基因共表达网络分析揭示乳腺癌的预后基因

摘要

介绍

乳腺癌是女性最常见的癌症类型，占所有病例的25%(1). 风险因素包括生活方式（包括吸烟或饮食）、遗传和医疗条件。乳腺癌目前有多种治疗方法，包括手术、放疗、化疗、激素治疗和靶向治疗。然而，某些患者预后较差，其分子机制尚不清楚。预后因素包括疾病分期和等级、疾病复发、患者年龄和健康状况。

随着技术的进步和研究成果的积累，与乳腺癌相关的某些分子标记物已经得到了很好的研究。肿瘤蛋白p53突变是乳腺癌预后不良的因素(2). MYC原癌基因和bHLH转录因子驱动的2-羟基戊二酸积累与乳腺癌预后不良相关(三). 前列腺素-过氧化合酶2表达预测乳腺癌预后较差(4). Ki-67与无病生存相关，但其预后价值尚待验证(5). 基质金属蛋白酶-8基因变异可能影响乳腺癌的预后并对肿瘤转移有抑制作用(6). 参与肿瘤免疫相互作用的基因特征可能提供更准确的预后工具(7). 张等(8)进行了一项荟萃分析，证明C-X-C基序趋化因子受体4的过度表达与淋巴结状态和远处转移显著相关，表明总体生存率和无病生存率较差。SRY-box 4过度表达是乳腺癌患者恶性状态和不良预后的生物标志物(9). 其他一些新的生物标记物也被鉴定出来，包括染色体同源物1(10)，HOX转录物反义基因间RNA(9)和前坡3(11). 然而，需要更多的预后基因来进一步改善治疗决策，从而提高乳腺癌患者的生活质量。

微阵列技术已被广泛用于识别乳腺癌的生物标记物(12,13)允许大规模筛选分子标记。在本研究中，获得了两个基因表达数据集以揭示预后基因(14,15). 一个数据集用于识别与淋巴结阴性原发性乳腺癌远处转移相关的基因(14)；另一个用于确定与乳腺癌紫杉醇-蒽环类化疗后的反应和生存有关的基因(14). 将这两个数据集结合起来构建基因共表达网络，并分析生存时间，以确定与乳腺癌预后相关的新生物标志物。

材料和方法

结果

基因表达数据

共鉴定出13191个基因{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准数据集，其中方框图显示在图1根据方框图，每个样本中的平均总mRNA表达水平是一致的，表明两个数据集都实现了良好的归一化性能。

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图1。

两个数据集的标准化基因表达数据的方框图。（A）{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准（286个样品）和（B）{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准（从总共508个样本中随机选择200个样本）。每个样本中的平均总mRNA表达水平是一致的，表明实现了良好的归一化性能。x轴代表基因表达水平；y轴表示样本。

功能富集分析

共筛选出2669个变异系数（CV）>0.5的基因。功能富集分析表明，它们主要与免疫反应、细胞增殖、细胞分化和细胞粘附有关(表一).

表一。

排名前15位的生物途径明显过多。

身份证件	描述	P值	调整后的P值
去：0006955	免疫应答	2.19×10−63	3.27×10−61
去：0006952	防御反应	2.15×10−57	2.80×10−55
转到：0006950	对压力的反应	1.57×10−56	1.96×10−54
去：0007166	细胞表面受体信号通路	1.20×10−55	1.43×10−53
去：0008283	细胞增殖	1.06×10−49	1.09×10−47
去：0002682	免疫系统过程的调节	6.12×10−42	4.82×10−40
GO:0016477号	细胞迁移	7.58×10−40	5.66×10−38
GO:0045321号	白细胞活化	1.90×10−39	1.32×10−37
去：0006954	炎症反应	3.92×10−38	2.66×10−36
GO:0048584号	刺激反应的积极调节	6.10×10−38	4.05×10−36
GO:0042127号	细胞增殖的调节	1.72×10−37	1.10×10−35
GO:0030154编号	细胞分化	3.01×10−34	1.70×10−32
GO:0048869号	细胞发育过程	2.06×10−33	1.14×10−31
GO:0007155号	细胞粘附	7.77×10−33	4.22×10−31
GO:0022610号	生物粘附性	1.11×10−32	5.90×10−31

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调整后的P值：使用一般线性模型方差分析中的多重比较，调整后的P-值表示一系列比较（假设检验）中的哪些因子水平比较存在显著差异。

预后基因

WGCNA为这两个数据集构建了两个基因共表达网络(图2). 从以下网络中确定了七个模块{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}天然气2034通过加权系数矩阵的层次聚类，W公司(图3). 这些模块被称为红色、蓝色、绿色、黑色、棕色、黄色和绿松石模块。

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图2。

数据集的基因共表达网络{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准（左）和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准（右）。x轴表示节点的度数，k个，而y轴表示具有k个,p（k）.

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图3。

从基因共表达网络中识别出七个模块。聚类分析结果如上所示，模块识别如下所示。

学位，k个，计算模块中的每个基因，并确定每个基因与存活率之间的Cox回归P值。其次k个和-log₁₀（P） 已计算。黄色模块与数据集中的生存时间有显著相关性{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准（P=9.3×10⁻¹³) (图4A)，这也是在数据集中观察到的{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准（P=9.3×10⁻⁶) (图4B). 此外，生存相关基因（Cox回归中P<0.05）在两个数据集中的黄色模块中均显著过表达(图5). 因此，黄色模块被认为与乳腺癌患者的生存率显著相关，这需要进一步研究，以了解生存时间与关键基因表达之间的关系。

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图4。

数据集中Cox回归度和P值的散点图（A）{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准和（B）{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准x轴表示回归程度，y轴表示P值。每个圆圈代表一个基因。

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图5。

每个模块中的生存相关基因。x轴表示模块，y轴表示过度表示的重要性。

来自黄色模块的144个基因用于数据集样本的聚类分析{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准根据这些基因的表达将患者样本分为两组(图6). 两组生存时间有显著差异（P=0.008；图7). 功能富集分析表明，来自黄色模块的144个基因参与了细胞周期、卵母细胞减数分裂、肿瘤蛋白p53信号通路和孕酮介导的卵母细胞成熟(表二).

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图6。

使用144个存活相关基因的表达程度进行聚类分析{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准数据集。

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图7。

两组乳腺癌患者样本的生存曲线根据144个基因的表达进行聚类。

表二。

KEGG通路富含黄色模块的144个基因。

身份证件	描述	P值	调整后的P值
hsa04110标准	细胞周期	5.22×10−18	3.13×10−17
hsa04114号	卵母细胞减数分裂	2.17×10−9	6.50×10−9
hsa04115号	p53信号通路	2.46×10−5	4.91×10−5
hsa04914号	孕酮介导的卵母细胞成熟	9.19×10−5	1.38×10−4

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p53，肿瘤蛋白p53。调整后的P值：在一般线性模型方差分析中使用多重比较，调整后的P-值表明一系列比较（假设检验）中的哪些因子水平比较存在显著差异。

从黄色模块中选出前10个hub基因(表III)包括细胞周期蛋白B2（CCNB2）、泛素结合酶E2C（UBE2C）、胞质分裂1蛋白调节因子（PRC1）、细胞分裂周期20（CDC20）、异常纺锤体微管组装（ASPM）、叉头盒M1（FOXM1）、驱动蛋白家族成员4A（KIF4A）、核仁和纺锤体相关蛋白1（NUSAP1）、垂体瘤转化1（PTTG1）和中心体蛋白55kDa（CEP55）。在这两个数据集中，所有这些基因都与生存时间显著相关。

表三。

黄色模块中的前10个枢纽基因。

数据集	基因名称	系数	P值	k个总计	k个在
｛“type”：“entrez geo”，“attrs”：｛“text”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”｝GSE2034标准	CCNB2号机组	0.3640	0.0003	14.7998	12.4392
	PRC1	0.3868	0.0005	12.9603	11.3677
	UBE2C公司	0.4281	0.0006	14.1236	11.2433
	ASPM公司	0.3442	0.0002	12.9467	10.9328
	CDC20型	0.2339	0.0065	14.6847	10.7527
	FOXM1型	0.1988	0.0168	13.7352	10.7131
	CEP55公司	0.3691	0.0004	12.6988	10.6131
	KIF4A（基辅）	0.2648	0.0217	12.1095	10.3165
	NUSAP1号机组	0.3931	0.0012	11.7988	10.2885
	PTTG1型	0.4027	0.0019	12.4981	10.2449
{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE25066”，“term_id”：“25066”}}GSE25066标准	CCNB2号机组	0.323932	0.3239	0.0006	9.4109
	项目风险控制1	0.276034	0.2760	0.0023	6.6109
	UBE2C公司	0.381925	0.3819	0.0003	6.1036
	ASPM公司	0.207911	0.2079	0.0031	4.9210
	CDC20型	0.329027	0.3290	0	8.5936
	FOXM1型	0.170967	0.1710	0.0091	5.9345
	CEP55公司	0.304415	0.3044	0.0002	6.3694
	KIF4A（基辅）	0.568168	0.5682	0.0001	3.1945
	NUSAP1号机组	0.270014	0.2700	0.0061	6.7332
	PTTG1型	0.791755	0.7918	0	4.0029

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讨论

获得了两个乳腺癌基因表达数据集，并选择了2669个CV>0.5的差异表达基因。这些基因与免疫反应、细胞增殖和细胞迁移有关。这些功能与肿瘤的发展和转移密切相关。为数据集构建了乳腺癌特异性基因共表达网络{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2034”，“term_id”：“2034”}}GSE2034标准从中识别出7个模块。黄色模块与生存时间密切相关，因此，对来自黄色模块的144个基因进行了进一步研究。这些基因主要参与细胞周期和肿瘤蛋白p53信号通路。黄色模块中确定了前10个hub基因，所有这些基因都与患者预后不良有关。

黄色模块中的10个关键基因大多数与细胞周期有关。CCNB2是细胞周期调控机制的重要组成部分(20). 浸润性乳腺癌中CCNB2表达升高与不良临床结局相关(21). UBE2C是有丝分裂细胞周期蛋白降解和细胞周期进展所必需的，并参与癌症进展。UBE2C在乳腺微钙化病变中高表达(22). UBE2C的预后价值已在多项研究中得到验证(23–25). microRNA-196a转录后上调UBE2C并促进乳腺癌细胞增殖(26). 抑制UBE2C可减少乳腺癌细胞的增殖并使其对放疗和化疗敏感(27)这表明它可能成为一个潜在的治疗靶点。CDC20是细胞周期中的调节蛋白。CDC20过度表达预测乳腺癌短期生存率(22). ASPM对正常的有丝分裂纺锤体功能至关重要，是肝细胞癌血管浸润、早期复发和预后不良的标志(28). ASPM表达增加也与上皮性卵巢癌的肿瘤分级增加和生存率降低有关(29). 据报道，CCNB2和ASPM蛋白的表达之间存在显著相关性(21)可能在乳腺癌的发展中起作用。

FOXM1是一种参与细胞增殖的转录激活物，是乳腺癌HER2过度表达的下游靶点和标记(30). FOXM1与乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关(31,32)并在化疗耐药性中发挥作用(33,34). KIF4A是一种依赖ATP的微管运动蛋白，参与膜细胞器的细胞内运输。KIF4A与阿霉素诱导的乳腺癌细胞凋亡有关(35). NUSAP1可能参与肿瘤的发生以及乳腺癌的侵袭和进展过程(36)；它通过控制BRCA1的蛋白质水平影响DNA损伤反应(37). PTTG1具有致瘤活性体内在多种肿瘤中高表达；它与乳腺癌内分泌治疗抵抗有关(38). PTTG1可能通过上皮-间充质转化和肿瘤干细胞数量的增加促进肿瘤恶性化(39). CEP55也参与乳腺癌的进展(40)可能通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B途径和中体命运发挥致癌功能(41).

PRC1编码一种参与胞质分裂的蛋白质，特别是平行微管的极化，其表达水平在细胞周期的不同阶段显著变化。PRC1已被证明是几种细胞周期素依赖激酶（CDK）的底物；它的选择性剪接导致多种转录变体(42,43). 尽管PRC1在细胞周期中起着重要作用，但其在乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究结果表明，PRC1在乳腺癌发病机制中的作用需要进一步研究。

基因共表达网络分析揭示了几个在乳腺癌中具有预后意义的基因。这些基因中的大多数已经被先前的研究所证实；然而，通过基因共表达网络分析确定的某些关键基因在乳腺癌中的功能尚不清楚，从而为进一步研究提供了靶点。这些前瞻性研究可能揭示新的生物标记物或为乳腺癌治疗提供靶点。

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