结果
小鼠胶质瘤模型中存在肿瘤相关的BMDM
为了追踪小鼠胶质瘤髓系细胞的个体发育，我们使用了造血谱系追踪系统Flt3:Cre；Rosa26:mTmG，用于显示外周髓样细胞从Flt3发育而来+短期造血干细胞（ST-HSC）和GFP+，而实质MG独立于ST-HSC前体细胞发育，因此对GFP报告者为阴性，其余为TdTomato+(Boyer等人，2011年;Gomez Perdiguero等人，2015年). 在非肿瘤小鼠中，>98%的血单核细胞是GFP+mTmG报告者的MG重组率<1%(). 脾脏由GFP组成+富含淋巴细胞的滤泡，被TdTomato包围+基质细胞，而脑实质不含任何可检测到的GFP+单元格(图S1A).
谱系追踪系统显示多种神经胶质瘤模型中TAM个体发生的异质性（A）GEMM-shP53模型的实验方案，见补充实验程序了解详细信息。Cd45显示了TdTomato和GFP的代表性流式细胞仪面板+Cd11b号+赖氨酸6G−赖氨酸6C−小胶质细胞（MG），Cd45+镉11b+赖氨酸6G−赖氨酸6C+单核细胞和Cd45+Cd11b号+赖氨酸6G−赖氨酸6C−来自GEMM-shP53胶质瘤的TAM。（B）TdTomato的定量+和GFP+如（A）所示，外周血中的单核细胞（Mono）和粒细胞（Gran），非肿瘤性脑中的MG，GEMM-shP53胶质瘤中的单细胞、粒细胞和TAM。条形代表每组的平均值和s.e.m.n=3–5。（C）GEMM-shP53肿瘤中Iba1（白色）、GFP（绿色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光（IF）染色，如（a）所示。比例尺：50μm。代表性肿瘤5例。（D）Cx3cr1谱系追踪模型的实验设计，详见方法。如（A）所述分离单核细胞、MG和TAM，并评估TdTomato和YFP报告基因的表达。代表n=3只小鼠。（E）Td番茄的流式细胞术定量+和TdTomato−外周血中的单核细胞和粒细胞，非荷瘤脑中的MG，以及GL261胶质瘤中的单核细胞、粒细胞和TAM，如（D）所示。条形代表每组的平均值和s.e.m.n=3。（F）GL261肿瘤中Iba1（绿色）、TdTomato（红色）和DAPI（蓝色）的代表性IF染色。比例尺：50μm。（G）来自单核细胞（n=5）、正常MG（n=3）和来自不同模型的四个TAM群体的标准化RNA-seq计数的成对相关矩阵：GEMM-shP53 TAM MG、GEMM-sh P53 TAM-BMDM、GL261 TAM-MG和GL261 TAM-BMDM（每组n=3个）。（H）图中描述了TAM教育与普通MG相比的不同模块。（一）将正常MG和四个TAM群体之间的差异表达基因制成表格。Barchart描述了不同组之间共享的差异表达基因的数量，（J）Ki67的代表性IF染色+GEMM-shP53模型中的TAM BMDM和TAM MG，如（A）所示。Ki67（白色）、CD68（红色）、DAPI（蓝色）、GFP（绿色）（从顶部面板中省略）。比例尺：上面板100μm，下面板10μm。代表性肿瘤5例。
接下来，我们将该品系培育为nestin:Tva（nTva）品系，以追踪胶质瘤基因工程小鼠模型（GEMM）中髓细胞的个体发育。我们通过颅内注射DF1细胞诱导胶质瘤，DF1细胞转染了编码PDGFB和抗P53短发夹的RCAS载体(小泽等人，2014年) ()在本文中称为GEMM-shP53。终末期胶质瘤的流式细胞术显示，所有单核细胞（Cd45+Cd11b号+赖氨酸6C高的赖氨酸6G−)和粒细胞（Cd45+Cd11b号+赖氨酸6C低的赖氨酸6G高的)肿瘤中有GFP+()，而大容量TAM隔间（Cd45+Cd11b号+Ly6C-Ly6G−)由两种GFP组成+TAM BMDM和GFP−TAM MG公司(,图S1B)经组织免疫荧光（IF）与泛巨噬细胞标记物Iba1共同染色证实(). 相反，对侧非恶性脑仅含有GFP−MG，仅显示肿瘤块内TAM BMDM的特定丰度().
我们和其他人利用IR-BMT证明TAM-BMDM被招募到小鼠胶质瘤中(Huang等人，2014年;Pyonteck等人，2013年). 然而，IR可导致BMDM异位募集到大脑，从而增加其相对丰度(Muller等人，2015年). 我们在原位同基因GL261胶质瘤模型中验证了这些发现，并通过IR-BMT谱系追踪和IR-indendent Flt3:Cre谱系追踪发现TAM室由TAM-MG和TAM-BMDM组成(图S1C、D). 与Flt3:Cre模型相比，IR-BMT模型中的TAM BMDM丰度显著增加(图S1D)强化了之前的报告，即IR-BMT可能会扭曲MG和BMDM的比率。然而，至关重要的是，使用Flt3:Cre血统追踪，我们发现BMDM在胶质瘤中占TAM总量的35%以上，没有IR-修复，这表明BMDM浸润到肿瘤中不仅仅是IR的伪影(图S1D).
排除这一发现是由于TAM-MG的一个子集自发上调的可能性飞行高度3表达，我们使用了一种互补的谱系追踪方法，该方法先前表明对正常大脑中的MG具有特异性：Cx3cr1:CreER-IRES YFP；Rosa26:lsl-TdTomato（见详细补充实验程序) (Parkhurst等人，2013年). 在三苯氧胺诱导标记后3天，>99%的MG和循环单核细胞是TdTomato+(图S1E). 然而，3周后，血单核细胞不再保留TdTomato+报告者，表示他莫昔芬“幼稚”单核细胞的周转和补充(图S1E). 相比之下，>99%的MG仍然是TdTomato+(图S1E). 我们在7周龄时在这些小鼠中诱导GL261肿瘤，并观察到TdTomato和+TAM MG和TdTomato−TAM BMDM公司(). 同时，所有单核细胞和粒细胞都是TdTomato−在肿瘤和周围(). 这些发现通过组织切片与Iba1的IF共染色得到证实(). 重要的是，eYFP报告基因表达水平存在梯度，在TdTomato中表达最高+TAM MG，TdTomato中的含量略低−TAM BMDM，单核细胞最低水平(图S1F)，证明TAM BMDM的表达能力Cx3cr1型在脑肿瘤中。因此，Cx3cr1型仅表达不能用于严格鉴定胶质瘤中的MG。总之，这些互补的遗传谱系追踪模型表明，在缺乏IR的情况下，BMDM对几种胶质瘤小鼠模型中的TAM库有贡献。
RNA测序揭示了TAM教育的多模式
接下来，我们分析了胶质瘤中TAM-MG和TAM-BMDM的转录谱。我们分别使用基于Flt3和基于Cxc3cr1的谱系追踪系统对来自GEMM-shP53和GL261肿瘤的TAM-MG和TAM-BMDM的分类群体进行了RNA测序。我们还收集了MG和Ly6C高的来自非肿瘤性Flt3:Cre-Rosa26:mTmG小鼠的血单核细胞。全球相关性分析显示，正常MG和单核细胞中的所有TAM群体具有明显的聚集性，并具有进一步的细胞类型特异性和肿瘤特异性聚集性(). 正如预期的那样，单核细胞被富集用于赖氨酸6c2表达，而TAM MG和TAM BMDM都表达更高水平的巨噬细胞分化标志物（例如。Aif1、Mertk）与单核细胞相比(图S1G). 正常MG和TAM MG表达较高水平的MG富集基因(例如Cx3cr1型,第2页12,Tmem119公司)与单核细胞和TAM BMDM相比(图S1G).
接下来，我们描述了TAM中肿瘤教育的细胞类型特异性、肿瘤特异性和保守模式(). 我们从GEMM-shP53和GL261肿瘤与正常MG和单核细胞相比，鉴定了每个TAM群体之间的差异表达基因(,图S1H,表S1A). 以正常MG为参考，我们发现GEMM-shP53和GL261模型中的91个基因在TAM MG中特异上调(，红色条），以及来自GEMM-shP53和GL261模型的TAM BMDM中342个基因上调(，绿色条）。我们还从GEMM-shP53（n=102）或GL261（n=778）模型中鉴定了TAM MG和TAM BMDM中特异上调的基因。与正常MG相比，所有TAM人群中最大的基因集（n=1383）显著上调(，橙色条）。当单核细胞用作参考群体时，观察到类似的表达模式(图S1H，表S1B).
许多细胞周期相关基因上调，表明与正常MG和单核细胞相比，TAM增殖增加(表S1A、B). 确实，我们找到了Ki67+Iba1中的细胞+GFP公司+TAM BMDM和Iba1+GFP公司−基于Flt3的血统追踪模型中的TAM MG(). 补体相关因子、细胞外基质成分、蛋白酶、脂代谢介质和凝血因子的保守上调在两个TAM人群中也很明显(表S1A). 除了这些程序性改变外，与正常MG相比，生长因子上调(Igf1、Areg、Osm）、趋化因子和细胞因子(Spp1型,Ccl5、Cxcl9、Cxcl10）以及其他免疫调节剂，包括Cd274号/PD-L1和MHC I类分子(H2-K1型,H2-D1型,200万) (表S1A). 在比较两种胶质瘤模型和血单核细胞的TAM群体时，差异表达基因的分布相似(图S1H，表S1B). 有趣的是，我们发现了几个MG富集的基因（例如。Tmem119、Olfml3、Lag3、Jam2、Sparc) (Gautier等人，2012年)与单核细胞相比，GL261和GEMM-shP53模型中富含TAM-BMDM(表S1B). 尽管存在这种差异，但正常MG和TAM MG中MG相关基因的表达仍高于TAM BMDM。同时，其他富含MG的基因在TAM BMDM中没有表现出这种诱导作用(P2ry12，销售1,Mef2c公司). 总的来说，这些数据与Cx3cr1在胶质瘤中的上调一致(图S1F)以及巨噬细胞渗入异物后获得组织滞留基因表达的概念(Gosselin等人，2014年;Lavin等人，2014年).
TAM BMDM和TAM MG拥有独特的教育模式
我们研究了BMDM衍生的TAM与MG之间的转录差异，并在GEMM-shP53和GL261模型中鉴定出378个富含TAM MG的差异表达基因，以及485个富含TAM-BMDM的基因，与TAM-MG相比(,表S2). 正如预期的那样，在378个TAM MG基因中，我们发现与其他巨噬细胞群相比，先前显示MG中的标记物更丰富，包括P2ry12、Tmem119、Slc2a5、Pros1、和Sall1型() (Gautier等人，2012年). 我们发现，正常MG和TAM MG的组织特异性功能在果酱2和奥克兰(图S2A，表S2)，血脑屏障的组成部分(刘等，2012). 同样，TAM MG表达较高水平的经典补体因子C4b、C2、和Cfh（立方英尺）(图S2A)是MG在突触剪除和宿主防御中发挥重要作用的途径(Stephan等人，2012年).
TAM BMDM和TAM MG具有不同的基因表达模式（A）描绘GEMM-shP53胶质瘤（x轴）和GL261胶质瘤（y轴）中TAM-BMDM和TAM-MG之间−log10（p值）*符号（折叠变化）的散点图。BMDM显著上调的基因（log2倍变化>±1，FDR<1%）为绿色，MG为红色。（B）热图描绘了GL261 TAM BMDM（深绿色）、GEMM-shP53 TAM BMDM（浅绿色）、GL261 TAM MG（深红色）和GEMM-sh P53 TAM-MG（浅红色）中指示基因的行正常化log2基因表达值。（C）描绘这四个不同TAM群体中指示基因的标准化基因表达值的条形图。条形图表示平均值±s.e.m。（D）GEMM-shP53 Flt3:Cre Rosa26:mTmG胶质瘤和邻近正常大脑中Cd68（红色，AlexaFluor-594）、GFP（绿色）和MHC-II（白色）的典型IF染色。DAPI显示为蓝色，未显示TdTomato荧光。比例尺：100μm。代表性肿瘤5例。（E）文氏图描绘了GL261模型、GEMM-shP53和非恶性脑中BMDM与MG中显著上调的基因({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE68376”，“term_id”：“68376“}}GSE68376型数据集）。列出了选定的基因。（F）核心BMDM基因（图2E）和核心MG基因的箱线图(图S2D)其中，每个数据点表示使用来自免疫基因组项目的可用数据集在指定细胞群中的基因z评分表达。
同时，TAM BMDM表达高水平的替代补体级联成分Cfb公司和Cfp公司(图S2A)以及许多免疫效应物的富集，包括Cd40、Jak2、Ifitm1、Ifitm2、Tlr11、Tlr5、Tlr8、Mefv、和Fas公司(图S2A). 在GEMM-shP53模型中，IL-1通路配体的差异表达与伊尔1a富含TAM MG和伊尔1b在TAM BMDM中，以及在GL261模型中观察到的类似趋势(图S2B). While期间Il1r1号机组水平无显著差异，TAM BMDM表达较高水平的IL-1信号拮抗剂伊尔1rn和IL-1诱饵受体Il1r2号机组(图S2B). 这些结果补充了非癌症背景下的报告伊尔1a与BMDM相比，MG的富集，其中IL-1信号在MG的再生和维持中起着关键作用(Bruttger等人，2015年).
接下来，我们研究了与不同巨噬细胞激活状态相关的趋化因子、生长因子和免疫调节剂。除了模型特异性基因表达变化(图S2C，表S3)，我们发现在GEMM和GL261模型中，TAM BMDM富含参与伤口愈合的趋化因子，包括Ccl22、Ccl17、Cxcl2、Cxcl3、和Cxcl16号机组() (薛等，2014). 有趣的是，TAM MG富含第4类和天花，与促炎症反应相关的趋化因子(薛等，2014). 以MHC-II主调节器表达增加为中心的抗原提呈程序性增加支持了激活状态的差异西塔(Reith等人，2005年)，及其转录目标H2-Aa,H2-DMb1、H2-Eb1和抄送74在TAM BMDM中(). Flt3:Cre中的IF染色；GEMM-shP53肿瘤显示，与邻近大脑相比，肿瘤中MHC-II显著增加，仅限于GFP+TAM BMDM公司(). 除了这个抗原提呈程序，共刺激分子如80加元,镉40、和Cd200r4号机组增加了(图S2A). 芳香烃受体TAM BMDM富集表达进一步补充了这些发现(阿赫)，一种转录因子，以前被证明可以介导免疫抑制(Murray等人，2014年;Opitz等人，2011年) (图S2A). 至关重要的是，我们还发现免疫抑制细胞因子Il10号机组与TAM MG相比，TAM BMDM更丰富(). 总的来说，这些结果表明TAM BMDM参与慢性伤口愈合样状态，使人联想到交替激活的巨噬细胞(Mosser和Edwards，2008年). 在少突胶质细胞死亡模型中也显示出类似的表型，尽管MHC-II高表达，髓系细胞并没有激活强大的T细胞反应(Locatelli等人，2012年)，暗示耐受性程序。
接下来，我们询问炎症介质的差异是BMDM进入大脑后的固有特征，还是肿瘤教育的结果。先前的研究表明，当MG耗尽且大脑受到IR预处理时，BMDM可以为大脑植入种子，并对大脑巨噬细胞池做出显著贡献（以下称为正常“重新填充的大脑”中的“异位BMDM”）(Bruttger等人，2015年). 我们使用该数据集与我们的TAM BMDM和TAM MG RNA-seq数据进行比较分析，以区分肿瘤教育差异与个体遗传、非肿瘤相关差异。这种并列使我们能够识别富含TAM MG与TAM BMDM以及正常MG与“异位BMDM”的基因。这些“核心MG”基因包括已知的MG标记，如Jam2，Siglech公司和第2页12，但也有补充因素C2、C4b、和Cfh（立方英尺）以及促炎细胞因子第4类和天花(图S2D，n=245个基因，表S4). 我们确定了肿瘤背景下TAM-BMDM（n=294）富集的基因，包括Il10、Cxcl2、Cxcl3、Ccl17、Ccl22、和H2-Dmb1型(). 与此肿瘤特异性表达谱相反，与MG相比，BMDM中还富集了164个“核心BMDM”基因，无论是否存在肿瘤，包括Ciita、Ahr、Runx2、Runx3、Vav3和Vdr公司(,表S4). 这些数据表明，TAM BMDM和TAM MG的一些区别特征是其不同的个体发育所固有的，而其他特征只有在与肿瘤微环境相互作用并受其教育后才能获得。
由于许多“核心BMDM”基因在先天免疫中起着核心作用，我们查询了免疫基因组项目数据库，以确定这些基因是否在任何特定的髓细胞群体中过度表达。有趣的是，我们发现，与骨髓、脾、肺、腹膜、小肠和单核细胞祖细胞的组织-巨噬细胞相比，这些基因实际上在MG中受到抑制(). 同时，与其他髓系细胞相比，MG中的“核心MG”基因确实富集(). 这些数据表明，“核心BMDM”基因既没有在TAM BMDM中特异性富集，也没有在一般巨噬细胞中特异性浓缩，而是在MG中特异性抑制。
最近的研究强调了组织-巨噬细胞之间广泛的表观遗传多样性(Lavin等人，2014年); 因此，我们假设MG中的MG重表达基因可能与远相关的单核细胞相比发生表观遗传学改变。事实上，当我们分析这些已发表的数据集时，我们观察到与正常MG相比，正常单核细胞启动子中“核心BMDM”基因的H3K27乙酰化增加(图S2E). 同样，与单核细胞相比，MG中“核心MG”基因启动子的H3K27乙酰化增加(图S2E). MG和其他巨噬细胞种群中的增强子规范和表观遗传状态与PU.1的不同占有率有关。查询以前发布的数据(Gosselin等人，2014年)我们观察到，与正常MG相比，一些巨噬细胞亚群（包括BMDM）在我们的“核心BMDM”基因启动子处的PU.1结合都增加(图S2F). 同时，在“核心MG”基因的启动子处，PU.1占用率的变异性最小(图S2F). 类似的结合动力学在增强子元件中也很明显，其中“核心BMDM”基因增强子区的PU.1占有率在BMDM中高于MG，而“核心MG”基因中的差异不那么明显(图S2G). 因此，在肿瘤发生之前建立的表观遗传景观可能在调节随后在恶性肿瘤中观察到的不同激活模式中发挥作用。
TAM激活下转录因子网络的鉴定
考虑到非恶性环境中的表观遗传学差异，我们接下来确定TAM BMDM和TAM MG之间的染色质状态是否也不同(Buenrostro等人，2013年)评估从GL261模型中分类的TAM BMDM和TAM MG的染色质可及性(). 我们发现ATAC-seq信号与细胞类型特异性基因表达相关。在TAM BMDMs中，核心BMDM和TAM BMDM基因的启动子比核心MG和TAM MG基因具有更高的ATAC-seq信号，而核心MG基因和TAM MG基因的TAM MG-启动子比中心BMDM和塔姆BMDM基因具有更大的ATAC-sq信号(图S3A). 在这些基因集的增强子和内含子元件中，我们在TAM BMDM基因中确定了120个BMDM特异性峰，包括Vav3（阀门3）和TAM MG基因中704个MG特异性峰值，包括第2页12和销售1(,图S3B、C、表S5A).
细胞特异性转录因子活性是TAM BMDM和TAM MG之间差异的基础（A）热图描绘了特异性富集于GL261 TAM BMDM（左图）和GL261 TAM MG（右图）的峰的上游和下游1kb的ATAC-seq信号。根据TAM BMDM（顶部，绿色）和TAM MG（底部，红色）之间差异表达基因的关联选择峰值。（B）HOMER鉴定的基序在TAM BMDM和TAM MG峰中富集，如（A）所示。（C）方框图描绘了GL261和GEMM-shP53胶质瘤中TAM-BMDM和TAM-MG的指定基序的标准化TF活性分数。（D）热图描绘了四个不同TAM群体中指示基因的行正常化log2基因表达值。（电子版）TAM BMDM（顶部，绿色）和GL261胶质瘤TAM MG（底部，红色）的ATAC序列追踪（E）运行3和（F）Hdac11型。阴影灰色区域表示文本中特别引用的峰值。Y轴值表示每10000000个标签，范围为0–50。TSS表示转录起始位点。
我们分析了这些不同峰值下的转录因子（TF）景观，并执行从头开始基序分析（基序用所有大写字母表示）。对这些峰的Motif分析表明，TAM-BMDM和TAM-MG峰中FOS/JUN和PU.1结合位点均富集(,表S5B)，加强了先前的分析，证明PU.1在组织-巨噬细胞中建立特定增强子景观中的关键作用(Gosselin等人，2014年). 除了这些共同的富集外，我们发现TAM BMDM峰富集RUNX和CREB/bZIP基序，而TAM MG峰富集SMAD3和MEF2A基序().
为了确定这些基序是否反映了特定TF的通路激活，我们对其预测下游靶点的表达进行了建模（参见补充实验程序). 在GEMM-shP53和GL261模型中，我们确定了在TAM-BMDM中相对于TAM-MG具有富集活性的TF家族（反之亦然）(,图S3D). 在一组不同TF中，EGR1和MEF2A在TAM MG中富集(,图S3D，表S5C). 有趣的是，MEF2与MG身份相关(Lavin等人，2014年). 在TAM BMDM中，参与单核细胞向巨噬细胞分化的TF基序丰富，包括RUNX、CEBP和PU。1(,图S3D) (Alder等人，2008年). STAT3和IRF4也被富集()两者都与巨噬细胞激活的不同功能有关(Mosser和Edwards，2008年;奥斯图尼和纳托利，2011年). 我们利用HOMER对TAM BMDM特异性和TAM MG特异性基因的启动子进行模体富集分析，以补充这些全基因组TF活性分析(Heinz等人，2010年) (图S3E). 这也揭示了TAM MG中MEF2基序的丰富性，证明了组织特异性转录程序在TAM-MG教育中的一致作用。同时，TAM BMDM特异基因再次在PU.1、RUNX和CEBP基序中富集(图S3E). 脑特异性TFs表达增加进一步证实了这些发现(Mef2c、Sall1、Sall3）在TAM MG中，而TAM BMDM在Ciita、Vdr、Ahr、和掀背家庭成员(,表S2A).
鉴于在TAM BMDM中RUNX活性的持续增加，我们接下来重点检查掀背家庭成员。运行2和运行3与TAM MG相比，TAM BMDM富含(). 虽然在运行x1或运行2，在的第一个介绍中运行x3()我们观察到TAM MG出现峰值，但TAM BMDM降低(). 与此同时运行3启动子在TAM-MG中几乎没有开放的染色质，在TAM-BMDM转录起始位点附近有一个明显的峰值(). 有趣的是，这两个峰都是TGFβ反应性PU.1结合位点，与运行3表达式(肖邦等人，2013年)表明相同的信号转导途径可以在TAM-BMDM和TAM-MG中产生不同的输出。
我们还发现表观遗传修饰物的富集Hdac7型和Hdac9型在TAM BMDM中，而Hdac11型富含TAM MG(图S3F)后者被证明具有抑制作用伊尔10巨噬细胞中的表达(Villagra等人，2009年). 有趣的是，上游增强子元素Hdac11型与TAM BMDM相比，TAM MG显著富集，该峰含有SMAD响应元件(). 总之，这些结果表明，差异基因组PU.1占有率是BMDM和MG中不同开放染色质状态的基础，因此，TGFβ/SMAD信号和RUNX家族成员等其他因素与PU.1合作，以加强不同的转录网络。TF和染色质修饰因子的后续调节，如Hdac11型，可以解释观察到的不同细胞因子表达模式，如TAM BMDM表达Il10号机组和TAM MG表达变压器。
伊特加4/Cd49d在小鼠脑恶性肿瘤模型中区分小胶质细胞和外周源性巨噬细胞
接下来，我们试图确定能够区分人类疾病中TAM-BMDM和TAM-MG的工具，因为在人类疾病中，遗传谱系追踪是不可能的。考虑到胶质瘤中TAM BMDM上调Cx3cr1型(图S1F)作为一种拟议的MG标记物，我们试图识别TAM BMDM特异性标记，而这些标记在TAM MG中保持沉默。从164个“核心BMDM”基因中，我们确定了40个候选跨膜蛋白，它们可能是流式细胞术的有用标记物。其中，整合素亚基α4，伊特加4/Cd49d作为一种有前途的候选者出现，特别是考虑到之前的报道，即它与整合素亚基αL一起，伊特格尔/Cd11a受RUNX家族成员监管，包括运行x1和运行3(Dominguez-Soto等人，2005年). 我们始终发现伊特加4和伊特格尔与其他巨噬细胞群相比，MG中被特异性抑制(图S4A). 流式细胞术证实了这一点，与脾、肝、肺、骨髓和血液Ly6C的巨噬细胞相比，MG中Cd49d的表达微不足道或缺失+单核细胞(). 赖氨酸6G+粒细胞也为Cd49d−，与Cd49d一起+CD45中的淋巴细胞+Cd11b号−闸门，在随后的实验中用作有用的闸门控制().
伊特加4/Cd49d在小鼠脑恶性肿瘤中区分TAM-BMDM和TAM-MG（A）非肿瘤小鼠指定群体的Cd49d表达直方图。（B）流式细胞术检测正常血液单核细胞、正常MG（来自邻近的正常大脑）或从患有GEMM-shP53肿瘤的Flt3:Cre Rosa26:mTmG小鼠中分离的TAMs中的Cd45和Cd49d（顶部）或Cd11a（底部）。相邻直方图显示GFP在指定人群中的表达。（C）Cx3cr1系追踪小鼠99LN-BrM模型的实验示意图。（D）TdTomato（红色）、Iba1（白色）和DAPI（蓝色）99LN-BrM肿瘤的代表性IF染色，如（C）所示。比例尺：50μm。（E）99LN-BrM模型的流式细胞术如（B）所示，TdTomato表达在相邻直方图中。流量图代表n=5-8只小鼠。
我们在GEMM-shP53模型中使用基于Flt3:Cre的谱系追踪检测了TAM BMDM和TAM MG中Cd49d和Cd11a的表达。在Cd45上选通后+Cd11b号+赖氨酸6C−赖氨酸6G−正常大脑中只含有Cd45低的Cd49天−细胞，所有外周单核细胞为Cd45高的Cd49天+(). 在肿瘤中我们发现了两个细胞群；45加元低的镉49d−和Cd45高的Cd49天+，其中包含GFP−Td番茄+MG和GFP+Td番茄−BMDM分别(). Cd11a也有类似结果()使用基于Cx3cr1和Flt3:Cre血统追踪策略在GL261模型中复制、和(图S4B、C). 最后，我们评估了Pten功能丧失-PDGFB驱动的胶质瘤模型（GEMM）中Cd49d的表达-Pten公司飞行高度层°x个)其中Pten公司飞行高度层°x/Fl（x/Fl）°x个; nTva公司+向小鼠注射编码PDGFB和Cre的RCAS载体(Huse等人，2009年). 使用IR-BMT进行谱系追踪，我们发现Cd49d可以区分供体细胞和宿主来源细胞，包括潜伏期延长的胶质瘤模型（GEMM为~12周-Pten公司飞行高度层°x个型号）(图S4D).
为了评估其他脑恶性肿瘤模型，我们使用了使用肿瘤细胞系（99LN-BrM）的脑转移（BrM）定植心内注射模型。99LN-BrM细胞最初来源于MMTV:PyMT乳腺癌GEMM的淋巴结体内选择。我们使用这种同基因、免疫活性的BrM模型，结合基于Cx3cr1的谱系追踪，发现BrM病变中同时含有TdTomato+伊巴1+和TdTomato−伊巴1+分别表示TAM MG和TAM BMDM招募的细胞(). 我们通过流式细胞术验证了这些发现，其中Cd49d和Cd11a是上述胶质瘤模型中BMDM的可靠标记物(). 我们再次发现eYFP水平，直接读出Cx3cr1型TAM BMDM和TAM MG在BrM中的表达相似，这进一步说明了Cx3cr1:CreER血统追踪方法的必要性，而不是Cx3cr1报告者的必要性(图S4E). 最后，我们使用脑归巢MDA-MB-231细胞在一个成熟的异种移植BrM模型中证实了这些数据(Bos等人，2009年)，结合使用mRFP的IR-BMT沿袭跟踪+供体细胞。在这个模型中，我们确定了两个细胞群；45加元低的Cd49天−MG和Cd45高的镉49d+BMDM公司。mRFP+供体细胞仅在Cd45内发现高的Cd49天+BMDM闸门(图S4F).
总之，我们通过不同谱系追踪方法在多种脑恶性肿瘤模型中获得的结果表明，TAM BMDM的积累与通过IR或颅内注射的BBB预处理无关。这些数据还彻底确立了Cd49d是一种有效的标记物，可用于区分体内稳态以及原发性和转移性脑恶性肿瘤中的常驻MG和外周源性巨噬细胞。
CD49D识别人脑恶性肿瘤中的小胶质细胞和巨噬细胞
接下来，我们研究CD49D是否可以用于区分人脑肿瘤中MG和外周源性巨噬细胞。我们通过流式细胞术评估了一组手术样本中CD49D的表达，这些手术样本包括非恶性正常大脑（n=3）、未经治疗的高级胶质瘤（GBM）（n=3）、肺腺癌（n=6）和外周血单个核细胞（PBMC）（n=6）。与我们在小鼠中的数据一致，粒细胞（CD45+川11B+CD66B型+CD14号机组低的CD16型+)不表达CD49D，用作CD49D门控的参考指南+和CD49D−TAM公司(图S5A). 重要的是，我们从未发现CD49D−原发性肺肿瘤中的TAM，或CD49D−健康供体PBMC中的单核细胞，表明正如预测的那样，CD49D的低表达仅限于MG，而不是组织-巨噬细胞的一般表型(). 相比之下，CD45+CD11B型+CD66B型−CD14号机组+CD16型−非恶性脑内的隔室主要由CD49D组成−MG公司(). 至关重要的是，在每个GBM样本中，我们都鉴定出CD49D+和CD49D−TAM，可能分别代表BMDM和脑定位MG().
CD49D在人脑恶性肿瘤中鉴别TAM-BMDM和TAM-MG（A）经典单核细胞、MG和TAM被定义为CD45+川11B+CD66B型−CD14号机组+CD16型−然后，在来自外周血（n=6）、来自肺腺癌患者（n=5）、来自非恶性脑（n=3）和来自GBM患者的TAM的代表性样本中显示CD14和CD49D的门控细胞。（B）人（左）和鼠（右）样本中CD45表达的流式细胞术直方图。在人类GBM中，粒细胞（CD45）表达CD45+CD11B型+CD66B型+CD16型+CD14号机组低的)、淋巴细胞（CD45+川11B−)、TAM MG（CD45+川11B+CD66B型−CD16型−CD14号机组+CD49D型−)和TAM BMDM（CD45+川11B+CD66B型−CD16型−CD14号机组+CD49D型+). 在小鼠中，粒细胞（Cd45）表达Cd45+Cd11b号+赖氨酸6C低的赖氨酸6G+)、淋巴细胞（Cd45+Cd11b号−)，TAM MG（Cd45+镉11b+赖氨酸6C−赖氨酸6G−番茄+GFP公司−)和TAM BMDM（Cd45+Cd11b号+赖氨酸6C−赖氨酸6G−番茄−GFP公司+)来自Flt3:Cre Rosa26:mTmG GEMM-shP53胶质瘤。代表3名患者和5只小鼠。（C）TAM BMDM基因的Z评分单样本基因集富集分析得分（左，配对t检验，第页≤5.01×10−3)和TAM MG基因（右，配对t检验，第页≤7.78×10−3)在匹配的CD49D中−和CD49D+GBM患者的TAM。虚线表示匹配样本（n=3名患者）。（D）TAM BMDM特征分数散点图（x轴，左，Spearman rho=0.564，第页≤2.2×10−16)和TAM MG签名分数（x轴，右，Spearman rho=0.067，第页≤0.411）和ITGA4公司TCGA-GBM RNA-seq数据的表达（y轴）。蓝色实线表示最佳拟合线，阴影区域表示标准偏差置信区间。（电子版）（E）GBM亚型的Z评分TAM BMDM特征分数（方差分析第页≤2.2×10−16)、和（F）印尼盾1突变状态（学生t检验第页≤5.93×10−3).
有趣的是，在人类样本中，我们发现CD49D与CD45的表达没有差异−和CD49D+TAM公司()，这是一个以前被认为有助于区分脑恶性肿瘤中BMDM和MG的标志物(Hussain等人，2006年;Parney等人，2009年;Sedgwick等人，1991年). 事实上，粒细胞和TAM与MG和BMDM相比，CD45的表达差异最大(). 然而，小鼠中CD45缺乏差异表达的情况并非如此，在小鼠中，CD45可以充分区分受试模型中的MG和BMDM(). 接下来我们对配对CD49D进行排序−和CD49D+GBM患者的TAM用于验证这些人群确实分别反映了TAM MG和TAM BMDM。使用我们小鼠模型中TAM MG和TAM BMDM的特异基因()，我们发现CD49D−TAM确实富含TAM MG基因(第页≤7.78×10−3)，而CD49D+TAM富含TAM BMDM基因(第页≤5.01×10−3) ().
以往对人脑胶质瘤中TAM表达的分析使用了大量CD11B+细胞，一个可能由TAM-BMDM和TAM-MG组成的群体，以及其他髓细胞群体。我们从散装CD11B中查询了一个可用的RNA-seq数据集+单元格(Szulzewsky等人，2016年)，显示增加ITGA4公司/纯化CD11B中CD49D的表达+GBM中的细胞与正常MG的比较来自尸检样本或癫痫患者的切除(图S5B). MG富集的转录本相对减少补充了这一点2012年第2季度GBM与非恶性大脑的比较(图S5B). 查询纯化CD11B的其他基于微阵列的数据集时+单元格(Gabrusiewicz等人，2016年)，我们观察到外周血CD11B+GBM患者的细胞表达类似水平的ITGA4公司与GBM肿瘤样本相比2012年第2季度GBM样本与外周血的表达比较(图S5C)正如我们预期的那样。我们将这些分析扩展到TCGA-GBM队列的全组织RNA-seq数据(Brennan等人，2013年)，并观察到ITGA4公司与正常大脑相比，GBM的表达显著增加(图S5D). 总的来说，这些分析表明GBM中的TAM代表由BMDM和MG组成的异质人群，加强了精确区分这些细胞的精细分类策略的必要性，并强调了基于CD49D的门控方法的实用性。
接下来，我们评估了TCGA队列中TAM-BMDM和TAM-MG基因集的整体表达。TAM BMDM基因和TAM MG基因表现出较高的基因内集相关性，其中TAM BMDM基因如RUNX2、IL10、RUNX3、ITGA4和视频数据记录器显示出显著的成对相关性，TAM MG基因如MEF2C，P2RY12基因,RXRG、SALL1、KLF12、和销售人员3同样显示出显著的两两相关性(图S5E). 此外，ITGA4公司显示与TAM BMDM基因特征评分高度相关(第页≤2.2×10−16)，但没有TAM MG签名分数()，显示增加ITGA4公司这种表达是TAM BMDM丰度所特有的，而不是TAM作为一个整体。
先前的转录和表观遗传学分析已经确定了不同的GBM亚型(努什梅尔等人，2010年;Verhaak等人，2010年)间充质亚型富含肿瘤基质和炎症分子。在这里，我们发现在GBM的分子亚型之间，TAM BMDM特征分数存在显著差异(第页≤2.2×10−16)间充质GBM亚型得分最高，G-CIMP患者得分最低(). 相应地，TAM BMDM特征分数在以下患者中最低印尼盾1突变(,第页≤5.93×10−3). 相比之下，TAM MG特征性评分显示与肿瘤亚型的关联性减弱(第页≤0.041）且与印尼盾1突变状态(第页≤0.153) (图S5F，G). 这些分析加强了我们的发现，TAM BMDM是一种与TAM MG不同的免疫细胞群，在人类GBM的特定亚型中具有明显的丰度和特征。
讨论
IR-BMT在动物模型中被广泛用于对脑恶性肿瘤中的TAM进行谱系追踪(Ajami等人，2007年;De Palma等人，2005年;Huang等人，2014年;Mildner等人，2007年;Muller等人，2015年)尽管担心由于红外对BBB中断的影响而产生的潜在伪影。尽管对BBB渗透性的类似影响不容忽视，但已经提出了替代的化学BMT方法(Alder等人，2008年;Kierdorf等人，2013年b). 在这里，我们证实了IR-BMT导致GL261神经胶质瘤模型中TAM-BMDM含量增加，这一发现最近通过将IR-BMT与头部屏蔽和不与头部屏蔽并置来报道(Muller等人，2015年). 虽然IR-BMT可能会混淆血统追踪研究，但肿瘤发生前的IR预处理是否会显著改变肿瘤发展过程中的TAM活性，或者肿瘤的炎症环境是否会取代IR-BMT方案的任何前期影响，仍有待观察。
除IR-BMT外，最广泛用于区分MG和外周源性巨噬细胞的方法依赖于Cd45表达，Cd45高的细胞被认为是BMDM和Cd45低的被视为MG的细胞(Gabrusiewicz等人，2011年;Sedgwick等人，1991年). 虽然这种标记物在我们使用的小鼠模型中似乎足够，但小鼠和人类的细胞类型特异性CD45表达似乎不同。我们的数据表明，CD45不能准确区分患者样本中的MG和BMDM，强调需要广泛的流式细胞仪面板来明确区分这两种细胞。此外，我们的遗传谱系追踪模型也表明Cx3cr1型通常用于追踪正常MG，在肿瘤教育后BMDM中上调(,图S1F、图S4E)因此不能用于区分脑肿瘤中的MG和BMDM。
相反，我们提出伊特加4（Cd49d）是一种有效、一致的标记物，在小鼠和人类中都能区分多种脑恶性肿瘤中的MG和外周源性巨噬细胞。Cd49d也可能被证明是一种有用的工具，用于确定脑肿瘤中外周源巨噬细胞的精确起源和动力学。最近为了解脑中非实质性髓细胞（包括血管周围、脑膜和脉络丛巨噬细胞）的异质性和起源所做的努力表明，这些细胞的一个子集使用类似于本文所用的基于Flt3-Cre和Cx3cr1-CreER的谱系追踪系统进行标记(Goldmann等人，2016年). 因此，确定除单核细胞外，这些人群中是否有任何一个对TAM池有贡献是很有意义的。
我们的数据支持表观遗传状态影响刺激依赖性转录诱导的假设，从而导致MG和BMDM之间的TAM教育差异。非癌症环境中MG和其他巨噬细胞群体PU.1的差异基因组占有率表明决定了差异增强子选择(Gosselin等人，2014年). 事实上，在这个数据集中，我们发现MG和BMDM的增强子和启动子的PU.1结合位点已经不同，因为我们确定的基因对它们各自的TAM群体是特异的。这表明TAM BMDM和TAM MG在初始增强子选择的基础上准备参与不同的转录网络。结合伙伴的差异表达可能影响PU.1基因组的占位。PU.1和CEBPβ之间存在明显的协同结合，以促进巨噬细胞分化，在B细胞发育过程中，PU.1占用率受E2A表达的影响(Heinz等人，2010年). 这种假设也被证明可以解释MG特异性PU.1结合与TGFβ诱导的SMAD活性的协同作用(Gosselin等人，2014年). 类似的动力学也可能在脑肿瘤中发挥作用，MG中缺失并在BMDM中表达的结合伙伴可以塑造基因组PU.1占据。例如，RUNX家族成员运行3是一个这样的候选者，它在TAM-BMDM和TAM-MG中富集，并且在PU.1与BMDM结合的启动子中显示出基序富集，而不是MG。
虽然我们在这里的研究主要集中于在多个小鼠模型和患者样本中识别识别TAM MG和TAM BMDM的重复特征，但在TAM教育中也存在肿瘤特异性基因表达模式(,图S2C、D)，这可能为肿瘤衍生信号如何在TAM激活谱中产生肿瘤间异质性提供了见解。此外，对TCGA数据的分析表明，与TAM-BMDM相关的基因特征在GBM的不同肿瘤亚型中有不同的富集。最近的报告已经在神经胶质瘤患者的大量TAM人群中发现了混合激活状态(Gabrusiewicz等人，2016年;Szulzewsky等人，2016年)现在，我们的数据显示，TAM-MG和TAM-BMDM具有不同的激活状态，有可能解决这种混合表型。重要的是，将CD49D作为细胞表面标记物来区分人类疾病中的TAM MG和TAM BMDM，将允许对患者样本中的这些细胞群进行广泛的询问。
总的来说，本文的研究明确表明，外周来源的巨噬细胞确实存在于多种小鼠和人类大脑恶性肿瘤中，并且与驻留在大脑中的巨噬细胞具有不同的转录谱。我们假设巨噬细胞在进入组织时可以获得组织-巨噬细胞样特征(Lavin等人，2014年)炎症微环境，例如在癌症或神经炎症的情况下，可能会进一步放大细胞之间的差异，从而导致组织-受体和外周源性巨噬细胞群的不同功能结果。
