drp1的大部分仍留在上清液中，即使在高速行驶之后离心，与Drp1打开和关闭的循环一致线粒体。然而，～2%的Drp1可以通过高速造粒离心。Drp1的这一部分可能与膜细胞器，如内质网或小泡，因为它不能被1%Triton X-100溶解，即使ER标记calnexin在这些条件下溶解（我们未发表的结果）。看起来更有可能Drp1的这一部分可以造粒，因为Drp1可以形成高阶多聚体，如dynamin多聚体通过高速离心制成颗粒。相比之下，Drp1的3%可通过以下方法溶解中速颗粒中检测到的Triton®声波风廓线仪X-100，表明该部分确实与膜细胞器，如线粒体（我们未发表的结果）。
GFP:：Drp1融合蛋白定位于线粒体司
使用GFP追踪活细胞中Drp1的运动或YFP与Drp1熔断。表达结构被转染到COS-7。转染后的细胞在24小时内进行检测转染。在随后的时间点，蛋白质聚集体形成，大概是因为在含有大T抗原的细胞。蛋白质聚集体从未在缺乏大T抗原的转染HeLa细胞中观察到。收件人进一步避免蛋白质聚集引起的伪影对融合水平低的细胞进行了观察蛋白质。表达低水平融合蛋白的细胞显示弥散细胞溶质染色和点状染色的混合物线粒体（图A） ●●●●。这个用多种结构检测到点状染色模式，包括与Drp1的N末端融合的GFP或YFP以及与YFP融合的至Drp1的C端，但不单独与GFP或YFP连接。类似以前在酵母和C、。雅致(Otsuga公司等。, 1998;Bleazard公司等阿尔。, 1999;拉布鲁斯等。, 1999;Sesaki和Jensen，1999). 这些融合蛋白可能具有功能，因为之前的研究表明，GFP:：DRP-1在秀丽线虫肌肉细胞增加线粒体的比率划分(拉布鲁斯等。, 1999)，而aDnm1:：GFP融合可以拯救Dnm1的突变表型酵母中的缺失(Sesaki和Jensen，1999年). The distributions of此处观察到的GFP:：Drp1融合也与固定细胞免疫荧光结果。
（A） 一种黄色荧光蛋白的定位（YFP）：：Drp1融合蛋白。COS-7和C2C12细胞转染YFP:：Drp1结构（绿色）和编码氰基荧光蛋白的构建物，靶向线粒体基质（红色）。插图显示外围设备的放大细胞的部分。图像显示Drp1在很大程度上是漫反射的或局限于线粒体上的斑点。（B） 使用YFP:：Drp1对C2C12细胞进行时间推移摄影线粒体上的斑点。C2C12细胞与YFP:：Drp1构造（绿色）和构造编码靶向线粒体基质的氰基荧光蛋白（红色）并每隔5秒拍摄一次。箭头指向一个分区事件之前有一个YFP:：Drp1点。后面的两个箭头时间点表示由线粒体分裂。
确定Drp1的亚细胞定位是否一致具有线粒体膜断裂的拟议功能，我们使用表达YFP:：Drp1（融合到N末端的黄色荧光蛋白和丝裂原：：CFP（靶向于具有线粒体先导序列的线粒体基质）。这个延时实验仅限于信号发出前的～20幅图像由于光漂白而变得太弱。然而，这个数字已经足够了观察单个细胞中的多个线粒体断裂事件。安时间推移序列的示例如图所示B.与早期的单个图像，延时序列显示了Drp1的许多斑点，沿线粒体均匀分布。每一系列时间推移照片只显示了一些实际的线粒体分裂事件。然而，这些分区赛事总是在一个有前面图像中的荧光Drp1斑点。在我们的实验装置中，分裂发生在每小时约5%的荧光斑点中，但这些在时间推移序列中，细胞保持在室温下。细胞保持在37°C下可能有较高的线粒体分裂率，这表明大多数（如果不是全部的话）Drp1点已经准备好进行除法事件。虽然这还没有被证实，但我们可以得出相反的结论结论，即线粒体分裂的位置与Drp1斑点，这与Drp1在线粒体分裂过程。因此，Drp1很可能在分裂之前在线粒体上组装成多聚体复合物发生。
体外纯化的Drp1齐聚物
Drp1和dynamin中蛋白质结构域的相似排列表明Drp1可能能够组装成多聚体类似于dynamin形成的螺旋(Hinshaw和Schmid，1995;塔凯等。, 1995). 确定Drp1是否可以杆状病毒形成这样的螺旋状结构，形成全长蛋白质表达系统，使用Ni-NTA色谱纯化6-his标签并用电子显微镜检查阴性染色网格。测试了高盐和低盐条件，因为之前已经证明可以可逆地导致动态螺旋(Carr和Hinshaw，1997年). 因为dynamin程序集是GTP削弱，GDP和氟化铝推动(卡尔和Hinshaw，1997年)，我们也在这些条件下测试了Drp1程序集。
在高盐条件下（160 mM NaCl），几乎所有Drp1已拆卸。拆卸状态之前显示为主要是四聚体(小腿等。, 1999)，类似于动力蛋白在高盐条件下形成的可溶性四聚体(马尔伯格等。, 1997). 偶尔会出现环状直径为-30–50 nm的结构，类似于动态螺旋（图A） ●●●●。减少盐浓度或通过透析增加GDP和氟化铝增加了大型结构的数量（图B） ●●●●。我们从来没有观察到大量螺旋，我们也没有观察到螺旋堆积正如之前用纯化的dynamin观察到的那样(Carr和Hinshaw，1997年).甚至，这些尺寸也不像用dynamin观察到的那样均匀在处理这两种蛋白质的对照实验中完全相同（我们未公布的结果）。一些结构是它们被拉长了，好像是开口环。环形画廊结构如图所示C.我们得出结论，Drp1可以多重聚合尺寸与dynamin相似的环形结构戒指。但是，程序集属性必须存在差异因为纯化的Drp1形成的结构从未像dynamin公司。线粒体表面的其他因素可能是需要刺激体内的Drp1组装。制造于然而，体外试验表明，Drp1可以形成环状或螺旋状。看起来很可能这些螺旋缠绕在线粒体外膜。综上所述，这个证据之前的研究表明，Drp1螺旋有助于线粒体外膜分裂的阶段(Bleazard公司等。, 1999;拉布鲁斯等。, 1999;Sesaki和延森，1999).
环状结构的体外形成纯化的Drp1。（A） 150 mM孵育的Drp1的电子显微照片氯化钠。（B） Drp1与GDP和AlF一起孵育4−.箭头点环形结构。（C） 环形结构示例通过GDP和AlF观察到4−.蛋白质是醋酸铀酰染色阴性。
讨论
本文解决了Drp1是否控制哺乳动物细胞中的线粒体分裂秀丽线虫我们之前发现突变哺乳动物Drp1破坏线粒体的分布，但当时我们无法确定这种线粒体缺陷的根本原因(斯米尔诺娃等。, 1998). 可能的分割缺陷是被紧密的线粒体核周簇的形成所掩盖在具有突变Drp1的细胞中。这里我们展示了线粒体聚集诺卡唑可以逆转，从而暴露潜在缺陷由突变的Drp1引起。
支持线粒体分裂的证据
用一个导致不同线粒体表型的一系列突变。这些表型可以排列成等位序列的等价物，如如图所示.主要缺陷可能是受影响最轻微的第一个缺陷细胞。通过模拟突变观察到最弱的表型在ts1突变后果蝇基因(厢式货车der Bliek和Meyerowitz，1991年). 一些转染细胞在相对较低的温度下生长，有野生型线粒体，而其他的则有更多相互连接的线粒体通过提高生长温度或使用Drp1中的其他突变。在等位基因序列中，缺陷始于线粒体变得更加互联。线粒体网络是可能是由于裂变和聚变之间的平衡发生了变化线粒体，类似于闭合线粒体的形成阻断酵母线粒体分裂的网络C、。雅致(布莱扎德等。, 1999;拉布鲁斯等阿尔。, 1999;Sesaki和Jensen，1999年). 线粒体网络最终被拉成一张紧密的网，然后网变厚棒状线粒体，在溶蚀最严重之前受影响的细胞。线粒体连接增加的事实是在Drp1突变最弱的细胞中观察到的唯一缺陷表明线粒体分裂的主要缺陷。
由排列在等位序列。右侧的图纸描述了不同的用突变体Drp1观察到的线粒体形态。这个左侧括号表示观察到的形态每个突变。用不同的方法获得的表型重叠Drp1的突变使得从弱表型对这些表型进行排序成为可能（线粒体的封闭网络）通过强大的（崩溃的网络）到很强（细胞溶解）。最弱的表型最直接与主要缺陷相关，表明该缺陷是线粒体分裂。更强的表型可能是由于次级缺陷。
继发性缺陷，如线粒体塌陷成核周簇及其回缩成粗棒状结构，可能反映融合线粒体的错误分布整个单元中的网络。线粒体簇的松动诺卡唑表明，聚集缺陷是微管依赖性。对此有几种可能的解释现象。例如，融合的线粒体网络可能也是笨重地附着在负责顺行的驱动蛋白上线粒体运输(田中等。, 1998). 它是均匀的线粒体分布过程可能取决于与部门机构直接互动。或者线粒体网络可能作为一般机制的一部分聚集在一起处理错误的细胞器，因为线粒体外膜也导致核周的形成线粒体簇(亚诺等。, 1997). 然而，每个这些解释中的一个与线粒体分裂。
Drp1在线粒体分裂中的直接作用被证实为Drp1在线粒体小管斑点中的定位。Drp1通过内源性Drp1的免疫荧光和GFP标记的Drp1。Drp1点沿以下长度均匀分布线粒体小管。时间推移摄影显示Drp1斑点与线粒体实际分裂的位置一致事件，与线粒体分裂的直接作用一致。在秀丽线虫，这些斑点是在分区事件，与分区事件同处一地，然后停留附着在一个新形成的线粒体尖端上。斑点最终消失，可能是因为从线粒体膜进入胞浆(拉布鲁斯等。,1999). 不幸的是，哺乳动物细胞的荧光太弱了检测Drp1在线粒体和胞浆之间的循环。然而，免疫荧光和亚细胞分离数据显示大量细胞溶质Drp1和一小部分Drp1与Drp1在线粒体上的循环一致线粒体。这些定位结果与突变表型提供了强有力的证据，证明野生型Drp1有助于哺乳动物细胞中的线粒体分裂。
我们的结果能与水泡中的功能相一致吗运输？
以前有人认为Drp1影响分泌哺乳动物细胞中的通路(伊莫托等。, 1998). 然而，该研究中未对线粒体形态进行研究，增加了继发影响分泌的可能性线粒体分裂缺陷。我们自己的研究和其他人的研究无法证实对分泌或内吞途径的影响哺乳动物细胞(斯米尔诺娃等。, 1998;皮茨等阿尔。, 1999). Drp1的酵母同源物Dnm1p最初也是被认为会影响水泡交通(甘米牌手表等。, 1995),但后来证明对线粒体分裂具有特异性(布莱扎德等。, 1999;Sesaki和Jensen，1999年)，一如既往C、。雅致DRP-1号机组(拉布鲁斯等。, 1999). 因此，我们发现Drp1不太可能在分泌或内吞途径。
也有人认为Drp1调节膜或蛋白质通量内质网和线粒体之间通过囊泡转运或融合在这两个细胞器之间(皮特斯等。, 1999). 这个这一建议是基于以下观察结果得出的：突变体Drp1不仅导致线粒体聚集，但也会减少内质网数量免疫荧光检测蛋白。如图所示，我们是无法证实这一观察结果，也不是很明显内质网和线粒体之间运输障碍如何影响常驻ER蛋白的数量。也许是常驻ER的合成线粒体缺陷导致蛋白质下调。它是ER蛋白合成也可能间接受到线粒体聚集，因为线粒体可能提供ATP的本地化来源。ER蛋白水平降低可能因此是由严重阻塞引起的次要缺陷线粒体分裂。
除了关于Drp1功能的争论之外，还有对Drp1的本地化存在分歧。我们自己的免疫荧光结果清楚地显示线粒体上的点状染色和背景弥漫性细胞溶质染色，与Drp1的循环一致细胞溶质和线粒体之间。然而，也有报道Drp1定位于puntae中，该puntate仅与线粒体(Yoon公司等。, 1998;皮特斯等。,1999). Drp1本地化中的这些差异可能是由于固定方法的差异。我们确定Drp1是我们获得的结果证实了定位于线粒体亚细胞分离和YFP:：Drp1融合蛋白质。这种本地化也与酵母中的Drp1同源物和秀丽线虫，根据确定免疫荧光、免疫电镜和GFP:：Drp1融合。
我们的亚细胞分离实验证实Drp1在很大程度上是只有3%蛋白质的细胞溶质与线粒体有关。此外，高速颗粒中含有～2%的Drp1。后者之前曾观察到该分数，并将其归因于与ER的关联(Yoon公司等。, 1998). 然而，我们，无法用Triton X-100溶解高速颗粒中的Drp1，虽然Triton X-100确实溶解了高浓度的ER蛋白速度颗粒和Drp1的线粒体部分，即在中速颗粒中。结果表明高速颗粒中的Drp1不受膜约束。相反，Drp1可能是一种低聚物复合物。我们得出结论，Drp1是与线粒体相关，但不与其他膜结合细胞器。这种联系与膀胱的作用不一致交通。然而，这与线粒体的作用是一致的分裂，正如最初提出的酵母和秀丽线虫和哺乳动物Drp1同源，现在被提议使用。
Drp1如何影响线粒体分裂？
纯化的Drp1组装成环状多聚体的能力其尺寸与dynamicn环的尺寸相似(欣肖和施密德，1995年)表明这两种蛋白质使用相似的机制。还观察到了另一类螺旋状组件dynamin家族成员的MX蛋白通过as抑制病毒感染的干扰素诱导蛋白尚不清楚的机制(Nakayama公司等。, 1993). 类似的这些蛋白质中蛋白质结构域的排列表明组装成多重螺旋的能力是一个普遍的特性dynamin家族成员(范德布利克，1999)，因为这些域dynamin家族成员之间保守的也可能是是螺旋形形成的原因(斯米尔诺娃等。,1999). Drp1螺旋大概围绕着线粒体，它们以某种方式控制线粒体的断裂外层膜。Drp1使用的精确机制可能是与质膜上的dynamin相似。这种机制是，然而，这仍然是一个有争议的问题。一些实验表明动力蛋白是一种产生力的酶(斯威策和欣肖，1998年;标志等。, 2001)，而其他人则认为dynamin是调节性GTPase(割断等。, 1999,2000)，可能是激活另一种蛋白质，完成切断过程。它是，然而，显然Drp1和dynamin在它们各自的切割过程。
Drp1和dynamin之间的类比表明线粒体外膜分裂可能来源于第一内共生体进入宿主的内吞机制单元格(范德布利克，2000). 线粒体的其他成分最近在酵母中发现了分裂器。一种蛋白质叫做Mdv1/Fis2/Gag3是一种WD-重复蛋白，可以用作适配器在Dnm1蛋白复合物中(费克斯等。, 2000;莫兹迪等。, 2000;Tieu和Nunnari，2000年). 没有明显的哺乳动物或秀丽线虫，暗示其他绑定伙伴等待发现。第二个蛋白质Fis1/Mdv2是线粒体外层的一个组成部分膜，在那里它可以帮助靶向线粒体表面的Drp1(Mozdy公司等。, 2000;Tieu和Nunnari，2000年). 其他生物体，如人类和秀丽线虫，包含可能的Fis1/Mdv2的同源物，但其功能尚未研究。
最后，可能还有线粒体内膜分裂等待被发现的机器。也许出于技术原因，我们没有观察到内外膜分离之间的脱钩，正如之前在线粒体外膜分裂时观察到的那样在中被阻止秀丽线虫(拉布鲁斯等。,1999). 然而，在哺乳动物细胞中还有其他例子线粒体内膜分裂而不分裂外层膜，确认存在单独的内膜分频器(邓肯等。, 1980). 内膜分裂器可能是由第一个内共生菌引入的细菌，因为藻类线粒体(山毛榉等。, 2000)和叶绿体(奥斯特龙等。, 1998)包含同系物细菌分裂蛋白平方英尺然而，酵母，秀丽线虫哺乳动物不含平方英尺同源物，表明其他未知蛋白质已经采用此函数。一旦这些新的内膜分裂蛋白确定后，将有可能调查线粒体内外膜相互协调。
