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EMBO J。2005年2月23日；24(4): 717–729.
2005年2月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600559
预防性维修识别码：项目编号：549619
PMID：15692567

PACS-2控制内质网-线粒体通讯和Bid介导的凋亡

托马斯·西蒙，1 约瑟夫·E·阿斯兰，1 Anastasia D Blagoveshchenskaya公司，1 劳雷尔·托马斯，1 雷婉，1 杨翔，1,* Sylvain F Feliciangeli公司，1 简慧红，1 科林·M·克拉姆，1,†和加里·托马斯1,一
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摘要

内质网（ER）和线粒体形成联系，支持这两个细胞器之间的通讯，包括脂质的合成和转移，以及钙的交换，后者调节ER伴侣、线粒体ATP的生成和凋亡。尽管内质网-线粒体接触具有基本作用，但对调节它们的分子知之甚少。在这里，我们报道了一种多功能分选蛋白PACS-2的鉴定，该蛋白整合了内质网-线粒体通讯、内质网稳态和凋亡。PACS-2控制线粒体与内质网的并置，因为PACS-2的缺失会导致BAP31依赖性线粒体断裂并与内质网解偶联。PACS-2还控制线粒体相关膜上内质网脂质合成中心的形成和内质网稳态。然而，作为对凋亡诱导物的反应，PACS-2将Bid转位到线粒体，从而引发一系列事件，包括线粒体截短Bid的形成、细胞色素的释放c（c）以及caspase-3的激活，从而导致细胞死亡。总之，我们的结果确定PACS-2是一种新的分选蛋白，它将内质网-线粒体轴与内质网稳态和细胞命运控制联系在一起，并为Bid的作用提供了新的见解。

关键词：凋亡、Bid、内质网、线粒体、PACS-2

介绍

内质网（ER）控制着多种细胞过程，包括可溶性蛋白和膜蛋白向分泌途径的移位、代谢物的解毒和脂质的生物合成。内质网还充当钙离子的主要内部储存库，介导信号传导、ATP生成和凋亡(沃尔茨等, 2002). 广泛的生物化学和遗传学研究表明，内质网、高尔基体和内体/溶酶体之间的通讯在很大程度上由COPII、COPI和基于网格蛋白的分选机制的成分介导的囊泡交通控制(Bonifacino和Lippincott-Schwartz，2003年). 然而，高分辨率3D电子断层扫描显示，扩张的网状内质网与这些分泌途径的每一个隔室以及线粒体形成密切联系(沼泽等, 2001). 事实上，多达20%的线粒体表面与内质网直接接触，突显了内质网与线粒体之间的动态和高度调节的通讯(里祖托等, 1998). 内质网和线粒体之间形成的紧密接触导致了这样一种模型，即内质网-线粒体之间的通讯可能通过直接传递而不是通过囊泡通讯进行。为了支持这一模型，生物化学研究表明，内质网还通过线粒体相关膜（MAM）与线粒体通信，MAM是内质网相关膜，含有多种磷脂和鞘糖脂合成酶，包括脂肪酸辅酶A连接酶4（FACL4）和磷脂酰丝氨酸合成酶1（PSS-1），并支持脂质在内质网和线粒体之间的直接转移(皮奇尼等, 1998;斯通和万斯，2000年).

除了支持脂质转移外，并列的内质网和线粒体还交换钙离子，钙离子调节从内质网伴侣辅助的新合成蛋白质折叠到参与ATP生成的克雷布斯循环反应的线粒体定位脱氢酶的调节等过程，以及执行细胞死亡程序的钙依赖酶的激活(Berridge，2002年). 免疫细胞化学研究表明，内质网靠近线粒体的区域富含IP3受体，将这些区域确定为内质网向线粒体钙转移的“热点”(里祖托等, 1998). 干扰钙稳态或内质网和线粒体之间的钙通讯，例如，用thapsigargin处理细胞，阻断内质网对钙的摄取(哈诺茨基等, 2000)导致ER-localized蛋白质折叠功能失常，导致未折叠蛋白质的积累。因此，ER-localized酶催化氧化蛋白折叠故障和未折叠蛋白积累。这种应激诱导未折叠蛋白反应（UPR），该反应与ER伴侣蛋白的增加表达相协调，以重建ER稳态。然而，如果内质网内环境无法重建，UPR就会触发细胞凋亡(Rutkowski和Kaufman，2004年).

凋亡由半胱氨酸蛋白酶执行，半胱氨酸酶催化结构成分的系统溶解，导致细胞死亡(Boatright和Salvesen，2003年). 细胞凋亡的诱导通常由启动子caspase触发，其中caspase-8就是其中之一。导致caspase-8激活的凋亡信号被定义为由Fas配体或TNF-α与细胞表面死亡受体结合而启动的外源性凋亡途径，或由细胞内信号提示的内源性凋亡途径。随后线粒体的分裂标志着凋亡程序的早期关键步骤。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8通过裂解ER货运受体BAP31形成p20促进线粒体分裂，p20诱导Drp1/Dlp1（线粒体定位的动力蛋白）分裂线粒体(布雷肯里奇等, 2003). 线粒体断裂促进促凋亡分子的募集和激活，导致线粒体通透性，从而激活凋亡程序中的远端步骤(Karbowski和Youle，2003年).

线粒体通透性受Bcl-2蛋白活性之间的平衡调节，Bcl-2蛋白质包括抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-xL，或促凋亡成员，例如Bid、Bak和Bax(夏普等, 2004). Bid是内源性和外源性凋亡途径的必要组成部分。凋亡信号诱导Bid去磷酸化，导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8裂解Bid，形成强大的凋亡性截短Bid（tBid）(总量等, 1999;德萨热等, 2001). tBid的肉豆蔻酰化被提议作为一个“开关”，将其靶向线粒体(查等, 2000)其中tBid BH3结构域与外线粒体膜上的Bak和Bax相互作用，形成释放细胞色素的孔c（c）进入细胞溶质(世界环境学会等, 2001). 释放的细胞色素c（c）激活caspase-3，一种控制凋亡程序远端阶段的执行者caspase(蒂瓦里等, 1995). 然而，最近的研究表明，全长Bid可以转移到线粒体，进而导致膜通透性和细胞色素c（c）释放(塔法尼等, 2002;德格利·埃斯波斯蒂等, 2003;萨里格等, 2003). 与其他研究一起报道细胞溶质中激活的caspase-8(Micheau和Tschopp，2003年)以及线粒体(钱德拉等, 2004)这些研究表明，线粒体靶向不需要Bid裂解，tBid的形成可能发生在全长Bid靶向线粒体之后。

以前，我们鉴定了一种分选蛋白PACS-1，它以磷酸化状态依赖的方式与货物分子结合，并将其从内体转运到反式-高尔基网络（TGN）(万等, 1998;克伦普等, 2001;斯科特等, 2003). 在此，我们报告了PACS-2的鉴定，PACS-2是一种控制内质网-线粒体轴的多功能分选蛋白，包括线粒体与内质网和内质网稳态的并置。此外，我们发现，在诱导细胞凋亡后，PACS-2与去磷酸化的Bid结合，并被要求将全长Bid传递到线粒体，随后Bid被裂解为tBid，导致细胞色素的释放c（c）caspase-3的激活和细胞死亡。

结果

PACS-2的鉴定

我们之前发现了一种分类连接体PACS-1，它通过引导膜蛋白从内胚层室中提取来定位TGN的膜蛋白(万等, 1998;克伦普等, 2001;斯科特等, 2003). PACS-1与膜载体上的蛋白激酶CK2磷酸化酸性簇排序基序结合，并将其与网格蛋白适配器AP-1和AP-3连接。然而，EST数据库搜索显示存在第二个PACS系统基因。因此，我们用对应于EST的DNA探针筛选了人脑皮层文库，并获得了编码PACS家族新成员PACS-2的全长cDNA(图1A). 序列比对表明，预测的889 aa PACS-2蛋白与963 aa人PACS-1的总序列一致性为54%，与140 aa货物/适配器结合区（FBR）中的PACS-1具有81%的序列一致性。

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PACS-2的鉴定和表征，PACS-2是一种在内质网和线粒体上发现的分选蛋白(A类)上图：人类PACS-1和PACS-2蛋白质的示意图和Kyte–Doolittle疏水性图。FBR、货物/适配器绑定区域；ARR，阿托品-1相关区域。辐射杂交和基因组数据库分析绘制了PACS-1号机组基因到染色体11q13.1（GenbankAY320283年)和PACS-2系列基因到染色体14q32.33（GenbankAY320284年). 底部：PACS-1和PACS-2转录物组织分布的Northern blot分析。(B类)A7细胞内源性PACS-1和PACS-2的共焦免疫荧光。用Alexa488（绿色）显示PACS-1/PACS-2，用Alexa546或丝裂原追踪仪（红色）显示标记。比例尺，10μm。(C类)转染PACS-1或PACS-2 siRNA的A7细胞在转染后48小时通过Western blot进行分析。(D类)无论是否用PACS-1或PACS-2 siRNA转染A7细胞。48小时后，使用抗CI-MPR（绿色）和抗TGN46（红色）对细胞进行免疫荧光显微镜检查。(E类)将对照（加扰）、PACS-1或PACS-2 siRNAs转染A7细胞48小时，并处理线粒体（线粒体跟踪器，红色）和ER（PDI，绿色）的共焦免疫荧光定位。(F类)用相应的siRNA转染A7细胞，并通过Annexin V/碘化丙啶染色和FACS分析检测细胞死亡。用促凋亡CtBP siRNA处理细胞作为阳性对照(张等, 2003). 所有图形的错误=s.d。

RNA杂交和免疫荧光研究表明PACS-1和PACS-2具有不同的作用。Northern blot分析表明，4.4 kb的PACS-1和3.8 kb的主要PACS-2转录物广泛表达，在心脏、大脑、胰腺和睾丸中表达水平最高(图1A). PACS-1选择性富集于外周血白细胞，而PACS-2选择性富集于骨骼肌。此外，PACS-1和PACS-2显示出不同的细胞内染色模式：PACS-1主要定位于核旁区域，点状染色模式与AP-1适配器重叠，而PACS-2则显示出弥漫染色模式，主要与ER伴侣蛋白二硫键异构酶（PDI）共定位和COPI互变异构体，但不是AP-1(图1B). 其他分析显示，PACS-2染色与线粒体的重叠有限。

PACS-2控制内质网-线粒体接触

确定PACS-2的作用体内，我们用siRNAs转染细胞，在2天的治疗后，特异性地耗尽PACS-1或PACS-2(图1C). 与我们之前的研究一致，我们发现PACS-1（而非PACS-2）的缺失导致了阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-MPR），一种PACS-1货运蛋白(万等, 1998)，从TGN中定位错误并在内体群体中积累(图1D). 令人惊讶的是，我们发现PACS-2的缺失，而不是PACS-1的缺失，导致了广泛的线粒体断裂，并且似乎将断裂的线粒体与内质网解偶联(图1E). 为了确保线粒体与内质网的解偶联不是PACS-2 siRNA毒性的结果，我们通过膜联蛋白V/碘化丙啶染色确定，PACS-1或PACS-2的siRNA缺失对细胞活力或蛋白质合成的影响可以忽略不计(图1F和数据未显示）。

为了更严格地确定PACS-2缺失对内质网/线粒体的影响，我们进行了电子显微镜分析。在PACS-2缺失细胞中，我们观察到含有缺乏相关线粒体的长内质网小管的胞浆面积增加了约2倍，因为线粒体集中在核旁区域(图2A和B). 尽管存在广泛的碎片，并且与毒性分析一致(图1F)根据四甲基罗丹明（TMRM）的负荷测定，PACS-2缺失细胞中的线粒体完整性没有受到破坏，这需要完整的膜电位（ΨM（M），图2C).

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PACS-2缺失会破坏线粒体结构。(A类)用PACS-2 siRNA转染或不转染A7细胞，并进行电子显微镜检查。放大倍数，×4500。(B类)采用形态计量分析法对对照细胞或PACS-2缺失细胞内质网线粒体的解偶联程度进行量化（见材料和方法）。(C类)在显微镜分析之前，用100 nM TMRM培养细胞30分钟。对照细胞用10μM FCCP处理30分钟，解偶联ΨM（M）并阻止TMRM加载。(D类)通过Percoll梯度分馏从对照细胞（反式）、PACS-2和PACS-2Admut表达细胞的粗匀浆（HMG）中分离出MAM，并通过Western blot使用针对MAM组分的抗PSS-1抗体进行鉴定(斯通和万斯，2000年). 通过Western blot检测PACS-2或PACS-2Admut对MAM-相关FACL4定位的影响。右：MAM-相关FACL4的定量(n个=3). (E类)用抗BAP31蛋白免疫印迹法分析对照组和siRNA-转染A7细胞的裂解物。(F类)用crBAP31-flag转染A7细胞，然后用PACS-2 siRNA转染48小时。然后用抗flag单克隆抗体对细胞进行免疫荧光处理，以检测crBAP31-表达细胞（右面板）和有丝分裂跟踪器（左面板）。箭头，杆状线粒体。箭头，碎片状线粒体。

我们发现线粒体与内质网紧密结合需要PACS-2，这促使我们确定脂质生物合成酶对MAM的定位是否也依赖于PACS-2。PACS-2过表达增加了与分离MAM组分相关的FACL4的数量(图2D). 相反，显性阴性PACS-2Admut的表达(科特根等, 2005)MAM组分中FACL4和PSS-1的含量降低。总之，这些结果进一步支持了PACS-2在维持ER–线粒体轴中的关键作用。

我们的结果与最近的研究一致，这些研究表明，参与内质网运输的蛋白质也可能在维持线粒体形状和线粒体与内质网并列方面发挥重要作用，如灭活酵母COPI或半胱氨酸蛋白酶8催化哺乳动物BAP31裂解形成p20，这两种情况都会导致线粒体断裂，与PACS-2缺失细胞中发生的情况类似(普林茨等, 2000;布雷肯里奇等, 2003). 因此，我们测试了PACS-2缺失诱导BAP31分裂为p20的可能性，发现PACS-2的缺失而非PACS-1诱导BAP31-p20的分裂，与凋亡过程中观察到的过程类似(图2E). 相比之下，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的BAP31分子crBAP31的瞬时表达(阮（Nguyen）等, 2000)，阻断了PACS-2 siRNA诱导的线粒体断裂，表明PACS-2缺失后线粒体形状的这些变化是由BAP31分裂为p20所致(图2F).

PACS-2介导内质网稳态

除了促进内质网和线粒体之间的脂质转移外，线粒体与内质网的并列还促进ATP转移到内质网，以进行伴侣介导的蛋白质折叠，并允许钙介导的两个细胞器之间的通讯(哈诺茨基等, 2000). 因此，我们的发现是，PACS-2缺失导致线粒体断裂，并将该细胞器从内质网中解偶联，这增加了以下可能性：除了介导MAM形成外，PACS-1还可能影响内质网折叠和钙稳态。为了测试这种可能性，我们首先确定PACS-2缺失是否影响BiP水平，BiP是一种内质网应激源上调的内质网伴侣蛋白，以维持新合成蛋白质的有效折叠和输出(Rutkowski和Kaufman，2004年). PACS-2 siRNA诱导BiP水平增加约2倍，类似于强效UPR诱导剂二硫苏糖醇（DTT）和thapsigargin诱导的增加(图3A). 其次，我们检测了PACS-2 siRNA-介导的BiP诱导是否是对BAP31/p20介导的线粒体内质网解耦联的直接反应(图2F)，也阻止了BiP诱导(图3B)，表明PACS-2缺失细胞中的线粒体断裂和BiP诱导直接由BAP31分裂为p20所致。第三，我们测量了组胺在装有钙传感器Fura-2的对照或PACS-2缺失细胞中诱导IP3受体介导的ER钙释放的能力。我们发现，与PACS-1缺失细胞或对照细胞相比，组胺诱导从内质网释放到PACS-2缺失细胞胞浆中的钙增加了两倍(图3C). 总之，这些结果表明，PACS-2 siRNA介导的内质网与线粒体的解偶联被内质网蛋白折叠机制和钙水平的增加所补偿，以重建内质网内稳态。

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PACS-2缺失会破坏内质网内稳态。(A类)转染48小时后，对siRNA处理的A7细胞进行裂解，并通过Western blot测定BiP的量。用1 mM DTT或5 mM thapsigargin（THG）处理16 h的细胞中BiP含量作为阳性对照。将所有值归一化，以控制用干扰siRNA转染的细胞(B类)用PACS-2 siRNA转染或不转染对照细胞和HeLa（KB）-crBAP31细胞，并用Western blot分析BiP的表达。(C类)用Fura-2负载PACS-1或PACS-2缺失的A7细胞和对照细胞（转染干扰siRNA），并用组胺处理，以刺激内质网通过IP释放钙三R.插图：组胺释放ER钙的相对量(n个=3).

PACS-2缺失阻断凋亡程序

除了导致线粒体断裂外，p20还诱导凋亡细胞死亡(布雷肯里奇等, 2003). 因此，我们矛盾的发现是，PACS-2缺失诱导了两种内质网应激(图3)p20介导的线粒体断裂(图2)，但不是凋亡(图1)，表明PACS-2在某种程度上是p20介导的凋亡诱导所必需的。为了测试这种可能性，我们用1.2μM staurosporine（STS）处理PACS-1或PACS-2缺失的细胞额外24小时，并量化凋亡和坏死细胞的数量(图4A). STS导致约95%的对照细胞和PACS-1缺失细胞死亡。相比之下，PACS-2的缺失对STS产生了显著的耐药性，使存活细胞的百分比增加了近四倍。通过分析STS介导的多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）caspase裂解产生p85，证实了PACS-2 siRNA的抗凋亡作用(图4B). 对照细胞的STS处理显示，在添加STS后4小时开始快速开始PARP切割，在孵育6小时后几乎完全切割，而PACS-2在孵育6小时时没有显示出可检测的加工。值得注意的是，PARP裂解的延迟与用caspase抑制剂zVAD-fmk预处理的细胞中观察到的延迟相同，这表明PACS-2缺失会抑制执行者caspase介导的蛋白水解。用thapsigargin或Fas Ab处理细胞时也获得了类似的结果，证明了PACS-2对内源性和外源性凋亡途径的重要性（数据未显示）。

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STS诱导的细胞死亡依赖于PACS-2。(A类)转染PACS-1、PACS-2或干扰siRNAs 48 h的A7细胞再与1.2μM STS孵育24 h，用抗annexinV/碘化丙啶染色的FACS分析定量活细胞百分比。(B类)A7细胞转染PACS特异性或干扰siRNAs，或单独用低聚体胺处理（对照）。在没有或存在10μM zVAD-fmk的情况下，用1.2μM STS诱导细胞凋亡0、1、2、4和6小时，并用Western blot分析裂解产物以检测PARP对p85产物的裂解。(C类)如图所示，用siRNA转染A7细胞，在不存在或存在10μM zVAD-fmk的情况下用1.2μM STS处理4小时，收获，并通过蛋白质印迹分析前和活化的胱天蛋白酶-8和-3或α-微管蛋白（负载对照）。(D类)经1.2μM STS处理4 h的A7细胞的核后上清液通过沉淀到胞浆和含线粒体的重膜组分中来溶解，然后用抗细胞色素进行Western blotc（c），抗细胞色素c（c）氧化酶I（线粒体标记）或抗α-微管蛋白（胞浆标记）。(E类)将PACS-1或PACS-2缺失的A7细胞和对照细胞（转染干扰siRNA）与1.2μM STS孵育4 h，然后加载Fura-2。在组胺刺激后，按照图3C.

接下来，我们研究了PACS-2缺失是否阻断了STS介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（一种将PARP裂解为p85的执行器半胱氨酸蛋白酶）的激活。我们发现，STS在对照细胞和PACS-1缺失细胞中诱导caspase-3激活，而PACS-2缺失阻断了STS介导的caspase-2激活，与zVAD-fmk治疗的细胞中观察到的情况类似(图4C). 接下来，我们确定PACS-2的缺失是否影响caspase-8的激活，caspase是一种在STS处理后被裂解的启动子caspase(Joshi和Sahni，2003年). 我们发现，无论PACS-1或PACS-2是否存在，STS都能刺激caspase-8的zVAD-fmk敏感性激活(图4C). 总之，这些结果表明，在PACS-2缺乏后，STS有效激活caspase-8而非caspase-3的能力可能是由于PACS-2缺失的细胞无法刺激细胞色素的释放c（c）线粒体对凋亡信号的反应。为了测试这种可能性，对用STS处理过的细胞膜室进行了分离和细胞色素释放分析c（c）我们发现细胞色素有明显移位c（c）添加STS后4小时，从线粒体重膜部分到胞浆(图4D). 然而，PACS-2的耗尽阻断了细胞色素c（c）在这些条件下释放，从而解释了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在PACS-2缺失细胞中不能被激活的原因。除了激活caspase-3外，还释放细胞色素c（c）通过IP3受体增加电导，导致ER钙大量释放，从而放大凋亡途径(博宁等, 2003). 因此，我们发现PACS-2缺失，它阻断了细胞色素c（c）释放，与对照治疗或PACS-1耗竭相比，严重减轻了STS引起内质网钙储备耗竭的能力(图4E). 总之，这些结果表明，PACS-2耗竭至少部分通过抑制细胞色素的释放来阻断细胞凋亡c（c）从而阻断caspase-3激活和ER钙的凋亡释放。因此，除了控制ER–线粒体轴外，PACS-2似乎在连接线粒体与细胞死亡程序方面发挥着重要作用。

凋亡程序诱导PACS-2将Bid靶向线粒体

尽管PACS-2对诱导细胞凋亡很重要，但我们的结果并不能解释这种ER分选蛋白如何促进细胞色素c（c）线粒体对凋亡诱导物的反应释放。因此，我们研究了PACS-2自身在细胞凋亡发生过程中的定位。令人惊讶的是，我们发现凋亡诱导物刺激了PACS-2从内质网快速重新分布到线粒体(图5A，顶部，另请参见图1B). 然而，用1.2μM STS处理细胞1小时后，PACS-2染色显著重新分布，显示出与线粒体的明显共定位(图5A，底部）。用衣霉素或Fas Ab处理细胞也得到了类似的结果(图6C、底部和未显示的数据）。最后，我们对细胞进行膜分离，以生化方法确定凋亡诱导剂是否将PACS-2从内质网重新分配到线粒体，包括STS和膜霉素在内的凋亡诱导剂刺激PACS-2从胞质和富含ER的轻膜组分转移到含有重膜组分的线粒体(图5B).

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凋亡诱导将PACS-2重新定向到线粒体上(A类)A7细胞未经处理（对照）或用1.2μM STS处理1小时，并用一级抗体和种特异性二级抗体孵育，以检测PACS-2（绿色）和PDI（红色）或用丝裂原追踪仪染色（红色）。(B类)将对照组和衣霉素（Tun）或STS处理过的细胞均质化，核后上清液通过沉淀到胞浆、轻细胞膜和重细胞膜（线粒体部分）中来溶解，然后用抗PACS-2、抗细胞色素蛋白进行Western blotc（c）氧化酶I（线粒体）或抗BiP（ER）。

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死亡信号刺激PACS-2介导的Bid转运至线粒体(A类)上图：GST-PACS-2FBR与他的6-使用抗Bid抗体通过Western blot检测Bid、tBid和结合Bid分子。底部：GST-PACS-2FBR与His6-Bid或CK2-磷酸化His6-投标并约束他的6-使用抗Bid抗体通过Western blot检测Bid。(B类)用1.2μM STS或0.1μg/ml Fas Ab和5μg/ml环己酰亚胺处理或不处理对照HeLa细胞或表达PACS-2-ha的细胞2小时。从细胞裂解物中免疫沉淀PACS-2-ha，并使用抗Bid抗体通过Western blot检测共免疫沉淀Bid(C类)MCF-7:Bid-GFP细胞要么用PACS-2 siRNA转染48小时，要么单独感染Ad:trans（trans，表达tet反式激活因子），要么与Ad:PACS-2一起感染24小时，然后用Fas-Ab（1μg/ml）和环己酰亚胺（20μg/ml。对固定细胞进行Fas Ab介导的Bid-GFP向线粒体的募集计分。顶部：条形图标准化为对照组（寡病毒胺）。中间：荧光显微镜显示各种条件下的Bid-GFP和有丝分裂跟踪器（红色）染色。对含有150–450个细胞的大范围盖玻片的GFP-Bid移位到线粒体进行评分。底部：Fas Ab刺激PACS-2和Bid移位至线粒体。MCF-7:Bid-GFP经Fas-Ab处理2小时后进行免疫荧光显微镜检查。(D类)顶部：转染对照（scr.）或PACS-2 siRNAs的HeLa细胞经Fas Ab（1μg/ml）和环己酰亚胺（20μg/ml。

PACS-2通过凋亡诱导剂从ER/胞质溶胶向线粒体的显著再分配，以及对PACS-2促进细胞凋亡的需求(图4)PACS蛋白在将货物分子运输到细胞隔室中的既定作用，增加了凋亡诱导剂可能会引导PACS-2向线粒体招募一个或多个促凋亡因子的可能性。一个候选促凋亡因子是BH3-only Bcl-2家族成员Bid，它被运输到线粒体，其中caspase-8裂解产物tBid促进细胞色素的释放c（c）(总量等, 1999). 与许多PACS货物蛋白一样，Bid含有一个酸性簇并被蛋白激酶CK1和CK2磷酸化(德萨热等, 2001). 为了确定PACS-2是否与Bid、tBid或这两种蛋白质结合，我们进行了在体外结合分析。GST-PACS-2FBR，包含PACS-2货物结合区(图1A)，绑定到Bid，但不绑定到caspase-8-generated tBid，表示PACS-2绑定需要完整的Bid酸性区域(图6A，顶部）。接下来，我们确定Bid的磷酸化状态是否影响Bid与GST-PACS-2FBR结合的能力。我们发现PACS-2优先与非磷酸化Bid结合，这表明在细胞凋亡开始时，Bid的去磷酸化促进了Bid与PACS-2的结合(图6A，底部）。接下来，我们进行了联合免疫沉淀研究，以确定PACS-2是否与Bid相关体内发现用STS或Fas Ab处理细胞会增加PACS-2与Bid的关联(图6B). 因此，为了确定PACS-2是否将Bid募集到线粒体，用PACS-2 siRNA转染稳定表达Bid-GFP的MCF7细胞，或用表达PACS-2的腺病毒感染，然后用环己酰亚胺和Fas-Ab处理或不处理，以刺激Bid-GFP募集到线粒体(查等, 2000). 在对照细胞中，Fas Ab或thapsigargin显著增加了Bid-GFP和PACS-2向线粒体的募集(图6C和数据未显示）。然而，PACS-2的缺失阻止了Bid-GFP的募集，支持了PACS-2在Fas-Ab和thapsigargin刺激的Bid向线粒体的易位中的作用。为了支持siRNA研究，我们发现Fas-Ab-诱导的细胞中PACS-2过度表达刺激了Bid-GFP向线粒体的募集，增加了近两倍。相比之下，对照细胞中PACS-2的过度表达未能刺激Bid-GFP向线粒体移位(图6C)证明凋亡诱导剂控制PACS-2依赖性的Bid向线粒体的转运。

最后，我们进行了生化分馏研究，以确定Bid向线粒体的移位和tBid的形成是否需要PACS-2。在对照细胞中，Fas Ab刺激线粒体上全长Bid的移位和tBid的形成。然而，在PACS-2缺失细胞中，Fas Ab未能诱导线粒体上的Bid移位和tBid的形成。对总细胞提取物的分析表明，PACS-2缺失细胞中tBid的形成显著减少，这表明在Fas Ab处理的细胞中，结合Bid但不结合tBid而需要PACS-2来形成tBid(图6D). 总之，这些数据表明，为了响应凋亡信号，PACS-2向线粒体招募全长Bid，随后Bid被裂解形成tBid以刺激细胞色素c（c）释放、激活执行者半胱天冬酶，并使细胞死亡。

讨论

我们报道，PACS-2是一种多功能分选蛋白，控制内质网-线粒体轴以及该轴在细胞内稳态和凋亡中的作用。我们的结果表明，PACS-2是线粒体与内质网紧密结合所必需的：缺乏PACS-2会诱导BAP31的半胱氨酸蛋白酶依赖性裂解，产生促凋亡片段p20，导致线粒体断裂并与内质网膜解偶联。这种结构解偶联也会破坏MAM并诱导内质网应激，通过增加BiP和ER钙水平来补偿。此外，当细胞或内质网稳态受损或启动细胞死亡程序时，PACS-2被重新定向以将凋亡诱导蛋白Bid转移到线粒体上。这种PACS-2依赖性的全长Bid向线粒体的转运通过诱导tBid的形成和细胞色素的释放促进细胞死亡c（c）随后导致可释放的ER钙耗竭，caspase-3激活，caspase3底物裂解。

PACS-2对杆状线粒体与内质网并列的要求表明，PACS-2在内质网-线粒体通讯中起着重要作用，并影响与线粒体内稳态和线粒体间通讯相关的动态线粒体融合/裂变事件(绍鲍德考伊等, 2004). 我们确定PACS-2缺失细胞中的线粒体分裂需要BAP31的caspase生成的p20片段，该片段通过调节Drp1/Dlp1促进线粒体分裂(布雷肯里奇等, 2003)，一种线粒体定位的动力相关GTPase。因此，我们的研究结果表明，PACS-2耗竭通过促进线粒体分裂而不是通过抑制融合来诱导线粒体碎裂。我们的演示表明，PACS-2Admut无法绑定COPI(科特根等, 2005)或PACS-2或COPI的siRNA缺失（数据未显示），将碎片线粒体与内质网解偶联，表明PACS-2/COPI转运对维持内质网线粒体轴至关重要。我们的结果与酵母的研究一致，研究表明COPI的失活同样会将内质网从线粒体中解偶联(普林斯等, 2000).

我们用生化分析扩展了我们的形态学研究，以表明PACS-2介导MAM相关的FACL4水平，FACL4将脂肪酸转化为用于形成复杂脂质的脂肪酰基辅酶A酯(皮奇尼等, 1998)和PSS-1，其将磷脂酰胆碱的头部基团与丝氨酸交换(图2). MAM是与内质网相关的膜，除FACL4和PSS-1外，还含有多种磷脂和鞘糖脂合成酶，支持磷脂从内质网直接转移到线粒体(万斯，2003). 我们的工作确定PACS-2是第一个调节MAM形成的细胞贩运蛋白。然而，我们不知道在表达显性负性PACS-2的细胞中，MAM相关的FACL4和PSS-1水平的降低是否是由于FACL4与PSS-1的靶向错误所致，或者MAM本身是否由于内质网碎片线粒体的解耦而重新分布。有趣的是，我们发现，PACS-2缺失细胞中MAM标记物的丢失与小管化、外周内质网的显著延长有关(图2). PACS-2的干扰可能导致MAM重新分布到内质网，从而扩大内质网膜的比例，同时减少与线粒体相关的膜的数量。与这种可能性一致，显性负性Drp1的表达促进线粒体融合，以及ER膜数量的相应减少(皮特斯等, 1999). 或者，电子显微镜观察到PACS-2缺失细胞外周内质网的延伸小管化可能反映了PACS-2对内质网模型蛋白功能的需求(中岛等, 2004). 除了接触线粒体外，高分辨率3D电子断层扫描显示，内质网还与线粒体形成密切接触反式-高尔基体和内胚体室(沼泽等, 2001). PACS-2在细胞器间通讯中是否还有其他作用尚待测试，但这种扩大的作用可能解释了骨骼肌中PACS-2的高水平表达(图1)肌浆网与质膜相对。

除了介导内质网-线粒体轴外，我们还发现PACS-2在内质网稳态中起着重要作用，因为PACS-2的缺失会导致UPR(图3). UPR是对各种ER靶向应激源的综合反应，其通过磷酸化eIF-2α来协调对细胞蛋白合成的抑制，并诱导ER伴侣表达以促进分泌蛋白和膜蛋白的折叠(Rutkowski和Kaufman，2004年). 我们发现，PACS-2缺失导致磷酸化eIF-2α的短暂增加，之后在治疗后2天内，ER体内平衡以正常的蛋白质合成速率重建（数据未显示）。ER稳态的重建与BiP和ER钙水平的增加相一致(图3). 鉴于ER运输机械对ER体内平衡的重要性已得到充分证实(Belden和Barlowe，2001年)线粒体结构对内质网稳态的影响尚不清楚。因此，我们发现PACS-2缺失诱导的UPR可以通过表达caspase-resistant crBAP31来阻止，这表明这种UPR是p20介导的内质网断裂线粒体解偶联的直接结果(图4). 有几个因素可能有助于通过对置的线粒体控制内质网的稳态。例如，线粒体为内质网提供ATP以进行氧化蛋白折叠，而氧化蛋白折叠被缺氧应激阻断(库梅尼斯等, 2002). 此外，钙结合ER伴侣水平的增加需要ER钙的相应增加(科赫，1990年)与我们的发现一致，与对照细胞相比，PACS-2耗竭使组胺释放的内质网钙增加了约2倍(图3C).

PACS-2缺失细胞中较高的内质网钙释放在多大程度上是由于促进内质网伴侣活性，而不是不能有效地将钙转移到线粒体，这需要进一步研究，并可能为内质网-线粒体通信提供新的见解。例如，除转运脂质中间产物外，MAM还可能参与内质网和线粒体之间的钙转运。为了支持这种可能性，IP3Rs和ryanodine受体都具有潜在的PACS-2结合位点(科特根等, 2005)并且可能与MAM关联(哈诺茨基等, 2000). 因此，PACS-2的破坏可能导致IP3R定位错误，导致从内质网到线粒体的钙转移减少。最近的研究表明，线粒体的重新定位不足以影响内质网钙水平(瓦拉迪等, 2004)，但仍会干扰线粒体系统内的钙通讯(绍鲍德考伊等, 2004). 因此，在PACS-2缺失细胞中观察到的内质网钙增加不能仅用线粒体断裂来解释，而是通过内质网的变化来维持内质网内环境的稳定。

p20的异位表达足以使细胞凋亡(布雷肯里奇等, 2003). p20/Drp1介导的线粒体断裂启动了该细胞器的细胞色素c（c）通过促进Bax/Bak低聚物的招募释放(Karbowski和Youle，2003年). 因此，我们惊讶地发现，PACS-2缺失的细胞不仅可以存活，而且对凋亡有抵抗力(图4)尽管p20介导的线粒体断裂(图1). PACS-2耗竭导致的凋亡途径的阻滞使我们确定凋亡诱导物向PACS-2发出信号，向线粒体募集Bid(图6)这是诱导细胞死亡所必需的。此外，我们发现凋亡诱导剂不能耗尽PACS-2 siRNA处理细胞中的ER钙(图4)同意最近的研究表明细胞色素c（c）释放到胞浆中与IP3受体结合，诱导释放ER钙，以充分激活细胞死亡蛋白酶(博宁等, 2003). 总之，我们的研究结果表明，作为对内源性和外源性凋亡诱导剂的反应，ER/细胞溶质PACS-2与BAP31/p20协同协调细胞死亡程序。

我们证明凋亡诱导剂促进PACS-2结合全长Bid并将其转移到线粒体(图5和​和6）6)为ER–线粒体轴与细胞死亡程序的整合提供了新的见解。而全长Bid可与线粒体结合并诱导细胞色素释放c（c）caspase-8产生的裂解产物tBid与线粒体具有更高的亲和力，在细胞凋亡过程中，它在线粒体中积累，可以更有效地释放细胞色素c（c）(总量等, 1999). N-末端肉豆蔻酰化进一步增加tBid的凋亡活性，支持这种模型，即这种脂质的添加作为一种分子“开关”，在凋亡期间靶向线粒体的tBid(查等, 2000). 然而，我们的结果为凋亡诱导的Bid靶向线粒体提供了新的见解。我们发现，PACS-2缺失阻断了Bid-GFP向线粒体的凋亡易位，而PACS-2的过度表达增强了这一分选步骤(图6). PACS-2依赖性的Bid向线粒体的易位似乎发生在Bid的caspase裂解之前，因为PACS-2的缺失可以阻止Fas Ab诱导的tBid形成和线粒体上tBid的积累，但对细胞caspase-8的激活没有影响(图4和​和6）。6). 此外，我们发现PACS-2选择性地结合全长Bid而非tBid，并且凋亡诱导剂促进全长Bid与PACS-2的关联。这些发现表明，PACS-2首先将全长Bid靶向线粒体，随后Bid被细胞溶质或线粒体定位的caspase-8裂解为tBid(Micheau和Tschopp，2003年;钱德拉等, 2004). 我们确定CK2对Bid的磷酸化抑制与PACS-2的结合，这表明Bid磷酸化具有两种抗凋亡作用；防止与PACS-2结合，阻止向线粒体移位，并掩盖caspase-8裂解位点以产生tBid(德萨热等, 2001). 随着PACS-2的发现以及这种新型分选蛋白在控制内质网-线粒体轴和凋亡中的作用，我们提出了一种修正的Bid作用模型。在一条腿中，凋亡诱导物将PACS-2从维持ER–线粒体轴转向，从而促进BAP31/p20介导的从ER解偶联的线粒体断裂。断裂可能通过增强Bak/Bax募集来“启动”线粒体。在第二段中，全长Bid脱磷，从而使其能够结合PACS-2。PACS-2然后将全长去磷酸化的Bid靶向片段化的线粒体，其中Bid随后可被线粒体定位的胱天蛋白酶-8切割为tBid。然后，被切割的肉豆蔻酰化tBid可以与Bak/Bax结合，使线粒体渗透，释放细胞色素c（c）并使细胞死亡。PACS-2是否特异性地将Bid转位到线粒体，或参与含有潜在PACS-2结合位点（例如Bak、Bad、Bim和Bik）的其他促凋亡蛋白的转位，需要进一步研究。

在一篇附带的论文中，我们表明PACS-2是一个COPI连接子，控制多囊蛋白-2和可能包含PACS-2结合位点的许多其他内质网定位膜蛋白的内质网位置(科特根等, 2005). 我们在这里表明，PACS-2的作用超越了内质网运输，因为它控制内质网内稳态和内质网-线粒体轴。我们发现PACS-2Admut未能绑定COPI(科特根等, 2005)，破坏MAM和线粒体与内质网的并置(图2数据未显示），提示PACS-2必须结合COPI以维持ER和线粒体之间的动态通讯。此外，我们表明，为了响应凋亡诱导物，PACS-2需要将Bid转移到线粒体以控制细胞死亡。有趣的是，基因组分析表明PACS-2系列该基因位于染色体14q32:33的端粒附近，是一个在B细胞淋巴瘤和结直肠癌中容易发生染色体易位和杂合性丢失的位点。此外，根据我们的发现，PACS-2是一种促凋亡蛋白PACS-2系列该基因在多达40%的结直肠癌中发生突变（G安德森，个人通讯）。根据我们的研究结果，PACS-2的缺失可能会阻止细胞凋亡，并可能为随后导致细胞永生化和癌症的基因组损伤提供机会。

材料和方法

抗体和试剂

试剂来自Sigma，除非另有说明。PACS-1和PACS-2抗血清（Pocono Farms）、抗δ-adaptin（M Robinson）、BAP31（G Shore）、CI-MPR（S Pfeffer）、PDI（R Sitia）、细胞色素氧化酶I（分子探针）、α-微管蛋白（Calbiochem）、硫氧还蛋白（TRX；Invitrogen）、γ-adapten（Sigma）、β-COP（MaD，Abcam）、TGN46（Serotec）、BiP（BD Biosciences）、Myc（Santa Cruz）、HA（Covance）、，FLAG（柯达）、GFP（克隆）、Fas（贝克曼）、PARP、细胞色素c（c）（Apotech），他的6如图所示，提供了（Qiagen）、FACL4（Abgent）、PSS1（O Kuge）和Bid、前/激活的caspase-3和-8（细胞信号）、Alexa（546和488）结合的二级抗体（分子探针）和HRP-结合的二次抗体（Southern Biotech）。收到的细胞株和质粒如下所示：HeLa KB/crBAP31（G Shore）、MCF-7:GFP-Bid（S Korsmeyer）、pET15b-Bid（H Lu）和pFLAG-crBAP11（G Shore）。

cDNA克隆、表达载体、细胞系和病毒构建

用EST探针筛选lambda ZAPII-hMC人皮层文库（Stratagene），获得PACS-2 cDNA50031兰特使用pET32（Novagen）表达TRX-PACS-2 FBR（PACS-2残基37–179）。MCF7:Bid-GFP、HeLa和A7黑色素瘤按照描述进行培养(查等, 2000;Crump公司等, 2001). 腺病毒（Ad）重组体（tet-off）表达人PACS-2-ha（野生型和Admut（E89TDLALTF公司96→ 阿拉8)，阻止PACS-2与COPI的绑定(科特根等, 2005))按说明生成(布拉戈维申斯卡娅等, 2002). 腺病毒感染持续24小时。

RNA杂交

使用人类多组织印迹进行Northern杂交（Clontech，Palo Alto，CA）。使用PACS-1、PACS-2和1B15（加载控制，未显示）的cDNA生成随机定时32P探头。根据制造商的说明和荧光成像仪检测到的信号进行杂交。

免疫荧光、电子显微镜和FACS

如前所述进行常规免疫荧光显微镜检查(万等, 1998;Crump公司等, 2001). 共焦显微镜使用Olympus Fluo View FV300共焦激光扫描显微镜。对于TMRM负载，将转染siRNAs的A7细胞与100 nM TMRM（分子探针）孵育30分钟，然后对活细胞成像。按照说明进行电子显微镜检查(阿维德森等, 2003). 使用NIH图像v1.63量化电子显微照片中的线粒体排斥区。排除区定义为总细胞质面积减去含有>95%线粒体的细胞质面积。使用盲法，每个显微照片记录两组独立的数据(n个=每种情况7，P（P）<0.0001). 根据制造商的说明，使用FACSCalibur（Becton Dickinson）和Annexin V/PI凋亡染色试剂盒（癌基因/EMDbiosciences）进行FACS。

siRNA

使用寡病毒胺（Invitrogen）转染人类PACS-1（AACUCAGGUCUCAGAGUG和AAUUCUCCAACGAAGAU）、PACS-2（AACACGCCGUGCCAUGAAC和AAGAGGAAGGCAACAAGCUU）、CtBP（AAGGGACCUGGAGAGAAGUU）和非特异性干扰对照（Dharmacon）的特异性siRNA。转染后2-3天对细胞进行分析。

Bid易位、Bid与PACS-2的结合和Bid联合免疫沉淀

MCF-7:Bid-GFP表达细胞转染PACS-2或PACS-1 siRNAs 48小时，或感染Ad:PACS-2和Ad:PACS-1 24小时，用Fas-Ab和环己酰亚胺诱导细胞凋亡(查等, 2000). 对于Bid-binding分析，用300 U caspase-8（Calbiochem）在30°C的裂解缓冲液（50 mM HEPES、100 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、10%甘油、0.1%CHAPS、pH 7.4）中对重组Bid（30μg）进行裂解18 h，以生成相等的Bid和tBid混合物。该混合物在4°C下与3μg GST-PACS-2FBR或GST单独培养4 h，用谷胱甘肽-甘露糖捕获并用Western blot分析。对于Bid联合免疫沉淀，细胞被Ad:PACS-2感染，并用Fas-Ab（1μg/ml，Beckman）/环己酰亚胺（2μg/ml）或1.2μM STS处理2 h。用m-RIPA（1%NP40、1%脱氧胆碱酯酶、150 mM NaCl、50 mM Tris、pH 8.0和蛋白酶抑制剂）溶解细胞，用单克隆抗体HA.11免疫沉淀，并使用抗Bid抗体进行Western blot处理。

MAM分离、线粒体分离、细胞色素c释放和Bid易位

如前所述隔离MAM(斯通和万斯，2000年)除细胞用滚珠均质器破碎外（间隙18μm）。如前所述进行线粒体分离(片冈等, 2001). 对于细胞色素c（c）释放和Bid易位，A7或HeLa细胞用冷PBS洗涤，刮入300μl线粒体分馏缓冲液（250 mM蔗糖，10 mM Tris–HCl，pH 7.5，1 mM EGTA和蛋白酶抑制剂）中，12次通过27G针进行溶解。核后上清液沉淀在15000克分离线粒体和胞浆15分钟，然后用抗细胞色素c、抗-Bid、抗细胞色素蛋白免疫印迹c（c）氧化酶I（线粒体）或抗管蛋白（胞浆）。

Fura-2测量

用2μM Fura-2（分子探针）培养A7细胞45分钟，然后在正常培养基中再培养30分钟。然后将细胞胰蛋白酶化、洗涤并重新悬浮在1.5 ml Tyrode缓冲液（10 mM葡萄糖、1 mM MgCl）中2，1 mM氯化钙2pH 7.4），并使用Cary Eclipse荧光分光光度计在340和380 nm激发后在510 nm处监测发光。两种排放物之间的排放比与细胞溶质[Ca成正比2+].

致谢

我们感谢J Karpen、S Kaech、G Medigeshi、E Barklis、M Webb和J Larson对实验的帮助，感谢M Forte、J Larsen和G Scott对手稿的有益讨论和仔细阅读。我们感谢H Lu、O Kuge、G Shore、M Robinson、S Korsmeyer、E Chevet和R Sitia提供的试剂。我们得到了EMBO和瑞士国家基金（TS）、HFSP（ADB）、癌症防治协会（SFF）、Wellcome信托基金（CMC）的研究金支持，NIH资助AI49793、AI48585和DK37274（GT）。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团