Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4372–4378.
在多发性骨髓瘤和单克隆丙种球蛋白病中跨越共同脆性位点FRA16D的含WW结构域氧化还原酶基因的复发性改变
,1,* ,2,* ,2 ,2 ,2 ,2 ,1 ,三 ,4 ,5和2
Hiroshi Handa（广岛）
1日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院，医学和临床科学系
佐佐木义子
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
Hikaru Hattori公司
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
洛布娜·阿尔克布西
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
Kasamatsu先生
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
Takayuki Saitoh先生
2群马大学医学研究生院实验科学系，日本群马市前桥371-8511
三井武木
1日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院，医学和临床科学系
横滨秋池子
三日本群马371-8511，前桥，群马大学医院输血服务
津本正美（Norifumi Tsukamoto）
4日本群马371-8511，前桥，群马大学医院肿瘤中心
松本森夫（Morio Matsumoto）
5日本群马377-0280，Shibukawa，Shibuka Wa，国家医院组织Shibuka医疗中心血液科
村上弘子
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
1日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院，医学和临床科学系
2日本群马371-8511，前桥，群马大学医学研究生院实验室科学系
三日本群马371-8511，前桥，群马大学医院输血服务
4日本群马371-8511，前桥，群马大学医院肿瘤中心
5日本群马377-0280，Shibukawa，Shibuka Wa，国家医院组织Shibuka医疗中心血液科
*平均出资
2016年9月20日收到；2017年3月3日接受。
摘要
含有氧化还原酶（WWOX）的假定肿瘤抑制基因WW域跨越染色体16q23.3上的一个常见脆性位点（CFS）。CFS是癌细胞中基因组高度不稳定的区域和基因组缺失的位点。因此，WWOX在不同的非血液肿瘤类型中发生结构改变。然而，WWOX在血液肿瘤类型中的作用尚不清楚，包括多发性骨髓瘤（MM）和单克隆免疫球蛋白病（MGUS）。使用逆转录和甲基化特异性聚合酶链反应分析，分析MM、MGUS或非侵袭性淋巴瘤（对照）患者WWOX的表达和甲基化。与10%的对照组相比，分别有65%和50%的MM和MGUS患者检测到变异WWOX转录物。MM患者WWOX表达较高，35%的MM患者检测到WWOX启动子甲基化，而MGUS患者和对照组分别为5%和4%。WWOX启动子甲基化与患者的总体生存时间缩短显著相关，尤其是那些从未使用新药物治疗的MM患者。基因组改变，包括影响WWOX表达的缺失和启动子甲基化，早期发生，可能与MM的发病机制、进展和预后有关。
关键词：多发性骨髓瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、含有氧化还原酶基因的WW结构域、常见脆性位点、甲基化
介绍
多发性骨髓瘤（MM）的潜在分子机制与免疫球蛋白重链基因易位引起的癌基因激活有关(1,2). 还涉及某些基因的突变或缺失(三,4). 尽管MM是不可治愈的，但由于新疗法的发展，目前的中位生存时间为5-7年，而2000年之前为3年(5). MM患者的预后与遗传异常有关(三)因此，鉴定预测预后的分子遗传标记至关重要。高通量下一代测序技术的应用有助于理解MM的发病机制(三,4)；然而，所涉及的基因组改变的全面覆盖范围尚不清楚。
染色体不稳定性是某些癌症类型的特征，与染色体脆性位点（CFS）的存在有关(6). 常见的脆性位点存在于正常染色体中，在部分抑制DNA合成的条件下，容易形成染色体间隙和断裂(7). 此外，CFS是基因组高度不稳定的区域，是癌细胞中缺失和其他改变的常见部位(8,9). 脆位蚜虫素型常见脆位(16)染色体16q23.2上的（q23.2）（FRA16D）是第二个最常表达的CFS区域(10)在多种类型的癌症中被确认为缺失(11–13).
含有WW结构域的氧化还原酶（WWOX）基因被鉴定为一个假定的肿瘤抑制基因(14–17)和跨度FRA16D(16,18,19). 基因改变，包括影响WWOX基因座的纯合子和半合子缺失，发生在某些类型的癌症中(20–22). MM患者发生16q染色体全部或部分缺失和杂合性丢失(23–25). 此外，位于染色体16q上的WWOX和柱状瘤病基因的相对低表达水平与预后较差有关(24).
WWOX是16q染色体重复缺失的靶点(15–17,19)通过去除编码氧化还原酶结构域的外显子6-8，破坏WWOX等位基因，导致产生变异转录物。WWOX变异体转录物在乳腺、肺、食管和血液系统恶性肿瘤中常见(17,26–30).
有证据表明，WWOX全长表达的缺失是由于WWOX在最活跃的人类CFS中的定位所致(15–17,19)；然而，其他研究表明WWOX启动子的甲基化导致表达减少(31–33). 此外，表观遗传过程，特别是DNA甲基化，与致癌有关，多项研究报告了抑癌基因甲基化与MM患者不良预后之间的关系(34–40).
CFS基因在各种恶性肿瘤中常常甲基化(41,42)，但关于血液系统恶性肿瘤类型的信息很少(43,44). 此外，WWOX启动子的甲基化与不同类型癌症患者的不良预后有关(31,45–47). 据我们所知，以前没有研究报告WWOX的改变与MM的进展有关联。本研究旨在阐明WWOX在MM发病机制中的作用。
材料和方法
细胞系
人类骨髓瘤细胞系RPMI8226是从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯市，美国）获得的，KMS11、KMS12PE、KMM1、KMS18和KMS26人骨髓瘤细胞株是由Takemi Otsuki博士（日本冈山川崎医学院）提供的。将细胞系在补充有10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）的10ml RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany）中，在37°C下，在含有5%CO的气氛中培养2.
患者
受试者包括165例MM患者（男性82例，女性83例），平均年龄67岁（范围34-87），33例单克隆免疫球蛋白病（MGUS）患者（男性16例，女性17例），根据国际骨髓瘤工作组（IMWG）诊断，平均年龄为67岁（范畴44-81）多发性骨髓瘤的诊断标准(48)25例淋巴瘤骨髓浸润不足作为对照。所有患者均于2004年1月至2011年9月在群马大学医院接受治疗。本研究由群马大学医院机构审查委员会（IRB编号810）批准。在收集3毫升骨髓抽吸物之前，所有患者都获得了书面知情同意。
血浆细胞纯化
使用与PE结合的抗CD138抗体（Beckman-Coulter，Brea，CA）和包含抗PE抗体与微磁珠结合的Easy Sep PE阳性选择试剂盒（STEMCELL Technologies，Vancouver，BC，Canada），从30名MM患者的BM单核细胞中纯化血浆细胞。使用流式细胞仪（FACSCanto II，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）分析CD138阳性浆细胞的纯度。
核酸的分离
根据制造商的方案，使用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒（Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA）从88名MM患者中提取DNA。根据制造商的方案，使用All-Prep mini-kit（Qiagen，Inc.）分别从77例MM患者和33例MGUS患者以及25例缺乏骨髓浸润的淋巴瘤患者中提取DNA和RNA。
WWOX转录物的嵌套逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析
使用带有gDNA擦除器的PrimeScript RT-PCR试剂盒（日本大津Takara Bio公司），从77例MM患者、33例MGUS患者和25例对照患者以及细胞系KMM1、KMS11、KMS12PE、KMS18、KMS26和RPMI8226中获得10 ng总RNA，合成cDNA。使用嵌套引物进行第一次和第二次PCR扩增，如下所示：第一正向，5′-AGTCCTTGAGCGAGTGGACC-3′和反向，5′-TACTTTCAAACAGGCCACCAC-3′和第二正向，5′-AGTGCTCCCACAGTC-3′和反向，5′-GGTGTGCCCATCCGCTC-3′(29,30). 每个反应（每个反应50µl）包含0.2µmol每个底漆，2.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTP混合物、1X PCR缓冲液和1.25单位Takara ExTaq热启动版本（Takara Bio，Inc.）。热循环条件保持如下：95°C持续8分钟；94°C下35次循环30秒，57°C下30秒，72°C下1分钟；并在72°C下延长步骤5 min。第二个反应使用第一个反应的总共1µl扩增产物。通过2%琼脂糖凝胶电泳扩增产物，并使用溴化乙锭进行可视化。
甲基化特异PCR（MSP）
WWOX基因的CpG岛位于转录起始位点上游406 bp，被认为是启动子区域。MSP用于检测该区域的甲基化水平。采用165例MM患者、33例MGUS患者和25例对照患者的DNA，以及细胞系KMM1、KMS11、KMS12PE、KMS18、KMS26和RPMI8226进行MSP分析。按照制造商的协议，使用甲基易Xceed快速DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒（Takara Bio，Inc.）用亚硫酸氢钠处理每个0.5µg基因组DNA样品，并对转化的DNA进行PCR。使用设计用于扩增WWOX启动子甲基化或非甲基化序列的特异性引物进行MSP。甲基化或非甲基化DNA的引物序列如下：甲基化正向，5′-TATGGGCGTCGTTTTTAGT-3′和反向，5′-CAATCTCCGAATATCGCGCACA-3′；非甲基化正向，5′-TATGGGTGTTGTTTTTAGTT-3′和反向，5′-CAATCTCCACAATACACAA-3′(31). 每个反应（每个反应20µl）包含0.2µmol每个底漆，2.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTP混合物、1X PCR缓冲液和1.25单位Takara ExTaq热启动版本（Takara Bio，Inc.）。热循环条件保持如下：95°C持续8分钟；94°C下35次循环30秒，58°C下30秒，72°C下1分钟；72°C的延伸步骤持续5分钟。通过2%琼脂糖凝胶电泳扩增产物，并使用溴化乙锭进行可视化。
统计分析
使用IBM SPSS软件（22.0版；IBM SPSS，美国纽约州阿蒙克市）进行统计分析。使用χ比较频率2使用Student t检验或Mann-Whitney U检验比较平均值。使用Kaplan-Meier估计方法、对数秩检验和广义Wilcoxon检验计算总生存率（OS）和统计显著性。
结果
WWOX mRNA分析
嵌套PCR分析()检测到全长野生型WWOX mRNA和缺失外显子6-8的短变异体WWOX m RNA。变异型在KMM1和KMS18细胞中低水平表达，在KMS11和RPMI8226细胞中高水平表达。KMS12PE和KMS26细胞中检测到全长野生型WWOX，RPMI8226细胞表达野生型和变异转录物。
使用巢式逆转录聚合酶链反应检测野生型和变异WWOX mRNA。（A） 野生型WWOX和变异体扩增子分别迁移为1288和600 bp带。在KMM1、KMS11、KMS18和RPMI8226细胞系中检测到变异WWOX扩增子，RPMI8226-细胞表达这两种形式。在KMM1和KMS18细胞中检测到一条弱带，其中WWOX启动子被甲基化。（B） 含有氧化还原酶WWOX域的MM患者血浆细胞中野生型和变异WWOX扩增子的检测；bp，碱基对；MM，多发性骨髓瘤。
在9名MM患者、7名MGUS患者和4名淋巴瘤患者中检测不到WWOX转录物（数据未显示），这些患者被排除在以下分析之外。68例MM患者中有44例（65%）检测到变异WWOX mRNA()、13/26例（50%）MGUS患者和2/21例（10%）淋巴瘤患者(). 这表明MM和MGUS骨髓细胞表达变异WWOX的频率相似（P=0.16），并且与淋巴瘤骨髓细胞相比，其表达频率明显更高（分别P<0.001和P=0.004；). MM和MGUS患者中变异WWOX mRNA的检测频率相似，表明WWOX的改变发生在MM的癌前阶段。
表一。
MM或MGUS患者和对照组受试者中变异WWOX mRNA、WWOX启动子甲基化和RASSF1A启动子甲基性的频率。
| 患者数量（%） | |
|---|
|
| |
|---|
| 基因组改变 | 淋巴瘤 | MGUS公司 | MM（毫米） | P值 |
|---|
| 变型WWOX | 2/21 (10) | 13/26 (50) | 44/68 (65) | 0.1620一 |
| | | | 0.0001b条 |
| | | | 0.0030c |
| WWOX甲基化 | 1/25 (4) | 2/33 (6) | 58/165 (35) | 0.0012一 |
| | | | 0.0020b条 |
| | | | 0.7300c |
| RASSF1A甲基化 | 3/25 (12) | 14/33 (42) | 63/165（38） | 0.7120一 |
| | | | 0.0120b条 |
| | | | 0.0190c |
对从同一名MM患者获得的CD138阳性浆细胞和CD138阴性骨髓细胞进行纯化和分析，以确定浆细胞是否表达变异WWOX。在17/30例患者（57%）的CD138阳性浆细胞中检测到变异WWOX mRNA，这与上述MM患者的全罗单核细胞分析结果相当（P=0.45；数据未显示）。这与在6/30（24%）的CD138阴性细胞样本中的检测结果相比显著更高（P=0.01）。这些结果表明，WWOX mRNA的变异形式是MM细胞的真正异常，而不是所有造血细胞的特征。
WWOX启动子在MM细胞系和肿瘤细胞中的甲基化
MSP分析检测到2/6（KMM1和KMS18）细胞系中WWOX启动子甲基化()3/4的MM患者(). WWOX启动子甲基化在58/165（35%）MM患者、2/33（6%）MGUS患者和1/25淋巴瘤患者（4%）的样本中检测到。MM患者WWOX启动子甲基化的频率明显高于MGUS（P=0.001）或淋巴瘤（P=0.002）患者，但MGUS或淋巴瘤患者之间的差异不显著（P=0.73；). 这表明WWOX在MM细胞中优先甲基化。
WWOX启动子的甲基化特异性聚合酶链反应分析。（A） Lane M，甲基化WWOX启动子；U巷，非甲基WWOX启动子。在KMM1和KMS18细胞系的DNA中检测到WWOX启动子甲基化。（B） 检测MM患者甲基化和非甲基化WWOX启动子DNA。WWOX，含有氧化还原酶的WW结构域；MM，多发性骨髓瘤。
为了确定甲基化是WWOX特有的还是反映MM细胞中抑癌基因的甲基化状态，分析了Ras关联域家族成员1亚型A（RASSF1A）启动子甲基化。165例MM患者中有63例（38%）、33例MGUS患者中有14例（42%）和25例淋巴瘤患者中有3例（12%）检测到RASSF1A启动子甲基化；). MM和MGUS患者人数之间的频率无显著差异（P=0.70）。在MM患者中，RASSF1A启动子甲基化的频率等同于WWOX超甲基化。然而，在MGUS患者中，与WWOX相比，RASSF1A启动子甲基化的频率更高（P=0.04；数据未显示），这表明WWOX的特定甲基化与MM的进展相关。
MM患者预后与WWOX启动子甲基化的关系
使用Kaplan-Meier估计法、对数秩和广义Wilcoxon检验来确定WWOX启动子甲基化与MM患者OS之间的关联。与未甲基化的患者相比，甲基化WWOX序列患者的中位OS时间更短（3.83年vs.629年；). 根据广义Wilcoxon检验的结果（P=0.02），这种差异是显著的，但log-rank检验的结果除外（P=0.11）。由于新型药物，即硼替佐米、沙利度胺和来那度胺，对MM有效，因此根据使用或不使用新型药物的患者进行分层，并再次分析数据。与未甲基化的患者相比，WWOX启动子甲基化患者的中位OS时间更短（2.1年vs.6.3年）。广义Wilcoxon检验（P=0.04）和对数秩和检验（P=0.02；). 相比之下，使用新型药物治疗的每类患者的平均OS时间没有显著差异（甲基化，5.1年；未检测到甲基化，5.4年；P=0.73；数据未显示）。
OS和WWOX启动子甲基化分析。实线和虚线分别表示WWOX启动子甲基化或不甲基化患者的OS。（A） 对WWOX启动子甲基化患者和未甲基化患者的Kaplan-Meier分析显示，中位生存时间分别为3.83年和6.29年。（B） 根据化疗类型对患者进行分层。WWOX启动子甲基化患者和未甲基化患者的中位生存时间分别为2.1年和6.3年。OS，总体生存率；WWOX，含有氧化还原酶的WW结构域。
WWOX启动子甲基化、β2-微球蛋白水平和国际分期系统（ISS）分类的分析
与MGUS患者相比，MM患者WWOX启动子甲基化的发生率更高，并且甲基化与更短的OS时间之间存在关联，这表明WWOX基因启动子甲基化与疾病进展相关。为了支持这一假设，根据ISS分析了WWOX启动子甲基化、血清β2-微球蛋白水平和MM分期之间的关系(49). WWOX启动子甲基化患者的平均β2-微球蛋白水平显著高于未甲基化患者（6.80与4.68 mg/l；P=0.02；数据未显示）。ISS 3期患者中WWOX启动子甲基化的发生率明显高于未甲基化的患者（P=0.02；数据未显示）。
讨论
在本研究中，发现在MM或MGUS患者中WWOX mRNA的短形式反复表达。此外，研究表明，在MM患者中WWOX启动子经常甲基化，并且这种甲基化在疾病从MGUS进展到晚期MM的过程中增加。此外，WWOX基因启动子甲基化被确定与较短的中位OS时间有关。
野生型转录物普遍表达，也会出现较短的变体(15,17). 例如，各种癌症细胞系中染色体16q23.2的纯合缺失包括WWOX外显子的缺失(17)产生更短WWOX mRNA变体。在之前的一项研究中，在乳腺癌患者的临床样本中发现了大量缺失外显子5-8的截断WWOX变异体(27). 肿瘤细胞中全长WWOX转录物的表达减少以及检测到肿瘤中特异性的高水平变异WWOX基因转录物表明WWOX可能参与肿瘤的发生(27).
在本研究中，在MM或MGUS患者的骨髓瘤细胞系和浆细胞中检测到变异WWOX mRNAs，但在对照患者的细胞中检测频率明显较低。这些结果表明WWOX的改变与异常浆细胞有关。
癌前病变中CFS的不稳定性与基因组不稳定性相关(50)肿瘤发生的早期阶段与DNA损伤反应有关(50,51). 基因组不稳定和异常是MM的特征，异常的DNA修复途径参与疾病的发生和发展(52). WWOX缺乏会降低ATM丝氨酸/苏氨酸激酶水平，并损害DNA修复，这可能导致基因组不稳定(51). 因此，WWOX的改变也可能导致基因组不稳定。本研究对MGUS患者中变异WWOX mRNA表达的结果表明，CFS的改变表明该疾病早期的基因组不稳定。
对WWOX蛋白敲除和低形态小鼠的研究表明，WWOX的功能缺陷会导致各种类型的肿瘤，包括淋巴瘤和浆细胞瘤(53–55).体外，WWOX抑制β-catenin(56)并抑制核因子κB（NF-κB）-RELA原癌基因、NF-κ的B亚基复合物的转录活性(57)变异体WWOX是主要的负性因子在体外抑制野生型WWOX的抑癌功能(26). 这些发现，加上本研究的结果，支持WWOX功能丧失在MM发病机制中起致病作用的假设。
与MGUS患者和对照组相比，MM患者细胞中WWOX启动子甲基化的频繁检测表明WWOX基因甲基化与MM进展相关。这与WWOX甲基化与卵巢癌患者预后不良相关的研究结果一致(47)头颈癌(58)和脉络膜癌(59).
WWOX甲基化与OS之间没有显著相关性。这可能是由于使用新型药物改善了治疗结果。因此，根据患者接受的治疗类型对患者进行分层，如果WWOX甲基化患者没有接受新型药物治疗，其预后会更差，这表明WWOX的甲基化可能与常规细胞毒药物的耐药性有关。
总之，本研究证明WWOX启动子甲基化与β2-微球蛋白水平和ISS相关，表明WWOX甲基化有助于MM进展。与WWOX不同，MGUS患者和MM患者的RASSF1A甲基化率相似。因此，WWOX甲基化与更渐进和更差表型的关联可能并不反映抑癌基因的甲基化。
基因组不稳定是大多数癌症的特征，可能与肿瘤发生和治疗反应有关。由于WWOX是一种假定的人类抑癌基因，因此，脆性位点不稳定导致的功能丧失的选择可能与MM进展有关。需要进一步的机制研究来确定WWOX和其他CFS中的其他基因在MM发病机制中的作用。
致谢
本研究得到了日本文部科学省的支持（批准号：20590556）。
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