研究结果表明，p53蛋白是一种关键的肿瘤抑制因子第53页在超过一半的人类肿瘤中发生突变第53页-空白小鼠发生完全外显的癌症。1,2,三,4p53是一种转录因子，当它被激活以响应各种细胞应激信号时，会诱导许多对其细胞功能重要的下游靶点的表达，包括细胞周期停滞和凋亡，这是限制细胞增殖的机制。5尽管第53页敲除小鼠直到成年后死于肿瘤才死亡，这突出了p53在肿瘤抑制中的主要作用，2,三,4更仔细地检查第53页-空白胚胎表明一个子集显示发育表型。6,7总的来说，8–16%的第53页-根据遗传背景的不同，无效胚胎会在围产期死亡，并伴有大脑前神经管闭合缺陷，这是一种主要在女性中观察到的表型。6,7
第53页-空胚还表现出其他结构（如眼睛和牙齿）的部分渗透性缺陷。7,8,9与大多数抑癌基因相比，这种与肿瘤抑制相关的相对较小的发育作用，其在小鼠中的敲除通常会引起完全渗透性胚胎致死。10
在发现p53后，两个相关的转录因子p63和p73被鉴定出来。11这三种蛋白质在其序列特异性DNA结合域（约63%）、寡聚域（约37%）和反式激活域（约22%）上表现出显著的序列相似性，并且可以结合到DNA中相同的共识位点并激活相同的靶基因。11然而，与p53不同的是，p63和p73在癌症抑制中起着至关重要的作用，它们在发育中起着更为重要的作用。第63页-杂合子缺失导致围产期死亡，并伴有复层上皮和肢体发育失败，以及颅面和骨骼缺陷。12,13
第73页-杂合子缺失会导致出生后数周内死亡，同时还会出现许多表型，包括体型缩小、海马发育不良、脑积水、慢性感染和炎症，以及阻碍繁殖的信息素感应缺陷。14至少其中一些表型可归因于多毛发育缺陷。15,16
鉴于与p53相似，p63和p73在肿瘤抑制中的作用也已被研究。虽然在人类癌症中不常见突变，第63页-或第73页-与野生型小鼠相比，具有某些遗传背景的杂合小鼠对某些肿瘤类型的易感性略有增加，这通常与杂合性丢失（LOH）有关，17和Eμ-Myc公司小鼠杂合或为空第73页淋巴瘤扩散率高于对照组小鼠。18此外，复合突变小鼠杂合子为第53页,第63页，和第73页与单个杂合子相比，基因座显示出降低肿瘤潜伏期、增加肿瘤负担和提高转移率。17,19最后，p73缺失增强了第53页-使鼠标无效。19这些发现表明，家族成员在癌症抑制中发挥着多余的作用。
尽管有证据表明p53家族成员在抑制癌症方面存在冗余，但尚不清楚在胚胎发育期间，家族成员之间相互补偿的程度。在单家族成员敲除小鼠中观察到的致死性通常发生在出生后，可能是由于家族成员之间的冗余或补偿，在发育过程中这些敲除小鼠没有更显著的表型。在表达模式方面，第53页mRNA在小鼠早期发育过程中普遍表达，但在发育后期的分化器官中表现出更为有限的模式。20p63蛋白表达于各种分层上皮的基底层，如表皮、食道、膀胱和乳腺，12,13,21而p73 RNA/蛋白主要在神经系统中表达，在睾丸生殖细胞和特定上皮（如表皮）中也有表达。14,22,23,24因此，这些表达模式表明，家族成员可能发挥冗余功能的最有可能的组织是上皮，如表皮。在这里，我们通过交叉先前产生的p53家族成员来解决胚胎发生过程中的冗余p53，p63，和第73页杂合突变小鼠并分析在整个发育过程中不同时间点产生的复合突变小鼠。6,13,14正如之前的研究已经报道的那样第53页−/−；第73页−/−复合雄性小鼠出生时的孟德尔比率，复合突变雌性小鼠显示出由于p53缺失导致的缺陷导致的新生儿死亡率，即无脑，19,25我们初步分析了第53页−/−；第63页−/−、和第63页−/−；第73页−/−老鼠。6,13,14
来自的复合零子代分析第53页+/负极；第63页+/负极交叉试验显示，断奶时没有存活的小鼠，这与第63页−/−由于表皮分层缺陷导致脱水，胚胎表现出围产期死亡。12,13然而，我们观察到了接近预期的孟德尔活菌数第53页−/−；第63页−/−E10.5和E16.5-E19.5的胚胎，基于心跳的存在(). E10.5和E16.5-E19.5的整体和组织学分析第53页−/−；第63页−/−胚胎没有明显的缺陷，这会妨碍后期存活(和). 具体来说，心脏、肝脏、肺、肠和神经元的发育似乎非常正常。相比之下第63页-肢体、上皮和颅面缺陷的空表型同样明显，无论第53页状态。此外第53页−/−；第63页−/−突变体的完整性并不比第63页−/−胚胎，通过组织学和基底细胞标记物K14染色进行评估(). 因此，除了单纯的p63或p53缺陷外，胚胎中p53和p63的联合缺失似乎不会显著影响小鼠的发育。
p53家族复合突变胚胎的存活率。(一)观察到的数量（和预期的孟德尔数量）第53页−/−；第63页−/−在指示的胚胎（E）阶段从第53页+/负极；第63页+/−老鼠。通过卵黄囊DNA的PCR分析确定基因型。引物序列可根据要求提供。显示了隔离的概念总数。重要性表示为P（P）由χ2测试。(b条)E16.5的整体安装映像第53页−/−；第63页−/−胚胎（右）与对照窝友（左）相比，显示四肢缺失（箭头）和颅面缺陷（箭头）。比例尺指示1 mM(c（c）)观测到的（和预期的孟德尔数）第63页−/−；第73页−/−在指示的胚胎（E）阶段从第63页+/负极；第73页+/−老鼠。通过卵黄囊DNA的PCR分析确定基因型。显示了隔离的概念总数。重要性表示为P（P）由χ2测试。(d日)E18.5的整体安装映像第63页−/−；第73页−/−胚胎（右）与对照第63页-空窝友（左），显示四肢缺失（箭头）和颅面缺陷（箭头）。比例尺指示1 mM(e（电子）)从中回收的复合突变胚胎的观察数（和预期孟德尔数）p53；第63页；第73页-在指定的胚胎（E）年龄进行杂合杂交。通过卵黄囊DNA的PCR分析确定基因型。显示了隔离的概念总数。重要性表示为P（P）取决于χ2测试。绿色：双淘汰赛；蓝色：五个等位基因敲除；红色：三次击倒。(（f）)E13.5的整体安装映像第53页+/负极；第63页−/−；第73页−/−胚胎（右）与对照窝友（左和中）相比，显示出四肢缺失（箭头）和颅面缺陷（箭头）第63页-无胚胎。比例尺指示1 mM(克)PCR分析p53，p63和第73页三敲除胚胎（*）中相对于野生型、杂合子、空基因和阴性基因（H）的等位基因20）控件。DNA来自胚胎尾部。(小时)溴化乙锭染色紫外线损伤的整体图像第53页−/−；第63页−/−；第73页−/−胚胎（右）处于E11.0，与对照同窝出生（左）相比。这个第53页−/−; 第63页−/−; 第73页−/−胚胎阻碍肢体发育（箭头）。比例尺表示500微米。小鼠保持在129/Sv混合液中；C57BL/6J背景。动物研究是根据斯坦福大学APLAC进行的
p53家族复合突变胚胎的组织学分析。(一)E16.5矢状截面的代表性苏木精和伊红（H&E）染色图像第53页−/−；第63页−/−（右）和对照（左）胚胎，心脏（h）、肺（Lu）、肝（L）、肠（i）、肾（k）和神经系统（N）发育正常，但颅面发育缺陷（箭头）。比例尺指示1 mM(b条)E18.5矢状截面的代表性H&E染色图像第63页−/−；第73页−/−（右）和控制第63页-无（左）胚胎，心脏（h）、肺（Lu）、肝（L）、肠（i）和神经系统（N）发育正常，但颅面发育缺陷（箭头）。比例尺指示1 mM(c（c）)E13.5矢状截面的代表性H&E染色图像第53页+/负极；第63页−/−；第73页−/−和对照胚胎切片，显示心脏（h）、肺（Lu）、肝脏（L）和神经系统（N）发育正常，但颅面发育缺陷（箭头）。比例尺指示1 mM(d日)E16.5对照胚胎（左）或突变胚胎（右）表面上皮K14免疫组化分析。比例尺指示50微米。底部：方框区域的放大图像。采用标准程序，使用兔抗K14（1:1000，Covance，PRB-155P）进行免疫组织化学。(e（电子）)E11.0矢状截面的H&E染色图像第53页−/−；第63页−/−；第73页−/−（右）和对照（左）胚胎，肝脏发育正常，心脏垫发育异常。比例尺表示500微米。底部：心脏垫的放大图像，突出显示发育不良垫的发展（箭头）第53页−/−；第63页−/−；第73页−/−（右）胚胎相对于同窝对照（左）。相反，心室的心脏小梁形成正常
接下来我们研究了p63和p73的缺失是否对发育有任何影响。有趣的是，之前的实验检查第63页−/−；第73页−/−MEF建议将第63页和第73页-在胚胎中枢神经系统和表达癌基因的成纤维细胞中，凋亡测定中p53缺失的无合子表型。26交叉时第63页+/负极；第73页+/负极小鼠，我们观察到没有活的第63页−/−；第73页−/−出生后的小鼠，如预期的p63缺乏。然而，对E16.5-E18.5胚胎发生晚期胚胎的分析表明第63页−/−；第73页−/−正常孟德尔比率下的胚胎(). 进一步分析显示，p63缺失导致肢体、上皮和颅面缺陷(和). 然而，由于心脏、肝脏、肺、肠和神经元的发育在全球范围内均正常，因此没有因p73的额外丢失而出现明显的额外缺陷。值得注意的是，我们没有观察到任何引人注目的大脑表型，有时在第73页−/−小鼠，如脑积水，尽管这可能是由于外显率低（约20%）和/或遗传背景所致。14,15此外，与单个突变体相比，残留表皮没有显示出任何强化缺陷(). 值得注意的是，化合物第63页和第73页缺乏并没有导致某些患者出现脑溢血第53页−/−胚胎，表明第63页和第73页不概括第53页神经管方面的损失。因此，第63页−/−；第73页−/−除了在单个基因敲除胚胎中观察到的发育缺陷外，胚胎没有表现出明显的发育缺陷。
由于p53家族成员的双重敲除对胚胎发育没有显著影响，我们试图确定p53家族的任何五个等位基因或所有六个等位蛋白的缺失是否会导致任何额外的发育缺陷。鉴于获得三重基因敲除胚胎的几率很低（1/64），我们首先检查了p53家族任何五个等位基因缺失对正常发育的影响（小鼠两个基因为空，其余基因为杂合；1/32的几率）。我们交叉了第53页+/负极；第63页+/负极；第73页+/负极三杂合小鼠，并分析了妊娠中期的生存能力。对E10.5和E13.5的胚胎进行分析后，发现所有可能组合的活胚胎：第53页−/−；第63页−/−；第73页+/负极,第53页−/−；第63页+/负极；第73页−/−、和第53页+/负极；第63页−/−；第73页−/−取决于心跳的出现(). 整体安装和组织学分析显示，缺陷仅归因于第63页-无效性（例如，肢体和颅面缺陷），以及在胚胎的一个子集中，与第53页-无合子（如无脑）(和). Somite数量和心脏、肝脏、肺和神经元的发育在全球范围内均正常，这表明这些胚胎在发育后期也可能存活。因此，p53家族六分之五等位基因的缺失不会影响中期妊娠的发育。
令人惊讶的是，我们还发现了一个第53页−/−；第63页−/−；第73页−/−E11.0胚胎，基于卵黄囊和尾部DNA的PCR分析(). 根据心跳的存在，这个三重基因敲除胚胎是可行的。仅发现的三重敲除胚胎的整体分析第63页-零相关缺陷，类似于第63页−/−室友而不是第53页-无相关缺陷(). 尽管体节数、肝脏结构和神经管闭合第53页−/−；第63页−/−；第73页−/−胚胎看起来具有典型的发育特征，连续切片的组织学分析显示，相对于第63页-null和其他室友(和). 总之，这些发现表明，p53家族成员对早期发育并不是严格必要的，但他们可能在特定的发育过程中发挥多余的作用。鉴于获得三敲除基因型胚胎的几率很低，也很难确定这些胚胎在多大程度上可能被低估。通过使用纯合子无基因繁殖者来增加获得三重基因敲除胚胎的几率的尝试因早期死亡而变得复杂第63页-和第73页-null小鼠，早期癌症发生率高第53页-零小鼠，和有限的能力第73页-和第53页-由于信息素受体的缺失和生育能力的降低，导致小鼠无法繁殖。2,三,4,12,13,14,24,27未来，重要的是尝试分析更大的三重敲除胚胎队列，以充分了解p53家族在发育中的作用。
值得注意的是，考虑到p63和p73存在于不同的亚型中——具有完整反式激活结构域的TA亚型和缺乏完整TAD结构域的ΔN亚型，它们通常抑制TA亚型——一些表型可能通过多个p53家族成员的复合缺失而被挽救。例如，如果以ΔNp63表达为主的组织在第63页-因为TAp73不再被抑制，所以这些组织的正常发育将在第63页−/−；第73页−/−动物。然而，在复合无效胚胎中，我们没有观察到单个突变体典型的表型改善，这表明ΔN亚型表达对TA亚型功能的抑制不足并不构成所观察到的表型的基础。
鉴于p53家族成员高度保守，具有同源的DNA-结合域，允许它们结合相同的共识位点并调节共同的靶基因，预计在发育过程中这些蛋白质之间存在功能冗余。尽管p53和p73的联合缺失先前已被证明与出生后的生存能力相容，19,25我们现在已经表明，p63和p73或p53和p63的缺失与妊娠晚期的生存能力相一致，胚胎只表现出单个突变体特有的明显缺陷。p53家族成员对胚胎发育的可有可无与胚胎发生过程中其他蛋白家族丢失的后果形成鲜明对比。例如，Rb细胞周期调节因子家族成员双敲除的胚胎(卢比,第107页，或第130页)始终表现出比单个突变体更早的致死性，这突出了家族成员在胚胎发生过程中的冗余功能。28,29,30此外，胚胎中所有三个Rb家族成员的缺失会导致更严重的胚胎表型。31因此，所有Rb家族成员都扮演着冗余的角色，这可以在任何双突变体中显示出来，甚至在Rb家族完全丧失后更为显著。这些发现强调了参与细胞周期调节和凋亡的多蛋白家族成员之间冗余的重要性，以确保胚胎的正常发育，并强调了复合p53家族成员突变胚胎中早期致死性的惊人缺乏或发育缺陷的显著加剧。
胚胎发生期间p53家族成员之间惊人的缺乏明确冗余可能与其他家族成员被切除时特定家族成员缺乏重叠表达或补偿性上调有关。值得注意的是，我们不能完全排除胚胎发生很晚的家族成员之间的潜在冗余，也不能排除心脏等特定器官发育中更微妙的冗余作用。有趣的是，我们观察到的缺乏冗余与肿瘤研究中观察到的p53家族成员之间的冗余形成对比，在肿瘤研究中，多个家族成员的缺失会导致更严重的癌症表型。17,19这些发现表明了p53家族在某些生理环境中合作行动的重要性，如癌症抑制，但在早期胚胎发生中没有。未来的研究将更好地阐明p53家族成员在后期发育和肿瘤抑制中的相互作用。
