亚氨基香豆素支架的发现和表征MEKK2抑制剂（MAP3K2）

摘要

介绍

ERK5信号通路是有丝分裂原激活的蛋白激酶之一（MAPK）信号通路改变细胞外基因表达刺激。[1,2]. ERK5通路被氧化激活应激、高渗和表皮生长因子（EGF）等生长因子[三]. ERK5激活通过MAPK激酶MEK5（MAP2K5）磷酸化。MEK5依次激活通过MAPK激酶激酶MEKK2（MAP3K2）和MEKK3的磷酸化（MAP3K3）。导致MEKK2活化的机制尚不完全清楚。然而，众所周知，MEKK2自身磷酸化对刺激作出反应活化需要自磷酸化[4]. 除了ERK5途径外，MEKK2还通过磷酸化MAP2K MEK7激活JNK MAPK通路激活JNK[5,6]. 小鼠基因敲除研究提供了关于MEKK2/3-MEK5-ERK5途径的生物学功能的线索。ERK5淘汰赛由于心脏发育缺陷和血管生成[7]. ERK5出现保护多种细胞免受应激诱导的凋亡[三,8,9]. 小鼠MEK5基因敲除导致死亡显然是由于心脏发育异常所致，类似于ERK5击倒老鼠[10]. MEKK2公司敲除小鼠表现出正常的发育和生育能力[5,11].然而，小鼠中MEKK3基因的敲除导致胚胎死亡，原因是心脏发育缺陷[12]. 这些动物敲除研究表明，MEKK2和MEKK3响应不同刺激的信号。MEKK2通过细胞附着于纤维连接蛋白，然后定位于局部粘连。乳腺中的RNAi击倒MEKK2研究表明，癌细胞株能够稳定局部粘连并抑制细胞迁移划痕分析中[13,14].

MEKK2在癌症中的潜在作用已被探索到有限的程度。在一项将MEKK2与前列腺癌联系起来的研究表明，MEKK1的表达量是前列腺癌的4.4倍前列腺癌组织与良性组织中的水平比较[15]. 前列腺癌细胞系表达均匀较高水平的MEKK2。microRNA miR-520b被证明可以抑制肿瘤抑制乳腺癌和肝癌细胞生长MEKK2和细胞周期蛋白D1的表达[16]. 重要的是，siRNA仅敲低MEKK2表达能够减少肝癌细胞的生长在体外和体内此外，恢复他人的表达肿瘤抑制因子miR17/20a增强了肿瘤细胞对自然裂解的敏感性通过抑制MEKK2杀伤细胞[17]. MEKK2在原代中高度表达结直肠癌与正常粘膜的比较[18]. 安体内小鼠异种乳腺移植模型癌症被用来评估MEKK2在肿瘤生长和转移中的作用[19]. shRNA介导敲除MEKK2抑制ERK5的激活，以响应EGF对乳腺的作用癌细胞系MDA-MB-231。令人惊讶的是，MEKK2的击倒没有明显影响关于细胞生长在体外但强烈抑制了两种肿瘤的生长和转移体内MEKK2引起的较小肿瘤与大小匹配的对照肿瘤相比，敲除细胞的凋亡增加。在BT474乳腺癌细胞系中敲除MEKK2也导致抑制肿瘤生长体内相反，ERK5的敲低抑制了无明显影响肿瘤生长的转移。在这个动物模型中，MEKK2激活ERK5似乎可以调节转移，而另一个MEKK2依赖性通路，可能是JNK通路，对肿瘤很重要增长。此外被MEKK2、MEK5和ERK5激活的下游组分，许多研究也表明与癌症进展有关[20]. MEKK2抑制剂可减少激活ERK5和JNK通路，提高抗肿瘤能力疗效。

因此，当前的文献数据支持MEKK2作为一部小说的概念药物靶点。然而，没有具体的和强效小分子迄今为止，已有MEKK2抑制剂的报道。我们之前报告过发现批准的药物（如波那替尼）、临床试验药物和其他在生化分析中有效抑制MEKK2活性的研究工具化合物[21,22]. 然而，所有这些都缺乏对MEKK2，目前尚不清楚其中是否有抑制细胞中MEKK2.活性的药物。

材料和方法

结果和讨论

我们之前报道了一种新的内在基因的开发和验证MEKK2的ATP酶活性测定及其高通量应用发现MEKK2小分子抑制剂的试验[21]. 我们使用此分析来筛选收集了大约15000种商用化合物([21]和数据未显示）。在这里，我们报告此屏幕上两个已确认点击的结构和活动。点击化合物1生成的IC₅₀MEKK2 ATP酶活性测定值322±161毫微米(表1). 化合物1进一步证实，这是一次重新合成的打击。两种完全不同的MEKK2分析格式用于确认在ATP酶分析中观察到的活性。MEKK2TR-FRET结合分析通过竞争置换法测定与MEKK2的结合标记的ATP位点结合小分子。另一项MEKK2活性测定是用于检测MEKK2的天然转磷酸化活性，使用激酶激活的MKK6作为底物。MKK6的磷酸化通过使用磷酸化MKK6特异性抗体的西式定量槽印迹[21]. 生成的化合物1结合试验中的平均效价为355±134 nM，261±14转磷酸化分析格式中的nM(表1). 因此，化合物1证实了所有三种MEKK2分析格式中的活性。化合物2（命中#2）生成IC₅₀MEKK2 ATP酶中的值7.7±1.6μM的活性测定和MEKK2结合的类似效价平均IC测定₅₀7.9±3.6 uM(表1). 因此，两次点击均被确认为MEKK2具有多种分析格式的抑制剂。由于化合物1明显更多强有力的是，我们将进一步的工作重点放在了这个支架上。

表1

多种MEKK2分析格式中筛选点击的结构和活性

化合物	结构	集成电路50±标准偏差MEKK2（nM）一
		内源性ATP酶测定	结合试验	Transphos公司。化验
1	在单独的窗口中打开	322 ± 161	355 ± 134b条	261 ± 14b条
2	在单独的窗口中打开	7,710 ± 1,610	7,930 ± 3,600	ND（无损检测）c（c）

在单独的窗口中打开

^一集成电路₅₀值是至少三个值的平均值±SD使用指示的分析进行独立测定。

^b条中报告的值[21].

^c（c）未确定

我们试图对化合物1进行有限的SAR，以探索这种亚氨基香豆素支架可提高效力和选择性。我们专注于苯酚环周围取代和甲氧基修饰的研究铬烯环和使用ATP酶测定法评估活性(表2). 取代酚环的羟基含甲氧基(表2，化合物1a）导致抑制活性完全丧失。许多其他替代品测试（数据未显示），但所有结果都导致活动完全丧失，表明羟基是活性所必需的。这一发现可能是类似于已报道的LRRK2抑制剂，其中建模和SAR表明苯酚基团上的关键4-羟基可以作为保守的供体和受体残留物[26]. 在R′₂酚环的位置，我们用氯、甲基、羟基和氟基团(表2，化合物1b–e）。甲基或羟基的存在组对效力几乎没有影响。相反，氯或氟基团导致IC效力增强₅₀60和115 nM。在R′₁苯酚基团上的位置，我们用替换穿越火线_三甲基和氟基团（化合物1f–h）使用IC显著增强了MEKK2的效力₅₀值为38，分别为28和39 nM。

表2

MEKK2对化合物1衍生物的抑制活性

在单独的窗口中打开
化合物	R′1	R′2	R′三	R′4	R′5	R（右）	集成电路50（毫微米）一
1a个	H（H）	H（H）	OMe公司	H（H）	H（H）	OMe公司	>10,000
1亿	H（H）	氯	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	60b条
1c个	H（H）	我	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	362
1天	H（H）	哦	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	361
第1页	H（H）	F类	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	115
第1页	穿越火线三	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	38
1克	我	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	28
1小时	F类	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	39
1个	F类	F类	哦	H（H）	H（H）	OMe公司	36
1日	H（H）	F类	哦	F类	H（H）	OMe公司	27
1公里	F类	H（H）	哦	H（H）	F类	OMe公司	8
1升	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OEt公司	130b条
100万	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	O丙基	371c（c）
1个	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OI异丙基	502b条
1个	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	F类	2102
1便士	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	英国	152b条
第1季度	H（H）	H（H）	哦	H（H）	H（H）	哦	766
1年	穿越火线三	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OEt公司	18c（c）
1秒	我	H（H）	哦	H（H）	H（H）	OEt公司	16

在单独的窗口中打开

^一集成电路₅₀值是两到五个独立测定值的平均值使用固有ATP酶MEKK2活性测定。

^b条在化合物浓度>1时观察到的明显溶解度问题微米。

^c（c）在化合物浓度>0.3时观察到的明显溶解度问题微米。

因为R′处的氟₁和R′₂位置被证明可以增强效力，我们试图确定是否含有二氟化合物1的类似物将进一步提高效力。二氟化合物1i–j(表2，），在R′₁/R′₂和R′₂/R′₄生成的位置集成电路₅₀值为36和27 nM。这些化合物的效力相似作为单氟化合物1h。然而，在R′₁和R′₅酚醛环的位置用IC生成化合物1k₅₀8 nM。效力的增强单氟化合物和二氟化合物可能是由于吸电子能力调节酚羟基的氢键供体/受体组。在铬烯环的甲氧基位置也发现了有限的SAR(表2). 甲氧基的更换含乙氧基、丙氧基、异丙基、氟、溴和羟基的基团产生化合物1l–q，得到IC₅₀第130、371、502页，分别为2102、151和766 nM。因此，该位置的乙氧基导致效力提高了2倍以上，是测试中最好的替换。由于甲基或CF_三R′处的组₁苯酚基团上的位置显著增强了hit化合物1的效力，我们这些化合物的合成类似物在色烯上含有乙氧基环。甲基和CF_三生成取代化合物1r–s集成电路₅₀分别降至16 nM和18 nM(表2).

为了评估这种支架的选择性，我们分析了选定类似物对一组不同激酶活性的抑制活性由Carna Biosciences执行的分析。选定化合物在1μM化合物对抗50丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶活性分析。化合物1抑制的活性≥50%40%的激酶面板，因此表明此命中的选择性低(图1). R′₂荧光模拟化合物1（1e），在42%的激酶面板(图1). 值得注意的是，>在7次激酶分析中获得了95%的抑制，而最初的抑制该化合物仅在3种激酶中产生>95%的抑制作用。这些数据表明2′F取代导致选择性降低。相反，用R′对化合物1f进行剖析₁穿越火线_三替代对苯酚组的抑制率≥50%，仅为8%激酶面板的(图1). 因此穿越火线_三该组在增强选择性的同时针对MEKK2的活动增加了8倍以上。双修改模拟的剖析化合物1s导致达到面板中16%的激酶(图1)，但它的效力也是原来的两倍与MEKK2相比，与化合物1f相比。总的来说，活性和选择性化合物1f和1s的图谱相似。

在单独的窗口中打开

图1

50激酶活性组中化合物1及其衍生物的选择性化验

激酶分析由Carna Biosciences进行。化合物1、1e、1f和1s在每次分析中以1μM的浓度重复进行测试，平均百分比对指示的激酶绘制抑制曲线。结果按活动排序图形左侧的抑制率最高。虚线表示50%抑制。激酶分析的数量和百分比每种化合物的抑制率≥50%。

我们试图进一步验证化合物1s的MEKK2抑制活性使用不同来源的MEKK2和不同的分析格式评估MAPK家族中其他激酶的选择性(图2). 进行MEKK2转磷酸化分析Carna Biosciences使用MAP2K7作为底物和ELISA检测磷酸化产物。在该测定中，化合物1s产生IC₅₀属于60 nM，MEKK2与IC相似（<4倍）₅₀价值由我们的ATP酶分析格式决定。效力的差异可能是由于在CarnaBio分析中仅使用MEKK2催化域，而不是我们分析中的全长MEKK2。这种化合物还产生了一种IC₅₀对密切相关的MEKK3，使其成为MEKK2/MEKK3。这并不意外，因为MEKK2和MEKK3的催化结构域94%同源[27]. 还测试了抗MAP2K5（MEK5）的活性，50%抑制作用没有实现，可能是由于本试验中的溶解度问题。根据剂量反应曲线，我们估计了IC₅₀第页，共页>1页μM对应MAP2K5。无活性（>10μM IC₅₀)是对照MAP3K5（ASK1）和TAK1-TAB1（MAP3K7）观察。

在单独的窗口中打开

图2

集成电路₅₀化合物1s选择性激酶活性的测定化验

集成电路₅₀Carna对化合物1s进行了测定生物科学使用指示的激酶活性分析。生化激酶使用指示的靶激酶和另一种激酶进行活性测定激酶作为ELISA活性分析中的底物，其中[ATP]处于或接近相应的K_米的值每个激酶分析。化合物1s在10个每次分析的指示浓度和平均值±标准偏差百分比绘制了活动图。计算IC₅₀MEKK2的数值为60 nM（●），MEKK3为53 nM（■），MAP2K5为>1μM对于TAK1-TAB1（◆）和MAP3K5，（▼）和>10μM(▲).

我们进一步研究了化合物1s在基于细胞的分析中的活性。最初，我们测试了化合物1s的细胞毒性。这种化合物没有效果MDA-MB-231细胞在24小时暴露条件下的存活率化验（数据未显示）。我们试图确定化合物1s是否能够抑制ERK5途径使用磷酸化ERK5（pERK5）的出现作为途径激活。我们用10μM化合物处理细胞1.5小时，然后用0.2M山梨醇刺激细胞30分钟(图3A). 细胞裂解物的蛋白质印迹分析表明化合物1s抑制ERK5的磷酸化，ERK5是抑制MEKK2/MEK5/ERK5途径。此外，我们在划痕细胞中测试了化合物1s迁移试验，以确定它是否可以抑制细胞迁移据报道涉及这些细胞的MEKK2(图。3B公司). 数据表明化合物1的非活性类似物没有与DMSO处理的对照组相比，MEK5抑制剂BIX02188（1μM）和化合物1s（10和1μM）显示出对划痕的抑制作用康复。因此，化合物1s能够抑制细胞中ERK5通路的激活以及划痕试验中的细胞迁移。

在单独的窗口中打开

图3

化合物1s在细胞分析中的活性

（A） 用二甲基亚砜或化合物1s（10μM）处理MDA-MB-231细胞然后用山梨醇刺激，如图所示。细胞裂解物的分析方法为磷酸化ERK5（pERK5）和总ERK5的western blot。数据代表了两个独立的实验。（B） 细胞迁移“擦伤”使用MDA-MB-231细胞进行检测。刮伤细胞单层后，细胞在0小时内用1%二甲基亚砜（溶剂）处理，二甲基亚磺酸是一种非活性的类似物化合物1、MEK5抑制剂BIX02188或化合物1s（10或1μM）。照片显示了0和18小时时的划痕，如图所示。白色区域为单元格单层，而黑色区域是没有细胞的区域。每个条件都是在重复或单重阱中进行，数据代表四个独立实验。

我们报告了2个HTS点击的识别和确认在里面体外使用我们之前报告的MEKK2的MEKK1抑制活性ATP酶HTS分析。针对其中一个命中结果的初始SAR研究≥20倍的强效类似物，其中最强效的具有集成电路₅₀MEKK2为8 nM。这一小组类似物也导致了在50成员激酶图谱中鉴定具有改进选择性的类似物面板。这些SAR研究表明，苯氧环周围的取代可以提高MEKK2的效力和选择性。我们还证明了这些类似物在抑制EKR5通路的位置显示了基于细胞的检测活性激活和细胞迁移。

补充材料

致谢

使用的缩写

脚注

工具书类