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Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4605–4612.
2017年8月24日在线发布。 数字对象标识：2017年6月19日10时3892分
预防性维修识别码：PMC5649611
PMID：29085459

miR-1和miR-214的异常改变与PDAC患者的临床病理特征和预后相关

青城, 李华汉, 赵海娟, 李慧（音）,和李建兵
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后不良的恶性疾病。众所周知，PDAC早期难以诊断，无复发预后差，但缺乏有效治疗，对其生物学特性了解有限。因此，迫切需要提高对PDAC相关细胞或分子特性的理解，并探索诊断和治疗该疾病的新途径。在本研究中，使用miRNA微阵列研究了PDAC患者和健康对照者血清和肿瘤样本的microRNA（miRNA/miR）谱，并确定了miR-1表达在PDAC中的潜在作用。长治市人民医院门诊确诊为PDAC的43名患者被邀请参加。采集血液和手术肿瘤样本，通过miRNA微阵列和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行分析。手术肿瘤组织还用于通过以下方式确定miRNA的状态就地杂交（ISH）。微阵列结果显示：i）PDAC患者血清中27个miRNA和肿瘤组织中23个miRNA与对照组相比存在差异；ii）PDAC组的血清或肿瘤组织样本中miR-1、miR-10b和miR-214显著改变。RT-qPCR检测PDAC患者的miRNA水平，结果证实了从miRNA微阵列获得的结果。特别是，本研究结果表明，PDAC组织中miR-1的减少和miR-214的增加与PDAC患者的临床病理特征和生存率有关。本研究结果表明，miRNAs在PDAC致癌进展中起着重要作用，并提供了有用的标记物，包括miR-1、miR-214和miR-10b，用于使用无创方法确定PDAC预后。

关键词：胰腺导管腺癌，microRNA-1，microRNA-10b，microRNA-214，临床病理特征，生存率

介绍

胰腺癌（PCC）是一种高度恶性的肿瘤，具有很高的转移率(1,2). 在美国，PCC是人类死亡的主要原因之一(1). 在美国，预计PCC导致的死亡总数将显著增加，并在2030年之前成为癌症相关死亡的第二大原因(2). 在各种类型的PCC中，胰腺导管腺癌（PDAC）占所有胰腺肿瘤的90%以上。PDAC是一种毁灭性的恶性疾病，预后不良，其所有阶段的1年生存率约为18%(三,4). 仅在2012年，PDAC就导致全球33000人死亡。即使在世界上拥有最好医疗服务的地区，也只有少数患者得到及时及时的治疗，5年生存率<22%，预计发病率会随着人口老龄化而上升(5). 众所周知，PDAC早期难以诊断，无复发预后差，但缺乏有效治疗，对其生物学特性了解有限(6,7). 因此，迫切需要提高对PDAC相关细胞或分子特性的理解，并探索诊断和治疗该疾病的新途径(8,9).

μmicroRNAs（miRNAs/miR）通过与3′非翻译区（UTR）结合，参与抑制翻译和促进靶mRNAs降解。研究还表明，miRNAs在肿瘤组织的发展和进展中可能作为致癌因子或抑制物发挥作用(10). 以前的研究表明，miRNAs在肿瘤细胞的生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、分化、迁移和侵袭(11,12). 以前的研究也表明，某些miRNAs在肿瘤组织中高度表达，而另一些则在肿瘤组织下调(13,14). 这些结果表明，与正常组织相比，癌组织miRNA表达谱的改变可用于PCC诊断。对于PDAC的诊断和预后，迫切需要新的、可靠的生物标志物。循环miRNAs已在PDAC血样中广泛分布，但只有少数研究对候选标记物进行了充分验证(15). 特别是，PDAC患者血清中miRNAs的表达水平尚不清楚，其变化是否与PDAC的严重程度和临床结局相关尚不清楚。

本研究探讨了PDAC患者miRNAs表达状态与致癌进展之间的关系。采用miRNA微阵列分析技术，对PDAC患者和非PDAC患者的血清和肿瘤组织的miRNA谱进行了研究，并确定了miRNA异常表达在PDAC中的可能作用。共有43名患者受邀参加了长治市人民医院（中国长治）的诊所。PDAC患者由两名独立的病理学家通过病理检查确诊。其中，7名患者参与了miRNA微阵列分析。为了证实miRNA微阵列的结果，还获得了43名患者的血液和手术肿瘤样本，用于逆转录定量聚合酶链反应分析。还使用就地杂交。还分析了miRNAs的表达状态与PDAC临床病理特征之间的关系。

材料和方法

学习道德

本研究符合《国际伦理宣言》，并经中国山西省人类伦理委员会和研究伦理委员会批准。通过手术同意书，患者被告知，切除的标本由长治市人民医院保存，可用于科学研究，并将维护其隐私。

患者

本研究纳入了2009年2月至2011年1月期间在长治市人民医院就诊的43名患者（男性22名，女性23名）。患者年龄从39岁到76岁不等，中位年龄为55岁。中位随访时间为60.2个月（平均值±标准差，60.2±2.36个月）。在本研究之前，没有患者接受过手术或化疗。两名资深独立病理学家对这些标本进行了组织病理学验证，确认为PDAC。随后，获得了肿瘤样本和匹配的正常邻近组织，这些组织在肿瘤边缘远端至少0.5 cm处被切除(16).

手术后立即将活检样本分为两部分。一个片段立即储存在−80°C下，直到核酸分离。共制备了7份随机选择的样本和匹配的血清样本，用于miRNA微阵列分析。其余36份样品用于miRNA检测。43名患者的第二部分被固定在4%甲醛中2天，石蜡包埋就地杂交（ISH）检查。如前所述，切割福尔马林固定的石蜡包埋组织（5µm）(17)，并按照制造商的方案用苏木精和伊红（H&E）染色（苏木精伊红染色试剂盒，分类号C0105；中国海门贝尤泰姆生物技术研究所）。如前所述，根据组织病理学标准对PDAC进行分类(18).

此外，在长治市人民医院进行常规健康检查的大量个体中，招募了51名年龄和性别匹配的个体作为健康对照。对其进行处理，以采集血清样本并随后进行miRNA检测。其中，随机选择7名个体作为正常对照，使用miRNA微阵列进行血清分析。

RNA制备和miRNA微阵列

在冰镇PBS中仔细冲洗后，将血清或组织在三唑中的冰上均质化®（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。使用TRIzol分离总RNA®和一个miRNeasy迷你试剂盒（德国希尔登Qiagen GmbH），根据制造商的协议，该试剂盒可有效回收所有RNA物种，包括miRNAs。使用纳米滴分光光度计（ND-1000；Nanodrop Technologies；Thermo Fisher Scientific，Inc.）测量RNA的质量和数量，如前所述通过凝胶电泳测定RNA的完整性(19).

为了检测miRNAs，根据制造商的协议，使用人类microRNA微阵列试剂盒（12.0版）（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）对100 ng RNA进行标记和杂交。采用Agilent microRNA微阵列（1.0版）进行分析。使用安捷伦DNA微阵列扫描仪（G2505B；安捷伦科技公司）检测杂交信号，并使用安捷伦特特征提取软件（10.10.1.1版；安捷伦特科技公司）分析扫描图像。所有数据均保存在国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（GEO）中，可通过GEO系列登录号访问GSE57555型.

血清样品制备

PDAC患者和健康对照的血清样本在确诊后24小时内采集，并在采集后立即进行处理。通过在4°C下以3000×g离心15分钟来分离血清，然后在−80°C下储存直到分析。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用TRIzol从血清和组织样品中制备总RNA®和miRNeasy迷你套件（Qiagen GmbH）。根据制造商的协议，使用TaqMan MicroRNA分析试剂盒（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中的基因特异性引物从总RNA合成cDNA。使用应用生物系统7300序列检测系统（应用生物系统；赛默飞世尔科学公司）对miRNA进行qPCR。根据TaqMan MicroRNA分析协议，10µl PCR体积包含0.67µl逆转录产物、1X TaqMan-Universal PCR主混合物和1µl引物和探针混合物。根据制造商的协议，使用默认阈值设置确定阈值周期数据。阈值周期被定义为荧光超过固定阈值的分数周期数(20,21).

ISH公司

根据制造商的协议，本研究中ISH使用了MicroRNA ISH缓冲液和对照试剂盒（Exiqon A/S，Vedbaek，Denmark）。如前所述，对肿瘤组织中的miR-1、miR-10b和miR-214进行ISH检测(22). 简单地说，将福尔马林固定石蜡包埋的PDAC组织切割成4µm的切片并脱蜡(23). 本研究中使用的miR-1、miR-10b和miR-214探针分别是对人类成熟miR-1，miR-10b和miR-244的补充。为了进行信号检测，使用抗地高辛碱性磷酸酶Fab片段（1:800；罗氏应用科学公司，德国彭茨堡；罗氏诊断公司，德国曼海姆）作为主要抗体，并将载玻片与硝基蓝四唑/5-溴-4-氯吲哚-3-基磷酸溶液孵育（罗氏应用科技公司；罗氏诊断有限公司）。Nuclear Fast Red（德国斯图加特Chroma ATE公司）进行反染色。

统计分析

数值表示为平均值的平均值±标准误差。使用重复测量方差分析和事后检验（最小显著性差异检验或Dunnett的T3）测试各组之间的差异。使用未配对t检验比较各组之间的基线差异。采用分类变量的双侧Fisher精确检验和χ2测试用于比较序数变量。使用Spearman测试分析分级相关数据。除非另有说明，否则P≤0.05表示存在统计学显著差异。所有分析均使用SPSS软件（19.0版；IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行。

结果

PDAC患者的不同miRNA表达谱

使用≥2.0的折叠变化阈值来识别两组间差异表达的miRNA。在两组患者的血清中，PDAC患者和健康对照组之间27个miRNA的表达水平不同，其中14个miRNA上调[智人（hsa）-miR-214、hsa-miR-432、hsa-milR-875-5p、hsa-mitR-760、hsa-micR-526b、hsa-miR-10b、hsa-miR-801、hsa-miR-571、hsa-micR-302b、hse-miR-378、hsa-misR-135a、hsa-minR-520c-3p、hsa-miR-29c和hsa-miR923]，13个miRNAs下调（hsa-miR-301b、hsa-miR185、hsa-milR-144、hsa-micR-124、hsa-miR-30e、hsa-miR-200a、hsa-miR-141、hse-miR-219-5p、hsa-mitR-106b、hsa-miR-1、hsa-misR-23b、hse-miR-186和hsa-miR142-5p；图1A). 在两组获得的肿瘤组织中，PDAC组织与相邻正常对照组之间23个miRNA的表达水平不同，其中12个miRNA上调（hsa-miR-10b、hsa-miR-575、hsa-micR-159a、hsa-milR-644、hsa-miR-581、hsa-mitR-637、hsa-miR-935、hsa-misR-98、hsa-minR-513-3p、hsa-miR-518e、hsa-muR-382和hsa-miR 214），11个miRNAs下调（hsa-miR-1、hsa-miR-19a、hsa-milR-381、hsa-miR-93、hsa-micR-593-3p、hsa-miR-17、hsa-mitR-101、hsa-miR-23a、hsa-micR-214、hsa-minR-653和hsa-miR 519d；图1B). 本研究的重点是miR-1、miR-10b和miR-214，它们在PDAC和对照组的血清和肿瘤样本中存在差异(图2).

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PDAC和健康对照组血清和肿瘤样本的miRNA分析。热图确定了显著差异表达的miRNAs。本文分析了健康对照PDAC患者配对血清和邻近正常组织PDAC患者肿瘤组织中miRNA的表达。红色和绿色分别代表高表达和低表达。（A） 塞拉。（B） 肿瘤。miR、微小RNA；胰腺导管腺癌；hsa，智人。

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PDAC和对照样品之间的差异miRNAs。（A） 血清样本。（B） 肿瘤样本。该图表明，在胰腺导管腺癌和对照组之间的差异miRNA中，miR-1、miR-10b和miR-214在血清或肿瘤组织样本中是不同的。miR、微小RNA；PDAC，胰腺导管腺癌。

miRNAs的定量分析

采用RT-qPCR方法验证芯片结果。miR-1、miR-10b和miR-214的表达在血清（43例PDAC患者和51例对照组）和肿瘤组织（43例患者和匹配的相邻对照组）中检测。结果表明，与健康对照组相比，PDAC组血清中miR-1显著降低(图3A; P<0.05）。与匹配的正常邻近组织相比，PDAC组肿瘤组织中miR-1的水平也降低(图3A; P<0.05）。miR-10b和miR-214的定量分析进一步证实，在PDAC和对照组织之间，这些miR分别在血清和肿瘤样本中上调(图3B和C; P<0.05）。

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使用RT-qPCR检测miRNA表达。用RT-qPCR检测PDAC患者和对照组的血清和肿瘤标本中（A）miR-1、（B）miR-10b和（C）miR-214的表达水平。结果表示为平均值的平均值±标准误差*与对照组相比，P<0.05。RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；miR、微小RNA；PDAC，胰腺导管腺癌。

PDAC相关miR-1异常表达

使用ISH在PDAC细胞的肿瘤组织中检测到miR-1、miR-10b和miR-214 RNA信号，在本研究中，显示阳性癌细胞>10%的病例被认为是miRNA ISH状态阳性(22). ISH检测显示正常邻近组织中miR-1、miR-10b和miR-214呈阳性染色(图4A-C)和PDAC组织(图4D-F). 结果显示miR-1阳性染色(图4A和D)，miR-10b(图4B和E)和miR-214(图4C和F)PDAC肿瘤细胞的细胞质中。

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PDAC和正常邻近组织中miR-1、miR-10b和miR-214的ISH阳性染色。（A） 正常组织中miR-1的原位杂交染色。（B） miR-10b在正常组织中的原位杂交染色。（C） 正常组织中miR-214的ISH染色。（D） PDAC组织中miR-1的ISH染色。（E） PDAC组织中miR-10b的ISH染色。（F） PDAC组织中miR-214的ISH染色。miR-1的ISH信号在PDAC组织中较弱，但在正常邻近组织中显著。PDAC组织中miR-10b和miR-214与正常邻近组织相比呈显著阳性染色。放大倍数，×400。ISH中，就地杂交；miR、微小RNA；PDAC，胰腺导管腺癌。

Spearman分析表明，ISH miR-1阴性状态与肿瘤大小（r=0.661，P<0.01）、淋巴结转移（r=0.399，P<0.05）和病理性肿瘤淋巴结转移分期有关(24)在这43个癌症样本中（r=0.327，P<0.05）(表一). 在60个月（5年）的随访期内，发生了10例PDAC相关死亡，均为miR-1阴性肿瘤患者。pTNM 1期患者的60个月生存率>92%，而pTNM III–IV期患者的生存率<10%。随访60个月患者基于组织miR-1表达的总生存率Kaplan-Meier估计分析(图5). 在整个队列中，与miR-1阴性肿瘤患者相比，miR-1阳性肿瘤患者的总生存率显著增加（82.53vs.23.25%；log-rank检验：χ2=21.63，P=0.00005；图5A).

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具有miR-1和miR-214 ISH状态的PDAC患者的生存曲线（5年）。（A） 经ISH检测miR-1阴性的PDAC患者与ISH结果阳性的患者相比，其5年生存率显著降低（*P<0.05 vs.miR-1阳性样本）。（B） 与ISH信号阴性的患者相比，miR-214阳性ISH信号患者的生存率显著降低（*P<0.05 vs.miR-214-阴性样本）。ISH、，就地杂交；miR、微小RNA；PDAC，胰腺导管腺癌。

表一。

胰腺导管腺癌组织中ISH检测到的miR-1状态与临床病理特征的相关性。

miR-1 ISH染色
临床病理特征阴性（n=32）阳性（n=11）第页秒P值
性别0.1270.740000
男175
女性156
肿瘤大小，cm3.348±0.441.251±0.340.6610.000013
组织学分级0.1140.120000
G1132
G2型105
G3（G3）94
淋巴结转移0.3990.000028
编号02410
N1型81
pTNM阶段0.3270.000542
I–II级78
三11三
四、140

肿瘤大小数据表示为平均值。通过Spearman秩相关检验计算P值（n=43）。ISH、，就地杂交；miR、微小RNA；TNM，肿瘤淋巴结转移；淋巴结。

结果还表明，43例肿瘤中miR-214阳性ISH染色与肿瘤大小（r=0.601，P<0.01）、组织学分级（r=0.407，P<0.01。此外，与miR-214阳性肿瘤患者相比，miR-214-阴性肿瘤患者的总生存率增加（78.99 vs.34.86%；log-rank检验：χ2=11.09，P=0.00061；表二). 在本研究中，未观察到miR-10b染色与淋巴结转移、pTNM分期或5年生存率相关（数据未显示）。

表二：。

胰腺导管腺癌组织中ISH检测到的miR-214状态与临床病理特征的相关性。

miR-214 ISH染色
临床病理特征阴性（n=9）正（n）=34第页秒P值
性别0.1020.4900000
男415
女性519
肿瘤大小，cm1.882±0.243.118±0.520.6010.0000008
组织学分级0.4070.0000015
G1号54
G2级三17
G3（G3）113
淋巴结转移0.5320.0000001
编号076
N1型228
pTNM阶段0.3270.000042
I–II级75
三216
四、013

肿瘤大小数据表示为平均值。通过Spearman秩相关检验计算P值（n=43）。ISH、，就地杂交；miR、微小RNA；TNM、肿瘤淋巴结转移；淋巴结。

讨论

本研究结果显示，无论是在血清中还是在肿瘤样本中，健康对照组和PDAC患者的miRNA表达谱存在差异。在PDAC患者组的血清中，27个miRNA的表达水平与健康对照组不同，其中14个miRNA上调，另外13个miRNA下调。在PDAC患者的肿瘤组织中，23个miRNA的表达水平与邻近正常组织不同，其中12个miRNA上调，其余11个miRNA下调。特别是，微阵列分析结果显示，与血清样本或肿瘤组织相比，PDAC组中miR-1、miR-10b和miR-214的表达存在显著差异。RT-qPCR的数据证实了miR-10b和miR-214的上调，以及miR-1在血清或肿瘤样本中的下调。这些结果表明，PDAC组织中miR-1和miR-214的失调与PDAC患者的临床病理特征和生存率有关。

有证据表明，miRNA的表达似乎是细胞类型和疾病特异性的，并可能用于某些癌症组织类型的分类，与目前大多数可用的生物标记物不同(25). 随后的研究表明，各种miRNAs在PCC中异常表达，并且这些异常表达模式能够准确区分PCC与良性胰腺组织(26,27). 本研究结果表明，与正常对照组相比，PDAC患者的血清和肿瘤组织中有几种miRNAs表达异常，这表明它们在PDAC的发病过程中具有潜在作用。

本研究的结果还证实，PDAC患者血清和肿瘤组织样本中miR-1的下调与这些患者的临床病理特征有关。miR-1在各种癌症中的致癌作用已得到证实。朱和王(28)提示临床骨肉瘤（OS）肿瘤组织中miR-1经常降低，并参与（−）-表没食子儿茶素-3-没食子酸诱导的抗癌作用(28). 另一项研究表明，miR-1通过靶向凋亡蛋白重复表达蛋白1杆状病毒抑制剂对结肠癌的增殖起负调控作用(29). 先前的数据还表明，下调的miR-1是：i）与结肠癌途径相关，与细胞或趋化因子表达相关(30); ii）通过结合靶基因LIM和Src同源性3蛋白1和转导蛋白2与食管鳞癌淋巴结受累、组织学分类和血管浸润相关(31); 和iii）与人类乳腺癌侵袭性表型相关(17). 下调的hsa-miR-1与乳腺癌的侵袭性呈负相关(32,33). 一项功能研究表明，肾癌细胞中miR-1的强制过表达抑制了增殖和转移在体外和体内(34). 先前的研究还表明，miR-1抑制剂显著减少PCC内皮细胞的迁移，但不减少增殖(35). 本研究结果证实了miR-1在PDAC发病过程中的抑癌作用。

在血清和肿瘤样本中的两个上调的miRNAs中，miR-214先前已被确定与小鼠胰腺发育有关(36). 本研究表明，miR-214在PDAC患者中上调，并与肿瘤大小、组织学分级、pTNM分期、淋巴结转移和PDAC患者的总生存率（5年）相关。以前有人认为miR-214参与了小鼠的衰老过程(37)它通过调节刺猬信号来确定肌肉细胞的命运(38)靶向磷酸酶和张力蛋白同源物诱导卵巢癌细胞存活和顺铂耐药(38)负调控HeLa细胞增殖，提高T细胞的存活率和活性(39,40). 先前的一项研究表明，miR-214在不同类型的癌症中起致癌基因或抑癌基因的作用(41). 还发现，与匹配的正常组织相比，胃癌组织中miR-214的表达水平上调，miR-214的表达水平与临床进展和不良预后显著相关(42). 此外，与匹配的良性胰腺组织相比，PCC组织中miR-214的表达增加，并且miR-215的过度表达通过靶向生长家族成员4 mRNA抑制剂降低了PCC细胞对吉西他滨（GEM）的敏感性(43). 研究还表明，miR-214可提高PCC细胞的存活率和GEM耐药性，这可能与PCC患者对化疗的不良反应有关(41). 结合本研究的结果，先前关于miR-214抑癌作用的数据得到了证实。本研究结果表明，miR-214作为一种负调控因子，其失调与PDAC患者的临床病理特征和预后指标有关。此外，miR-10b在胶质瘤和转移性PCC中的表达增加(44,45). 值得注意的是，胃癌、非小细胞肺癌和转移性乳腺癌患者血清miR-10b水平升高(46,47)，这也在本研究中观察到，并表明其在PDAC中的致癌作用。

总之，微阵列分析结果显示，PDAC血清或肿瘤组织样本中的miR-1、miR-10b和miR-214显著改变。RT-qPCR数据证实了血清和肿瘤样本中miR-1、miR-10b和miR-214的失调。分析表明，PDAC组织中miR-1和miR-214的失调与PDAC患者的临床病理特征和5年生存率有关。本研究的结果确定了有用的标记物miR-1和miR-214，用于通过无创方法确定PDAC患者的预后。

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