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单元格。作者手稿；2017年10月20日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2016年10月20日；167（3）：750–762.e14。
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2016.10.004
预防性维修识别码：PMC5322940
NIHMSID公司：NIHMS821382
PMID：27768894

人大麻素受体CB的晶体结构1

田华,1,2 基兰·维穆里,三 蒙尘铺,2 陆曲,1,2 桂元汉,4 吴怡然,1 赵素文,1 文清水,1 李珊珊,1 阿尼莎·科尔德,三 罗伯特·拉普拉里,5 爱德华·L·斯塔尔,5 乔浩浩,5 尼古拉·兹沃诺克,三 韩周,三 伊琳娜·库法列娃,6 吴蓓丽（Beili Wu）,7 赵强（音）,7 迈克尔·汉森,8 劳拉·波恩,5,* 亚历山大·马克里扬尼斯,三，* 雷蒙德·史蒂文斯,1,*和刘志杰1,2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

大麻素受体1（CB1)是Δ的主要目标9-四氢大麻酚（THC），来自大麻具有广泛的治疗应用和悠久的娱乐使用历史。CB（断路器）1被内源性大麻素类物质激活，是治疗疼痛、炎症、肥胖和药物滥用障碍的理想靶点。在这里，我们展示了人类CB的2.8Å晶体结构1在与稳定拮抗剂AM6538的配合物中，合成并表征了该结构研究。CB的结构1-AM6538复合物揭示了受体的关键特征和拮抗剂结合的关键相互作用。结合功能研究和分子模型，该结构可深入了解天然CB的结合模式1配体，如THC和合成大麻素。这增强了我们对CB生理功能的分子基础的理解1为下一代CB的设计提供了新的机会1-目标药物。

图形摘要

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介绍

大麻来自大麻.已被用于治疗和娱乐目的许多世纪(Lemberger，1980年;李，1973). 20世纪40年代，基于从植物中分离出的化合物的化学(Wollner等人，1942年)产生了新的生物活性分子(Adams等人，1948年;Ghosh等人，1940年); 然而，直到20世纪60年代，大麻的活性成分（−）-Δ9-反式-摘要分离并表征了萜类分子四氢大麻酚（THC）(高尼和梅楚兰，1964年). 这为药物化学家开发相关结构类似物和新合成配体提供了早期分子基础(Makriyannis和Rapaka，1990年;拉兹丹，1986年). 最初，由于其亲脂性，人们认为大麻素通过干扰生物膜的物理特性发挥作用(Makriyannis，2014年;Mavromoustakos等人，1995年). 随着第一个大麻素特异性膜受体的发现、克隆和表达，这一假设受到了挑战，随后被指定为大麻素受体（CB）(Devane等人，1988年;Matsuda等人，1990年). 随着第二个受体的识别，命名演变为CB1和CB2(Munro等人，1993年). 内源性受体激动剂内源性大麻素的发现(Devane等人，1992年)和2-花生四烯醇甘油（2-AG）(Mechoulam等人，1995年)不久之后。

大麻素受体属于A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族，通过抑制Gα输入/输出异三聚体G蛋白(霍利特，1985年)并与β-抑制素相互作用(Jin等人，1999年). CB（断路器）1是人脑中表达最高的GPCR，在全身表达，在中枢神经系统中表达最高(Herkenham等人，1990年).

几个世纪以来，大麻在许多文化中被用来治疗各种各样的疾病。最近，治疗方面的考虑已经超越了植物提取物，转而探索和生产更具药理学意义的精制化合物。CB（断路器）1-选择性小分子激动剂在包括疼痛和炎症在内的广泛疾病中显示出治疗前景(Cravatt和Lichtman，2004年)、多发性硬化(珀斯韦，2002年;普莱斯和贝克，2015年)、神经退行性疾病(Fernandez-Ruiz等人，2015年). 第一个CB1-选择性拮抗剂/反向激动剂利莫那班（SR141716，Acomplia™（赛诺菲安万提斯））(Rinaldi-Carmona等人，1994年)，获得欧洲医疗机构的批准，作为治疗肥胖的饮食和锻炼的辅助手段(Janero和Makriyannis，2009年). CB拮抗剂1已被探索为肥胖相关代谢障碍的潜在治疗药物(Mazier等人，2015年)、精神疾病(Black等人，2011年;Rubino等人，2015年)、肝纤维化(Mallat等人，2013年)和尼古丁上瘾(Schindler等人，2016年). 然而，利莫那班及其同类配体在美国没有得到批准，原因是担心出现不良事件，如焦虑、抑郁和自杀意念增加。

许多研究已经调查了配体如何结合CB1可以调节下游信号。虽然表现出不同药理特征的各种化合物为CB提供了线索1激活，定义内源性和外源性配体结合模式的分子细节在很大程度上仍然未知(郭等，1994;Makriyannis，2014年;Picone等人，2005年). 为了解决这一理解上的不足，我们确定了CB的晶体结构1与紧密结合拮抗剂AM6538复合。结合分子对接，该结构被用于阐明CB的多种拮抗剂/反向激动剂和激动剂的结合模式1本文报道的大麻素受体的结构细节提高了我们对配体如何参与调节大麻素系统的理解，并提供了一个有用的模型来促进下一代药物的设计，以避免不必要的副作用。这些发现提供了对拮抗剂缓慢解离机制的见解，这可能转化为长效药理作用。

结果

CB的合成1用于结构研究的稳定拮抗剂AM6538

促进CB结构确定的关键因素之一1(图1)是利用拮抗剂AM6538，其合成源于利莫那班的战略修饰，以增强其稳定配体受体复合物和促进CB的能力1晶体形成。与利莫那班相比，5-苯环取代基被修饰以引入基序（例如炔烃单元），这可能有助于增加CB的亲和力1受体(Tam等人，2010年). 利莫纳班特模拟，AM251(1,图2A) (Lan等人，1999年)，一种被广泛用作药理标准CB的化合物1-选择性拮抗剂被用作AM6538合成过程中的前体。AM6538的合成涉及AM251中5-苯基环对位处碘代取代基的官能化，该官能化使用由四个碳组成的乙酰链系统，并在ω碳处进行取代。为此，我们最初专注于以CB中的半胱氨酸残基为靶点1通过引入合适的亲电基团(Janero等人，2015年;Li等人，2005年;Mercier等人，2010年;Picone等人，2005年;Szymanski等人，2011年)在炔烃单元的第四个碳上，能够与半胱氨酸巯基形成共价键。对于AM6538，我们在此位置引入了硝酸盐基团（ONO2)其作用是充当极性基团，可被合适的亲核剂（例如硫醇）取代(Pattison and Brown，1956年;Yeates等人，1985年)在结合域或其附近，或者作为完整基团结合，以便通过与氢键氨基酸残基以及能够进行π-π相互作用的残基相互作用，获得非共价、近不可逆的连接。在本研究中，亲和质谱分析表明AM6538与CB反应1作为一个完整的分子，没有相关半胱氨酸残基共价修饰的证据。

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CB的总体结构1-AM6538综合体

（A）断路器侧视图1-AM6538复合体。接收器以灰色卡通表示。配体AM6538用绿色的棍子标出了被N末端环（红色）部分遮挡的结合囊。由于未观察到电子密度，因此在实验晶体结构中未模拟硝酸根。细胞外环路（ECL）显示为棕色，细胞内环路显示为紫色。（B）细胞外侧俯视图。ECL2中的二硫键显示为黄色条。另请参见图S2和第3页.

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AM6538的合成与表征

（A）化合物AM6538的合成程序。（B）饱和度[三H] -在没有（对照）或存在利莫那班（100 nM）或AM6538（50 nM）的情况下进行CP55940结合分析表明，当在1小时结合分析中同时存在时，这两种拮抗剂都会导致放射性配体的特异性结合位移。（C）仅使用缓冲液（无）、利莫那班（100 nM）或AM6538（50 nM）预处理膜（37°C，6 h）后；之前用3倍缓冲液清洗膜[三H] -CP55940绑定，如B所述。（D）剩余结合百分比（B最大值)根据（A）（同时）和（B）（预处理和清洗）中描述的条件检测。两种拮抗剂都降低了[三H] -CP55940至~30%，在1小时结合试验期间同时培养。在预处理和冲洗条件下，利莫那班不会影响随后的放射性配体结合，而AM6538则继续竞争，尽管清洗了膜。另请参见图S1和表S1.

基于AM6538与CB的高亲和力和耐洗性结合，AM6538是该受体晶体学研究的有力候选者1根据对氚化激动剂的放射配体竞争分析确定[三H] -CP55940（K我=3.4±1.0 nM）(图2B、C和D). 这与利莫那班相反，利莫那班特可以很容易地从膜上洗掉，从而允许随后的放射性配体结合(图2B、C和D). 重要的是，结晶CB1构建物（如下所述）与作为野生型受体（K我=5.1±0.9 nM）。

在功能测定中，AM6538是CP55940和THC对CB作用的竞争性拮抗剂1-介导抑制过表达系统中腺苷酸环化酶活性和β-arrestin2募集(图S1A和图S1B,表S1). 竞争对抗得到了[35S] -在小鼠小脑中进行GTPγS结合分析(图S1C). 为了进行比较，利莫那班在同一系统中表现出竞争对抗性(图S1和表S1).

CB的结构测定1-AM6538综合楼

为了促进结晶，有必要修改野生型（WT）CB1顺序。构建优化程序(Lv等人，2016)已鉴定的Flavodoxin(Chun等人，2012年)在Val306和Pro332处插入受体的第三细胞内环路（ICL3）时，作为稳定的融合伙伴。此外，野生型受体在N端和C端分别被截断98个和58个残基。最后，为了提高受体的表达和热稳定性，四种计算预测突变（Thr2103.46阿拉(D'Antona等人，2006年)，Glu2735.37Lys，Thr赖斯2835.47Val和Arg3406.32Glu）被引入CB1顺序(图S2A、B和C)（上标表示巴列斯特罗斯描述的氨基酸位置(Ballesteros和Weinstein，1995年)). 修改后的CB1将构建物插入pTT5载体，在HEK293F细胞中表达，以产生蛋白质(图S2D)在添加胆固醇的脂质立方相中形成晶体(图S3E); 晶体衍射到2.8度(表1).

表1

结晶数据收集和精炼统计。

数据收集和精炼统计
配体第6538页
晶体数量29
数据收集
空间组指挥与控制
单元格尺寸
a、 b，c（Å）116.56, 52.63, 143.63
β (°)111.14
测量的反射次数160, 794
唯一反射数19,837
分辨率（Ω）47.30 – 2.80 (2.90–2.80)
R（右）合并 $0.126 (0.520)
平均值I/σ（I）10.1 (2.1)
完整性（%）97.4 (94.1)
冗余8.1 (4.6)
科科斯群岛1/20.999 (0.44)
精炼
分辨率（Ω）47.05 – 2.80
反射数（测试集）19,827 (985)
R（右）工作/对自由的0.207/0.238
原子数
CB（断路器）12,312
黄酮多辛1,103
AM6538型&33
脂质和其他102
平均B系数（λ2)
威尔逊73.6
总体87.4
CB（断路器）1110.6
黄酮多辛66.6
AM6538型119.5
脂质和其他79.7
均方根偏差
键长（Ω）0.004
结合角（°）0.638
Ramachandran绘图统计（%）*
受欢迎的地区97.7
允许的区域2.3
不允许的区域0
$括号中显示了高分辨率外壳的数据
&由于缺乏电子密度，硝酸根被排除在外
*如MolProbity中所定义

根据亲和质谱分析，完整的AM6538与CB相关1蛋白质(图S3F). AM6538的所有原子都可以在电子密度图中观察到，但末端硝酸根除外(图3D). 对CB进行了分子动力学（MD）模拟1-AM6538配合物和结果表明，硝酸根和铰链碳原子的均方根波动（RMSF）值较高，表明硝酸根比AM6538中的其他原子更具流动性(图S4B). 关于AM6538硝酸盐基团的进一步研究正在进行中。

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CB配体结合囊分析1

（A）CB中的关键残留物1用于AM6538绑定。AM6538（绿色碳）和CB1参与配体结合的残基（teal碳）如棒状图所示。接收器以灰色卡通表示。（B）配体结合囊的形状。AM6538（绿色碳素）和ML056（棕色碳素）以棒状表示。（C）CB之间相互作用的示意图1和AM6538。红色圆圈中的2,4-二氯苯基环称为臂1；蓝色圆圈中的4-脂肪链取代苯基环称为臂2；绿色圆圈中的哌啶-1-基氨甲酰被称为臂3。电子密度中未观察到的硝酸盐基团显示为灰色。（D）根据CB精细结构计算的电子密度图1-AM6538复合体|图中显示了配体AM6538的Fo|-|Fc|omite图（蓝色网格）（轮廓为3σ）。另请参见图S3.

CB的结构特点1与AM6538复合

整体CB1结构折叠与先前解决的a类GPCR结构具有相似的结构，包含七个跨膜（7TM）α-螺旋（I至VII），由三个细胞外环（ECL1–3）和三个细胞内环（ICL1–3）连接，以及一个两亲性螺旋VIII(图1A和图S3A). CB N端的非分叉部分1，残基99–112，形成一个V形环，插入配体结合囊中，起到塞的作用，限制从细胞外侧进入囊(图1A和B). 而晶体堆积相互作用对N端构象的影响(图S3B)不能排除，有趣的是，在相关脂质受体LPA的结构中，N末端一直以有序的形式被观察到1(Chrencik等人，2015年)和S1P1(Hanson等人，2012年)以及CB的功能1对N末端有序部分的存在非常敏感(Andersson等人，2003年;Fay和Farrens，2013年). CB中的ECL21由21个残基折叠成一个复杂的结构组成，将四个残基（268-271）投射到装订袋中。先前的工作表明，这四个残基对于介导与某些类别配体的相互作用很重要(Ahn等人，2009年;Bertalovitz等人，2010年)ECL2中的两个半胱氨酸（Cys257和Cys264）对CB的功能至关重要1(Fay等人，2005年). 在结构中，ECL2的构象受到环内二硫键（Cys257-Cys264）的限制(图1B)之前在密切相关的LPA结构中发现1和S1P1受体。ECL2和螺旋III（Cys）之间高度保守的二硫键3.25)在大多数A类GPCR中，所有三种脂质受体结构都缺乏GPCR。

AM6538 CB中的交互1绑带口袋

CB配体结合袋的位置1与之前描述的其他A类GPCR的正构结合位点不同。AM6538位于CB装订袋的较低位置1，紧邻保守Trp3566.48(图3A和B). 配体采用扩展构象，配体应变接近量子力学计算确定的局部最小值(图S3D).

AM6538主要与ECL2和N末端以及所有CB形成疏水相互作用1螺旋线，螺旋线IV除外(图3 A和B). 如上所述，配体具有三个官能团的吡唑环核。为了清楚起见，我们将2,4-二氯苯基环称为“臂1”，将4-脂肪族链取代苯基环命名为“臂2”，将哌啶-1-基氨甲酰命名为“手臂3”(图3C). 吡唑环核（包括4-甲基）位于螺旋II和VII之间，与Phe170侧链形成疏水相互作用2.57，Phe3797.35和Ser3837.39(图3C)，并被N端回路相互作用（Met103N项). 手臂1位于窄侧口袋中(图3B)由螺旋II、III、VI和VII形成，并与Phe170侧链形成边-面π-π相互作用2.57和Gly166之间的主链酰胺键2.53和Ser1672.54。该取代环部分与Val196形成疏水相互作用3.32，Trp3566.48，气缸3867.42，鲁3877.43和Met103N项(图3C). 臂1中的2,4-二氯苯基环与窄侧袋的形状非常吻合(图S3C)，这解释了为什么2,4-二氯或2-氯取代导致最佳结合(兰格和克鲁斯，2005年).

配体的第2臂伸向一个狭长的通道(图3B)由螺旋III、V、VI和ECL2形成。臂2中的苯基与Phe102建立π-π相互作用N项，Phe268ECL2（ECL2）和Trp3566.48; 与Leu193的疏水相互作用3.29，Val1963.32和Leu3596.51观察到。臂2中长脂肪链内的三键与Phe268形成π-π相互作用ECL2（ECL2）和Trp3566.48; 以及与包括Leu193在内的几个残基的疏水相互作用3.29，Val1963.32，Thr197号3.33，亮氨酸3596.51，和Met3636.55(图3C). 有趣的是，长疏水链的结合模式类似于ML056与S1P的结合模式1受体(图3B)这意味着这可能是脂结合受体中长脂肪链的保守结合囊。关于尚未在晶体结构中观察到的硝酸根，我们的对接实验定义了硝酸根与残基Thr197相互作用的区域3.33、Tyr2755.39和Trp2795.43通过氢键和π-π相互作用(图S4A).

最后，臂3向由螺旋线I、II、VII构成的间隙延伸，并由N端环覆盖(图3B). 它与疏水残基Met103形成相互作用N项，伊利105N项，第119页1.35，123系列1.39，苯丙氨酸1702.57，Phe1742.61，阿拉3807.36，序列3837.39和Met3847.40(图3C). 与其他两个臂形成的π-π相互作用不同，臂3和受体之间的相互作用是非特异性的。

AM6538和CB之间的相互作用1，苯丙氨酸1702.57通过与吡唑环核以及arm1和arm3中的环相互作用发挥重要作用。此外，Phe1702.57被配体推动向螺旋I移动，与S1P相比，螺旋II最后两圈（残基170–177）向螺旋I倾斜1和LPA1，两个最接近的同系物(图4A和B). 这个倾斜的螺旋II反过来又将螺旋I推动约7度，这主要是由于它和两个笨重的残基Phe170的相互作用2.57和Phe1742.61.

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CB的比较1、LPA1和S1P1结构特点

（A）CB侧视图1LPA的结构发散区1（PDB ID:4Z34）和S1P1（PDB ID:3V2Y）覆盖。液化石油气1和S1P1接收器显示在灰色卡通中。CB1N末端环（红色）占据极性结合囊，与其他两个受体相比，螺旋I（红色螺旋）向外移动7º。CB的ECL31显示了螺旋VII（棕色螺旋）的三个螺旋圈延伸。（B）CB顶视图（A）旋转90°1具有LPA的结构发散区域1（4Z34）和S1P1（3V2Y）覆盖。CB（断路器）1图中显示了ECL2（蓝色）与其他两个受体的保守构象，螺旋II移出2？（紫色螺旋）。（C–E）CB残基3.28的相互作用网络1（K192），LPA1（R124）和S1P1（R120）。极性相互作用用黑色虚线表示。（C）CB（断路器）1以灰色卡通显示，AM6538以绿色条显示，密钥残留物以蓝色条显示；（D）液化石油气1以灰色卡通显示，ONO-9780307以紫蓝色条显示，密钥残留物以青色条显示；（E）第1阶段1以灰色卡通显示，ML056以橙色条显示，密钥残留物以粉红色条显示。另请参见图S5.

Lys192的作用3.28在CB中1已经进行了深入研究。据报道，Lys192Ala/Lys192Gln/Lys192Glu突变体降低了CP55940、HU-210和anandamide等几种激动剂的亲和力(Chin等人，1998年;Hurst等人，2002年;Pan等人，1998年;Song和Bonner，1996年). 此前，有人认为Lys1923.28与CB有直接互动1配体。然而，在我们的CB中1结构，Lys1923.28不与AM6538直接相互作用。相反，它形成一个盐桥/氢键网络，稳定ECL1的构象、N末端以及螺旋II和III的细胞外部分。Lys192的侧链3.28点远离装订袋，与Asp176形成盐桥2.63和Asp184ECL1（ECL1），而Asp184ECL1（ECL1）通过与Phe102主链形成氢键，进一步稳定N末端N项(图4C).

CB的结构比较1、LPA1和S1P1受体

CB（断路器）1、LPA1和S1P1受体均结合脂质衍生的内源性配体（anandamide/sn-2-花生酰甘油、1-磷酸鞘氨醇、溶血磷脂酸）(清水，2009). 早期序列分析显示CB1与LPA具有中等序列一致性1（总体13%，TM地区28%）和S1P1（总体14%，TM地区27%）(Bramblett等人，1995年;Isberg等人，2016年) (图S5). LPA的晶体结构1(Chrencik等人，2015年)和S1P1(Hanson等人，2012年)最近已确定。三种脂质受体之间的主要结构差异发生在细胞外部分，最显著的是CB的N末端环的独特构象1(图4A和B). 对于这三种受体，N末端在配体识别中起作用。比较三种受体的配体结合位置，AM6538比LPA中的配体更水平1和S1P1，手臂1深入侧口袋(图4A). 一致地，CB中的N端回路1与LPA的N端螺旋线相比，其位置更深1和S1P1，它们都被定位为各自配体结合囊上的盖。因此，CB的螺旋I1相对于LPA向外推动约7Å1和S1P1在第2臂，螺旋I和VII之间的间隙比LPA中观察到的更大1和S1P1(图4A). 此外，螺旋II和ECL1改变了它们在CB中的构象1与LPA相比，螺旋II从装订袋移动2°1和S1P1和ECL1从LPA中的短螺旋区域变化1和S1P1至CB中的回路1(图4B). 这些构象变化有效地扩大了CB的结合囊1允许接入可进入的N端环路，并有助于扩大与CB相关的表面积和多个子袋1最后，CB的ECL3区域1与相关受体不同的是，螺旋VII的三个螺旋圈延伸增加了CB环区的刚性，并可能降低了其灵活性1(图4A).

Lys192的安排3.28在CB中1与同等残留物Arg相比是唯一的3.28LPA中1和S1P1.在LPA中1和S1P1，氩气3.28点进入结合囊，与配体的磷酸头基团形成强烈的相互作用(图4D和E); 它由带负电荷或极性残基3.29（LPA中的Gln125）稳定1和Glu121在S1P中1). 然而，在CB中1Leu193附近的环境3.29配体是疏水的，因此在能量上对带正电的Lys192有利3.28指向别处的装订袋(图4C). 事实上，Lys1923.28通过形成盐桥/氢键网络发挥稳定锚定作用，而不是直接与作为Arg的配体相互作用3.28在LPA中1和S1P1CB内源性配体的另一个主要区别1（anandamide，2-AG），LPA1（LPA）和S1P1（S1P）为头组。LPA负责人1和S1P1配体是带负电的磷酸基团，而CB的头部1配体是中性的。事实上，CB头部的磷酸化1配体anandamide和2-AG会将其转化为LPA的配体1(Chrencik等人，2015年).

代表性拮抗剂与CB的结合方式1

我们对AM6538和三个CB进行了对接1拮抗剂：利莫那班、奥特纳班和塔拉纳班(图5,表S2)代表CB的各种支架1临床试验中使用的拮抗剂。对于每个化合物，使用排名靠前的姿势进行分析。AM6538的对接姿势再现了晶体姿势(图S4A)，均方根偏差（RMSD）为0.55º。对于这三个对手，他们的1标准-分级对接姿势与AM6538在晶体结构中的姿势相似，有三条手臂可以插入装订袋的三个分支，如AM6538装订模式所述(图5A). 如AM6538所示，侧袋、长通道和间隙中的臂称为臂1、臂2和臂3(图5B). 这三种对抗者中，第一臂和第二臂的支架非常相似，对接姿势也非常相似。最大的区别是来自第3部分，但它们都很笨重，我们推测这是CB的签名1拮抗剂。塔拉纳班特与CB的亲和力最高1在三个配体中(表S2). 它的核心没有刚性芳香环，允许其臂2和臂3有更多的自由度来与周围残基形成更强的相互作用(图5C). Phe170的突变2.57Ala或Phe1742.61丙氨酸导致利莫那班和AM6538的功能亲和力显著降低，而这两种突变都不会改变激动剂CP55940的效力。色氨酸（Phe170）的保守突变2.57Trp或Phe1742.61Trp）对拮抗剂结合没有明显影响，进一步支持了该位点疏水相互作用的重要性(图S4G和H). 此外，我们进行了50 ns MD模拟，从对接姿势开始，直观评估预测的配体-受体相互作用。AM6538、利莫那班和奥特纳班的RMSD值约为1.4º。对于taranabant，该值更大（约3Å），这与它缺乏核心芳香环有关(图S4C–F). 预测的配体相互作用在短MD模拟期间保持不变。MD仿真中AM6538的中心结构最接近对接姿态。

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CB中不同拮抗剂的对接1晶体结构

（A）CB（断路器）1灰色表面显示了带有rimonabant（蓝色棍子）、otnabant（覆盆子棍子）和taranabant（棕色棍子）的装袋。（B）利莫那班、奥特纳班和塔拉那班的化学结构。红色/蓝色/绿色矩形突出显示了之前描述的手臂，称为手臂1/手臂2/手臂3（参见图3C).（C）利莫那班（蓝枝）、奥特纳班（覆盆子枝）和塔拉纳班（棕色枝）与CB的预计结合模式1。相互作用的残基以黄色条显示，H178以绿色条显示。另请参见图S4和表S2.

CB典型激进分子对接姿势1

虽然我们呈现的晶体结构处于非活性状态，但我们能够研究代表性激动剂如何可能与CB的正构口袋结合1通过整合分子对接、突变和SAR数据(Ahn等人，2009年;Aung等人，2000年;Bertalovitz等人，2010年). 六个CB1激动剂(表S2)：经典大麻素、THC和CP55940；选择内源性激动剂anandamide和2-AG以及吲哚衍生物JWH-018和WIN 55212-2进行对接研究。这些激动剂主要与ECL2、N末端环、螺旋III、VI和VII相互作用，而不与螺旋I和II相互作用。它们的预测绑定模式如所示图6对于THC和CP55940，环位于N末端环和ECL2之间，与Phe268形成π-π相互作用ECL2（ECL2）(图6A和B)碳链延伸到长通道并与螺旋III、VI和VII的残基相互作用。CP55940不与螺旋体I和II相互作用，这得到了我们的突变研究的支持：Phe170和Phe174（Phe170）的突变2.57丙氨酸/色氨酸或苯丙氨酸1742.61Ala/Trp）不会改变CP55940的效力(图S4G). 阿南酰胺和2-AG预计采用C型构象，并与THC占据相似的空间(图6C和D). 它们的亲水性头部夹在N端环和ECL2之间，长的脂肪族尾部延伸到长通道的深处。然而，预计JWH-018和WIN 55212-2比THC在口袋中结合得更深(图6E和F). 吲哚环和萘环都与Phe268形成π-π相互作用ECL2型. TheN个-取代基到达长通道末端并与螺旋V相互作用。螺旋V上的突变支持JWH-018和WIN55212-2的结合模式(McAllister等人，2003年;Song等人，1999年)和SAR研究N个-烷基链长度(Aung等人，2000年). 值得注意的是，所有激动剂都与Phe268相互作用ECL2（ECL2）和Phe3797.35在我们的对接姿势中，这与ECL2的突变研究一致(Ahn等人，2009年)和Phe3797.35(图S4I). 以下任一个体突变：Phe268ECL2（ECL2）Trp，项目269ECL2（ECL2）Ala，His希斯·阿拉270ECL2（ECL2）伊利诺伊州阿拉271ECL2（ECL2）Ala或ECL2上二硫键Cys257-Cys264的断裂，显著降低了所有三种不同类型激动剂的结合，但对拮抗剂结合几乎没有影响(Ahn等人，2009年). Phe379的突出作用7.35为了促进CP55940的功能亲和性，Phe379失去了CP55940-效价7.35Trp突变和Phe379激动剂活性的更大损失7.35丙氨酸突变(图S4I). 虽然这些突变显著影响CP55940激动剂，但对拮抗剂/反向激动剂（AM6538或利莫那班）替代激动剂没有影响(图S4J)，进一步支持CP55940的预测绑定姿势(图6G).

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不同大麻素受体激动剂的对接位置

（A–F）THC（粉红棒）的化学结构和预测结合姿势（A），CP55940（洋红色条）（B），Anandamide（青色棒）（C），2-AG（绿色棒）（D），JWH-018（黄色条）（E），WIN 55212-2（蓝色条）（F） ●●●●。（G）预测CP55940绑定姿势的放大视图。CP55940以洋红色条显示，AM6538以绿色条显示，钥匙残留物以石板条显示。另请参见图S4和表S2.

讨论

本研究中使用的配体AM6538旨在稳定配体-CB1受体复合物与促进CB1晶体形成。为此，我们的方法侧重于使用基于利莫那班结构的取代的双芳基吡唑化学型来获得高度利用的专利探针。在这类化合物中，化学型的轻微改变导致了AM251，一种常用的CB1反向激动剂/拮抗剂(Lan等人，1999年)和AM281，CB1放射标记产生第一个体内用于标记CB的显像剂1在非人类灵长类和人类中(Berding等人，2004年;Gatley等人，1998年). AM6538充当CB1稳定拮抗剂和配体在CB的结构测定中是有效的1.AM6538作为一个完整的分子反应，没有共价结合的晶体证据，同时也没有揭示X射线结构中末端硝酸根的位置。虽然放射性配体结合研究表明AM6538与受体紧密结合，但稳定受体的确切作用方式仍有待确定。

迄今为止，关于CB仍存在相当大的争议1配体及其多种医学应用。这可能部分归因于最著名的CB的广泛可用性和非法性1药物、大麻。大麻在许多文化中被广泛用于治疗多种疾病，大多数结果是通过口头传统、轶事、政治立场或出于经济利益而传播的，这妨碍了对任何特定疾病状态下的治疗进行客观解释(Whiting等人，2015年). 医用大麻运动继续获得支持，具有明确终点的临床试验将继续教育医疗和制药界，使其了解针对这一生理系统的相对益处和缺点。CB的晶体结构1在与AM6538的复合物中，显示了一个由多个子囊和通往受体不同区域的通道组成的广泛而复杂的结合囊网络。三臂配体结构是CB的常见结构1拮抗剂和反向激动剂，并且可能对于稳定非信号构象中天然受体的固有灵活性至关重要。结合CB的3D结构1以及作为反向激动剂的三种代表性拮抗剂利莫那班、奥特那班和塔拉那班的分子对接，清楚地说明了每一支手臂的作用。臂1对于高亲和力结合至关重要，而臂2延伸到长通道。臂3上的脂肪族或芳香环推动螺旋I、II，使其向外弯曲，并可能调节受体的药理信号状态。结合结构和建模数据，我们推测臂3上的一个庞大的环对CB至关重要1对抗。这一观察为设计更多不同的化合物提供了方向，因为我们已经了解到在臂3的核心可以容忍可变的化学基团，在臂3中可以添加长碳链对位-苯环在臂2中的位置。例如，在臂2引入4-氰基-1-炔产生AM6545(表S2)，高亲和力CB1中性拮抗剂(Tam等人，2010年).

了解CB的细微差别1结合和激活很重要，因为人类使用的植物大麻素激动剂THC与合成的“香料”或“K-2”大麻素成分（如JWH-018）之间存在差异。一般来说，大麻素激动剂是经常被滥用的物质；然而，虽然尚未记录过量服用THC/大麻的情况，但也有一些案例表明，摄入这种合成混合物会导致严重甚至致命的反应，导致包括美国在内的许多国家实施联邦限制。目前尚不清楚为什么THC的安全裕度如此之高，而合成大麻素成分可能具有不同程度的严重毒副作用(Hermanns-Clausen等人，2013年). 展望未来，大麻素的研究大麻将为其高效性和安全性提供线索，并可能继续激发丰富的药物精制化合物和新型疗法来源；晶体结构的实用性可能为药物设计提供灵感，以提高疗效和避免不良事件。

STAR*方法

本文的在线版本中提供了详细的方法，包括以下内容：

  • 关键资源表
  • 试剂和资源共享联系人
  • 实验模型和受试者详细信息
    • 老鼠
  • 方法详细信息
    • AM6538的合成与表征
    • CB热稳定突变的合理设计1
    • 用于结构测定的蛋白质工程
    • 哺乳动物表达系统中的蛋白质表达
    • 蛋白质纯化
    • CB的脂质立方相结晶1-AM6538综合体
    • 数据收集和结构确定
    • AM6538的量子力学优化
    • CB对接仿真1配体
    • CB的分子动力学模拟1与AM6538和代表性拮抗剂复合
    • 放射性配体结合分析
    • WT和突变hCB1-用于功能研究的CHO细胞系的建立
    • 功能分析研究
    • 蛋白质稳定性分析
    • AM6538的亲和质谱分析
  • 量化和统计分析
  • 数据和软件可用性
    • 数据资源

方法和资源

关键资源表

试剂和资源共享联系人

有关试剂的更多信息和要求，请联系相应作者Raymond C.Stevens，并由其完成(nc.ude.hcetiahgnahs@snevets公司).

实验模型与资源共享

老鼠

实验上幼稚的小鼠（C57BL/6J）在9周大时从Jackson实验室购买，并在12小时的明暗循环下，在无特定病原体的设施中，以每笼5只为一组，随意进食和饮水。在~16周龄时，在小脑解剖之前，通过颈部脱位对小鼠实施安乐死。共使用四只小鼠进行4项独立实验，以评估[35S] GTPγS结合。所有实验均获得佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合NIH指南。

方法详细信息

AM6538的合成与表征

用于化学合成的所有试剂和溶剂均购自Sigma-Aldrich、TCI Chemicals、Fisher Scientific、Acros或Alfa Aesar。钯催化剂购自Sigma-Aldrich或TCI Chemicals。1核磁共振氢谱仪（500 MHz）和13在瓦里安-伊诺瓦光谱仪上记录C光谱（126 MHz）。化学位移（δ）以百万分率报告，并参考CDCl三对于7.26或77.7。乘数表示为br（加宽）、s（单线）、d（双线）、t（三线）或m（多线）。耦合常数(J型)以赫兹（Hz）为单位报告。在Merck-Millipore 210-270µm TLC硅胶板（60°）上进行薄层色谱（TLC），并涂有F254荧光指示剂。在Biotage Isolera Spektra系统上使用预加载有正相硅胶（50µm）的Luknova闪蒸柱，在254和280 nm处进行UV收集，进行闪蒸柱色谱。所有湿敏反应均在高纯度氩气气氛下进行，同时使用烤箱驱动的玻璃器皿。中间体和最终化合物使用以下组合进行表征1核磁共振氢谱，13C NMR和LC/MS技术。使用Waters MicroMass ZQ系统（电喷雾电离模式）进行LC/MS分析，该系统配备有Waters 2525二元梯度模块、Waters 2996光电二极管阵列检测器、Waters 2424 ELS检测器、两个Waters 515 HPLC泵、流体组织器和泵控制模块II。使用乙腈/水作为流动相，使用XTerra MS C18或XTerra MSC8，4.6 mm×50 mm柱（5µm），通过梯度洗脱分析化合物。熔点记录在费希尔科学仪器上。在PerkinElmer Spectrum One FT-IR光谱仪上获得了红外光谱。使用PerkinElmer II系列2400 CHNS分析仪进行元素分析。

4-（4-（1-（2,4-二氯苯基）-4-甲基-3-（哌啶-1-基氨基甲酰基）-1H（H）-吡唑-5-基）苯基）-3-炔-1-基甲基磺酸丁酯（2）

至1-（2,4-二氯苯基）-5-（4-碘苯基）-4-甲基的搅拌溶液-N个-（哌啶-1-基）-1H（H）–吡唑-3-甲酰胺(Lan等人，1999年) (1，1.1 g，2 mmol）存于DMF（30 ml）中，在氩气下添加正-3-yn-1-基甲烷磺酸盐(Tang和Prusov，2012年)（888 mg，6 mmol）和Hünig’s碱（1.9 g，20 mmol）。通过向溶液中引入稳定的氩气流5分钟，对反应混合物进行脱气，并向其中添加四（三苯基膦）钯（0）（231 mg，10 mol%）和CuI（76 mg，20 mol%。在室温下将所得混合物搅拌3小时。从反应混合物中除去溶剂真空中在70°C下，将残留物溶解在二氯甲烷（100 ml）中，并用去离子水（2×~50 ml）清洗。分离有机层，在无水MgSO上干燥4，过滤并去除滤液真空中.通过硅胶上的快速柱色谱纯化得到的残留物(n个-己烷/AcOEt=1/1）以提供2白色固体（511 mg，45%）；熔点176–178°C；1核磁共振氢谱（500 MHz，CDCl三-d） δ7.64（硬度、1H、NH（H）)，7.41（日，J型=1.46赫兹，1H，氩气H（H）)，7.34（日，J型=8.30赫兹，2H，氩气H（H）)，7.25-7.31（米，2H，氩H（H）)，7.05（d，J型=8.30赫兹，2H，氩气H（H）)，4.37（吨，J型=6.84赫兹，2H，-O-CH（H）2-)，3.07（秒，3H，-s（O）2-C类H（H）三)，2.79-2.97（米，6H，-CH2-C类H（H）2-和-N（CH（H）2中国2)2中国2，2.37（s，3H，HetAr-CH（H）三)，1.75（米，4H，-N（CH2C类H（H）2)2中国2，1.43（br.s.，2H，-N（CH2中国2)2C类H（H）2;13C核磁共振（126 MHz，CDCl三-d） δ160.2、144.7、143.6、136.2、136.1、133.2、132.0、130.8、130.5、129.7、128.8、128.1、123.5、118.5、85.8、82.5、67.4、57.3、38.0、25.7、23.6、21.0、9.6；ES m/z 575.1710（米++H） ●●●●。

1-（2,4-二氯苯基）-5-（4-（4-碘-1-炔基）苯基）-4-甲基N个（哌啶-1-基）-1H（H）-吡唑-3-甲酰胺（3）

加入搅拌过的2（500 mg，0.86 mmol）存于无水丙酮（50 ml）中，在氩气下添加碘化钠（1.3 g，8.6 mmol）和碘化四丁基铵（64 g，0.17 mmol）。将产生的反应混合物回流过夜。去除反应混合物中的溶剂真空中将残留物溶解在二氯甲烷（75ml）中，并用去离子水（2×~50mL）清洗。分离有机层，在无水MgSO上干燥4，过滤并除去滤液真空中.通过硅胶上的快速柱色谱纯化得到的残留物(n个-己烷/AcOEt=7/3）以提供三白色固体（326 mg，62%）；熔点171–173°C；1核磁共振氢谱（500 MHz，CDCl三-d） δ7.65（s，1H，NH（H）)，7.43（日，J型=1.47赫兹，1H，氩气H（H）)，7.38（日，J型=7.81赫兹，2H，氩气H（H）)，7.27-7.33（米，2H，氩H（H）)，7.07（d，J型=8.30赫兹，2H，氩气H（H）)，3.31（吨，J型=7.32赫兹，2H，I-CH（H）2)，3.01（吨，J型=7.32赫兹，2H，-CH2-C类H（H）2)，2.88（米，4H，-N（CH（H）2中国2)2中国2，2.39（s，3H，HetAr-CH（H）三)，1.68-1.87（米，4H，-N（CH2C类H（H）2)2中国2，1.45（米，2H，-N（CH2中国2)2C类H（H）2;13C核磁共振（125兆赫，CDCl三-d） δ160.2、144.7、143.7、136.3、136.1、133.2、132.0、130.8、130.6、129.6、128.6、128.1、123.9、118.5、90.3、81.9、57.3、25.7、24.8、23.6、9.6、1.6；IR（纯）3308、2929、2851、2787、2509、2160、2031、1689、1524、1486、1245、967、967，842、781厘米−1; ES m/z 607.1102（米++H） ●●●●。

4-（4-（1-（2,4-二氯苯基）-4-甲基-3-（哌啶-1-基氨基甲酰基）-1H（H）-吡唑-5-基）苯基）-3-炔-1-基硝酸丁酯（4，AM6538）

至搅拌过的溶液三取无水乙腈（30 ml）中的（300 mg，0.5 mmol），在氩气下添加硝酸银（100 mg，0.6 mmol）。将所得反应混合物加热至70°C并保持1 h。将内容物冷却至室温，并在硅藻土垫上过滤固体。滤液被去除真空中将残留物溶解在二氯甲烷（75ml）中，并用去离子水（2×~50mL）清洗。分离有机层，在无水MgSO上干燥4，过滤并去除滤液真空中.通过硅胶上的快速柱色谱纯化得到的残留物(n个-己烷/AcOEt=6/4）以提供4(第6538页) (Makriyannis和Vemuri，2016年)作为白色固体(173毫克，65%）；熔点178-180°C；1核磁共振氢谱（500 MHz，CDCl3-d）δ7.63（s，1H，NH（H）)，7.41（d，J=1.95 Hz，1H，ArH（H）)，7.34（d，J=8.30 Hz，2H，ArH（H）)，7.24-7.32（米，2H，氩H（H）)，7.05（d，J=8.30赫兹，2H，氩气H（H）)，4.62（t，J=6.59赫兹，2H，-O-CH（H）2)，2.81-2.91（米，6H，-CH2-C类H（H）2和-N（CH（H）2中国2)2中国2)，2.37（s，3H，HetAr-CH（H）三)，1.75（米，4H，-N（CH2C类H（H）2)2中国2，1.43（米，2H，-N（CH2中国2)2C类H（H）2;13C核磁共振（125 MHz，CDCl三-d） δ160.2、144.7、143.6、136.2、136.1、133.2、132.0、130.8、130.5、129.7、128.8、128.1、123.5、118.5、85.3、82.4、70.4、57.3、25.7、23.6、18.9、9.6；IR（纯）3319、2935、2857、2811、2502、2160、2031、1976、1682、1616、1528、1488、1277、968、881、824、781厘米−1; 西班牙m/z 542.1627（m++H） ；C的元素分析计算26H（H）25氯2N个5O（运行）4：C%57.57，H%4.65，N%12.91；发现：C%57.34，H%4.46，N%12.74。

CB热稳定突变的合理设计1

提高洗涤剂稳定CB的总体稳定性和均匀性1，突变设计合理。人类CB的三维同源模型1使用ICM构建和完善(Abagyan和Totrov，1994年)使用1-磷酸鞘氨醇受体1（S1P）的X射线结构1受体，PDB ID:3V2W）(Hanson等人，2012年)作为模板。从进化保守性的角度对得分最高的替代品进行了目视检查和评估，得出了一系列提议的替代品。对预测的替代物进行分析，以改善受体的单分散性（如SEC痕迹所示）和热稳定性（如CPM分析中Tm的增加所示(Alexandrov等人，2008年).

用于结构测定的蛋白质工程

人类CB的序列1该基因由GenScript合成。将Flavodoxin（PDB ID:1I1O，MW 14.9kDa，Y98W突变）融合蛋白融合到人CB的第三个细胞内环1基因，使用重叠PCR。该构造具有CB的截断1残基1–98、307–331和415–472。产生的CB1-将Flavodoxin嵌合序列亚克隆到一个修饰的哺乳动物表达pTT5载体中，该载体包含一个血凝素（HA）信号序列、一个FLAG标签和10×His标签，然后在嵌合序列的N末端之前是一个烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶裂解位点。CB公司1通过引入四个合理设计的突变，即Thr210，进一步修改了该基因3.46阿拉(D'Antona等人，2006年)，Glu2735.37Lys，Thr赖斯2835.47Val和Arg3406.32Glu，使用标准QuickChange PCR。

哺乳动物表达系统中的蛋白质表达

HEK293F细胞（Invitrogen）从0.2–0.3×10的密度开始悬浮生长6在含有5%CO的增湿培养箱中2温度为37°C，转速为130rpm。当细胞密度达到1.6–1.8×10时传代细胞6细胞/ml，大约每2-3天。CB（断路器）1-使用FreeStyle转染Flavodoxin构建物并在HEK293F细胞（Invitrogen）中表达（传代数为12–20）TM（TM）293表达系统（Invitrogen）。简言之，HEK293F细胞在第0天以6×10接种5freeStyle 293表达培养基（Invitrogen）中的细胞/ml。第2天，在细胞密度为1.0至1.2×10的条件下进行转导6细胞/ml，使用PEI-DNA复合物使细胞存活率超过95%。转染后约48小时，通过在4°C下400 g离心20分钟的方式收集细胞。

蛋白质纯化

通过反复洗涤和离心，在低渗缓冲液中解冻和溶解冷冻细胞颗粒，缓冲液为10 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM MgCl2、20 mM KCl和10 mM HEPES（pH 7.5）的高渗缓冲液、1.0 M NaCl、10 mM MgCl2，20 mM KCl，含不含EDTA的完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）。将清洗过的膜悬浮在含有30%甘油的低渗缓冲液中，并用液氮进行闪速冷冻，并在−80°C下保存，直至再次使用。在室温下解冻纯化的膜，并在4°C下用20µM AM6538和抑制剂混合物培养3 h。用1.0mg/ml碘乙酰胺（Sigma）进一步培养膜1 h。将膜溶解在含有50 mM HEPES（pH 7.5）、500 mM NaCl、1%（w/v）的缓冲液中n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM，Anatrace）和0.2%（w/v）胆固醇半乳糖酸（CHS，Sigma-Aldrich）在4°C下保持2.5–3小时。含有可溶性CB的上清液1通过高速离心分离蛋白质，然后与TALON IMAC树脂（Clontech）和20mM咪唑在4°C下孵育过夜。用含有25 mM HEPES（pH 7.5）、500 mM NaCl、10%（v/v）甘油、0.05%（w/v）DDM、0.01%（w/v）CHS、30 mM咪唑和20µM AM6538的15个柱体积的洗涤缓冲液I和含有25 mM HEPES的5个柱体积洗涤缓冲液II（pH 7.5，50 mM咪唑和20µM AM6538。用2.5柱体积的洗脱缓冲液洗脱蛋白质，该洗脱缓冲溶液含有25 mM HEPES（pH 7.5）、500 mM NaCl、10%（v/v）甘油、0.02%（w/v）DDM、0.004%（w/v）CHS、250 mM咪唑和10µM AM6538。使用PD MiniTrap G-25柱（GE Healthcare）去除咪唑。用TEV蛋白酶处理蛋白质过夜，从蛋白质中分离N末端FLAG/His标记。最后，用100kDa截止浓缩器（Sartorius）将纯化蛋白浓缩至约50mg/ml，并用于结晶试验。用分析尺寸排除色谱法（aSEC）测定蛋白质得率和单分散性。

CB的脂质立方相结晶1-AM6538综合体

对于初始结晶设置，纯化CB1-通过使用机械注射器混合器以2:3（v/v）的蛋白质/脂质比与熔融的脂质（90%（w/v）单油酸和10%（w/v）胆固醇）混合，将黄酮与AM6538的复合物重建成脂质立方相（LCP）(Caffrey和Cherezov，2009年). 使用NT8-LCP结晶机器人（Formulatrix）进行LCP结晶试验。使用自动培养箱/成像仪（RockImager 1000，Formulatrix）在20°C的温度下培养96 well玻璃夹心板并成像。晶体在0.1M HEPES条件下生长，pH 7.0–7.4100mM（NH4)2高性能操作4，25%-32%PEG400，2–20 mM乙二胺四乙酸二钠脱水（EDTA），2周后生长至完整大小。这些晶体是使用微型计数仪（MiTeGen）和液氮中的闪速冷冻法采集的。

数据收集和结构确定

使用Pilatus3 6M探测器（X射线波长1.0000Ω）在日本兵库县的Spring-8光束线41XU处收集X射线衍射数据。遵循前面描述的光栅化和数据收集策略(Cherezov等人，2009年;Hanson等人，2012年). 使用XDS整合和缩放数据(卡布施，2010年)并使用SCALA（协作计算项目，1994）进行合并。初始相位信息通过Phaser分子替换（MR）获得(McCoy等人，2007年)使用LPA的受体部分1（PDB ID:4Z34）和Flavodoxin结构（PDB ID:1I1O）作为搜索模型。使用Phenix进行精炼(Adams等人，2010年)和巴斯特(Smart等人，2012年)然后在程序COOT中手动检查和重建精确坐标(Emsley等人，2010年)同时使用|2Fo个|-|如果c（c）|和|Fo个|-|F类c（c）|地图。

AM6538的量子力学优化

使用Jaguar 9.0通过量子机械能量最小化优化AM6538的几何结构(薛定谔，2015a). 使用了密度泛函理论（DFT）和B3LYP泛函以及基集6-31G**++。以晶体结构中的构象为出发点。

CB对接仿真1配体

配体与CB结合的预测1使用Schrodinger Suite 2015-4完成。使用蛋白质制备向导处理蛋白质结构。使用LigPrep将配体从2D结构转换为3D结构。通过两种不同的方法进行分子对接：对于拮抗剂，使用Glide 6.9进行超精密刚性蛋白对接(Friesner等人，2004年;Friesner等人，2006年;Halgren等人，2004年;薛定谔，2015a); 对于激动剂，诱导适配对接(Felder和Schrott-Fischer，1995年;薛定谔，2015年b;Sherman等人，2006年)，允许以额外的精度在5.0Å内优化残基。

CB的分子动力学模拟1与AM6538和代表性拮抗剂复合

使用GROMACS 5.1.2进行分子动力学模拟(Abraham等人，2015年)，使用力场CHARMM27(Feller和MacKerell，2000年;MacKerell等人，1998年;Mackerell等人，2004年). CB的晶体结构1在结合囊中加入AM6538或反向激动剂（通过分子对接预测结合模式），按照在线方案嵌入到预先平衡的POPC（1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质双层中(Kandasamy和Larson，2006年). 配体和POPC分子的拓扑文件是使用在线服务器SwissParam生成的(Zoete等人，2011年). 用水溶解系统，并添加氯离子以中和系统。分子动力学模拟在NPT系综中进行，温度为310K，压力为1 atm，采用半各向同性耦合。首先，每个系统被平衡位置约束MD达10ns（总能量稳定）。然后对每个系统进行了三次独立运行的50 ns无位置约束MD模拟，并使用这些轨迹进行分析。配体RMSD和RMSF值通过非氢蛋白原子叠加到起始结构来计算。中心结构是所有蛋白质和配体原子在所有三条轨道上的RMSD最小的结构，其次是能量最小化。

放射性配体结合分析

稳定转染hCB1表达WT受体的HEK-293F细胞系用于饱和和竞争结合分析，使用[三H] -CP55940（0.79 nM，比活度：88.3 Ci/mmol，Perkin-Elmer），带有未标记的CP55940-（30µM），用于非特异性结合测定。在收集膜之前，根据标准程序，通过快速过滤、清洗和闪烁促进检测膜上残留的氚，在37°C下每孔25 mg蛋白质存在下进行1小时的结合分析(Janero等人，2015年).饱和结合分析和随后的非线性双曲曲线拟合分析（Graphpad Prism 6.0）显示B最大值10.2±2.6 pmol/mg，Kd=5.6±2.3 nM。以相同的方式进行分析，以测定结晶CB的亲和力1构造，其中[三H] -CP55940（显示为B最大值47.2±13.1 pmol/mg，Kd=37.8±13.9 nM）。用于WT CB的冲刷试验1，在37°C下，在载体（含1%二甲基亚砜的缓冲液）、100 nM利莫那班或50 nM AM6538存在下培养膜1小时。然后将膜重新悬浮在含有1%BSA的分析缓冲液中，然后离心2次，然后仅在分析缓冲液内清洗并收集第三次。然后对这些膜进行本节上文所述的饱和结合试验。

WT和突变hCB1-用于功能研究的CHO细胞系的建立

3×HA（血凝素）-N末端标记hCB1从cDNA.org获得受体cDNA，并将其亚克隆到小鼠干细胞病毒中进行细胞系转导（pMSCV-puro，Clontech）。使用Q5®Site-Directed Mutagenesis kit（New England Biolabs）将点突变引入MSCV逆转录病毒载体中的N末端3xHA标记的人类CB1受体cDNA，以创建突变型CB1质粒（F170A、F170W、F174A、F174W、F379A和F379W）。关键资源表中给出了用于产生突变的引物。野生型和突变型CB1然后通过Phoenix包装系统将构建物包装成逆转录病毒，并将产生的逆转录病毒应用于CHO-K1细胞进行基因转导。通过抗生素（嘌呤霉素）选择产生稳定的细胞株。细胞传代到384孔板上进行药理学表征。细胞保存在补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和5µg/mL嘌呤霉素（Invitrogen，Waltham，MA）的DMEM/F-12培养基中。

功能分析研究

CISBIO®cAMP HTRF分析

根据制造商的说明，使用CISBIO®cAMP同质时间分辨荧光共振能量转移（FRET）（HTRF）HiRange分析法测定福斯克林刺激cAMP的抑制作用（马萨诸塞州贝德福德市CISBIO Assays）。在室温下，用25µM RO-20-1724和20µM forskolin（Sigma-Aldrich）和hCB与细胞（在低容量384孔板中5000个细胞/孔）共处理30分钟1R配体的浓度为0.03–10000 nM。然后在室温下将细胞与cAMP-d2抗体在分析稀释剂和裂解缓冲液中的隐匿溶液中孵育60分钟（Cisbio分析）。使用Perkin Elmer EnVision™读板器（马萨诸塞州沃尔瑟姆）在620/665 nm处测量荧光。FRET计算为665 nm/620 nm处的荧光。从没有RO-20-1724、forskolin和配体的培养细胞中测定基本cAMP水平。用RO-20-1724和forskolin培养的细胞测定cAMP水平。将化合物溶解在PBS中的DMSO中，并按照指定的时间和浓度稀释至最终溶剂浓度1%。用于竞争分析的WT细胞分析中的激动剂性质如下：EC50=7.9±2.0 nM，东经最大值=3.21±0.39（折叠基线，设为100%CP55940）；THC：欧共体50=160.1±26.0 nM；E类最大值=1.36±0.05（折叠基线，设置为100%THC）。N≥3个单独实验，一式两份，以平均值±SEM表示。

DiscoveRx®βArrestin2检测

根据制造商的说明，在37°C下与指定配体浓度孵育1.5小时后，使用CHO-hCB1R PathHunter分析（DiscoveRx®）测定βArrestin2的招募。所有实验都包括车辆控制。细胞系中的激动剂性质如下：CP55940:EC50=23.8±4.6nM，东经最大值=4.03±0.19（折叠基线，设置为100%CP55940）；THC：欧共体50=89.2±38.9毫微米；E类最大值=2.24±0.16（折叠基线，设置为100%THC）。N≥3个重复进行的单独实验，以平均值±标准误差表示。

[35S] GTPγS与CB的结合1C57小鼠小脑膜

使用先前公布的方案测量小鼠大脑中的G蛋白偶联(Bohn等人，2015年;Janero等人，2015年). 将C57BL/6小鼠（4-7个月大）的小脑在均化缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.4，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT）中均化（玻璃对玻璃）。将匀浆通过26号针头，在4°C下以20000 x g离心两次30分钟，并重新悬浮在冰镇分析缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 7.4，100 mM NaCl，5 mM MgCl2100万EDTA和2µM GDP，100万DTT）。对于每个反应，在含有约0.1 nM的分析缓冲液中培养2.5µg膜蛋白[35S] GTPγS和在室温下以200µL的总体积增加试验化合物浓度2小时。试验化合物（CP55904、利莫那班、AM6538和THC）首先在二甲基亚砜中通过连续稀释进行稀释，然后使用分析缓冲液将二甲基亚磺酸盐最终浓度稀释至1%。通过结合和游离的滤膜终止反应[35S] GTPγS通过GF/B过滤器，使用96-well平板收割机（Brandel Inc.，Gaithersburg，MD）并用冰镇dH冲洗2O.过夜干燥过滤器，并用微孔板闪烁计数器测定放射性。对于用于分析药物竞争的实验，激动剂和拮抗剂与膜同时孵育。小鼠小脑中的激动剂特性：CP55940:EC50=63.0±5.5 nM，E最大值=2.40±0.04（折叠基线，设为100%CP55940）；N=4只单独的小鼠小脑制剂，一式两份，以平均值±S.E.M.表示。

蛋白质稳定性分析

使用硫醇特异性荧光色素N-[4-（7-二乙氨基-4-甲基-3-香豆素基）苯基]马来酰亚胺（CPM）通过微型荧光热稳定性分析测试蛋白质热稳定性，该色素与嵌入蛋白质内部的天然半胱氨酸反应，作为折叠状态整体完整性的传感器。将CPM染料（Invitrogen）以4 mg/ml溶解在二甲基亚砜中，并储存在−80°C下。在使用之前，染料储备在25 mM HEPES缓冲液、pH 7.5、150 mM NaCl、10%甘油、0.05%（w/v）DDM和0.01%（w/v）CHS中稀释为1:20。将测试蛋白质（约5µg）在同一缓冲液中稀释至最终体积120µl。添加1µl稀释染料并与蛋白质彻底混合。将反应混合物在室温下培养15分钟，然后转移到亚微米石英荧光计试管（Starna Cells，Inc.）中，并在Cary Eclipse荧光分光光度计（安捷伦科技公司）中以受控方式加热，升温速率为1°C/min，温度范围为20–90°C。激发波长设置为387nm，而发射波长为463nm。使用1260 Infinity HPLC系统（安捷伦科技公司）通过分析尺寸排除色谱法（aSEC）测试蛋白质同质性。

AM6538的亲和质谱分析

CB1与AM6538共同纯化的蛋白质首先使用PD-MiniTrap G-25柱滤筒脱盐，以去除游离配体。然后，在含有150 mM醋酸铵、0.02%（w/v）DDM和0.004%（w/v）CHS的缓冲液中，通过13000 g在4°C下离心10 min，通过30 kDa MW截止超滤膜（德国Sartorius）过滤蛋白质复合物样品（~1µg）。保留在超滤膜上的蛋白质复合物被转移到新的离心管中。配体从含90%甲醇的络合物中分离出来，并通过在25°C下13000 g离心20分钟从变性蛋白质中分离出来。在快速真空中干燥上清液，在50%甲醇中重新配制，在使用配备Agilent 1260 HPLC系统的Agilent 6230 TOF进行LC-MS分析之前稀释50倍。用95%甲醇/0.1%甲酸从Hypersil GOLD C18柱（2.1 mm×100 mm，3µm，美国赛默飞世尔科技公司）中以0.4 mL/min的流速洗脱化合物。在安捷伦6230 TOF上以100–1000 m/z的范围获得全扫描质谱，主要ESI源设置为：电压3000 V，气体温度350°C，碎片100 V。

量化和统计分析

如图所示，cAMP和β-arrestin2的浓度响应曲线以CP55940或THC在1µM时的%表示。浓度响应曲线拟合为非线性回归（三参数）模型，以确定EC50和E类最大值或Gaddum/Schild EC50如图所示，在Prism中移动全局非线性回归模型（v.6.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）。为了使数据最适合Gaddum/Schild EC50移位全局非线性回归50，pA2、山坡、，E类最大值、和E类最小值为所有数据集共享。在确定竞争对抗模型后，希尔德斜率被限制为统一(即Schild斜率=1）是这些数据的首选模型。

数据和软件可用性

数据资源

坐标和结构因子已保存在CB蛋白质数据库中1-AM6538（PDB:5TGZ）。

​

集锦

AM6538是CB的稳定、紧密结合拮抗剂1

人体CB的晶体结构1确定与AM6538复合

分子对接预测CB1四氢大麻酚和合成大麻素的结合模式

装订袋的解决方案为合理的CB提供了途径1药物设计

补充材料

1

图S1：

利莫那班和AM6538是CP55940和THC的竞争拮抗剂。与图2相关。利莫那班（左）和AM6538（右）竞争性对抗CP55940（上）和THC（下）诱导的（A）抑制hCB中forskolin刺激的cAMP积累1-CHO细胞和（B）hCB中的β-阻遏2-recruitment1-CHO DiscoveRx PathHunter细胞。（C）利莫那班（左）和AM6538（右）竞争性对抗CP55940刺激[35S] -小鼠小脑膜制剂中的GTPγS结合。数据以三次或三次以上化验的平均值±标准误差表示。竞争性非线性分析在GraphPad Prism 6.0中进行，参数包括在表S1补充方法中提供了细胞和小脑中激动剂效应的特征。

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2

图S2：

CB稳定性测定1突变体。与图1相关。（A、B）CB的分析尺寸排除色谱法（aSEC）1突变体测试突变和突变组合对蛋白质同质性的影响。（A）原始数据显示CB1包含所有四个突变的突变体（橙色痕迹）的蛋白质产量最高。（B）归一化数据表明，组合（橙色痕迹）改善了蛋白质的同质性。（C）CB的CPM斜坡分析1突变体测试突变和突变组合对蛋白质热稳定性的影响。CB的Tm值1包含所有四种突变的突变体（橙色痕迹）高于其他突变体，表明这种突变组合提高了蛋白质的热稳定性。（D）纯化结晶颗粒CB的Coommassie-染色聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）1.CB（断路器）1-1：钴固定金属亲和层析（TALON-IMAC）纯化样品的Coommasside PAGE；CB（断路器）1-2:TEV蛋白酶消化后样品的Coommassie染色PAGE。

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三

图S3：

CB的融合蛋白工程与晶体包装1-AM6538综合体。与图1和图3相关。（A）CB的总体结构1-AM6538复合体。CB（断路器）1和Flavodoxin分别为橙色和石板色。AM6538以绿色棒表示，FMN（Flavodoxin的底物）以洋红色棒表示。（B）CB的晶体封装1-AM6538复合体，N末端参与晶体堆积。（C）AM6538的2,4-二氯苯基环非常适合侧袋的形状。受体以灰色卡通和灰色表面显示，AM6538以青色碳素显示。（D）AM6538在晶体结构中的叠加（绿色）和量子力学计算的局部最小值（品红色）。（E）CB的晶体图像1与AM6538配合使用（比例尺为90 mm）。（F）纯标准AM6538（顶部）和从CB分离的配体的高分辨率质谱光谱1复杂（底部）。AM6538单同位素峰的理论m/z为542.1356。

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4

图S4：

预测拮抗剂的MD模拟和对接预测的突变验证。与图5和图6相关。（A）AM6538（品红棒）的对接姿势和预测氢键（橙色虚线）和π-π相互作用（蓝色虚线），与晶体结构中的AM6538相比（绿色棒）。（B）MD仿真中AM6538的RMSF。（C-F）AM6538型（C）、利莫纳班特（D），otenabant（E）和塔拉纳班特（F）MD中的中心结构（蛋白质以浅青色卡通示出；配体以蓝色棍子示出）与对接姿势（蛋白质以白色卡通示出，配体以黄色棍子示出来）以及配体RMSD（三次独立运行）的对比。（G）hCB的突变1Phe170Ala或Phe174Ala干扰AM6538和rimonabant取代CP55940的能力，同时保持其功能活性。相应的色氨酸突变对激动剂或拮抗剂作用没有影响。（H）在竞争反应曲线中进一步证明了拮抗剂亲和力的丧失——激动剂100nM CP55940。（一）Phe379Trp和Phe379-Ala的突变逐渐恶化CP55940的功能亲和力。（J）当针对最大程度刺激受体的CP55940浓度进行测试时，AM6538和利莫那班保持其作为拮抗剂的效力（WT和Phe379Trp的CP5594浓度为100 nM，Phe379 Ala的CP559.40浓度为10µM；每个突变体进行标准化）。数据表示为重复或三次执行的3次或更多分析的平均值±标准误差。

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5

图S5：

人类CB的多序列比对1带CB2、LPA1和S1P1受体。与图4相关。受体之间相同的位置用红色背景突出显示。对齐由MAFFT v7.299b完成(Katoh和Standley，2013年)图形是使用ESScript 3.0服务器准备的(Robert和Gouet，2014年).

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6

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7

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致谢

这项工作得到了以下资助：中国科学技术部资助2014CB910400和2015CB910104，国家自然科学基金资助31330019给（Z.J.L）；美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）拨款P01DA009158（A.M.，L.M.B.）、R37DA023142（A.M..）、R01AI118985（I.K.）和NSF拨款。我们感谢上海市政府、上海理工大学和GPCR财团的资金支持。经日本同步辐射研究所（JASRI）（提案编号：2015B1031和2016A2731）批准，同步辐射实验在Spring-8的BL41XU进行/CA@APS阿贡国家实验室，该实验室由美国能源部、科学办公室、基础能源科学办公室支持，合同编号为DE-AC02-06CH11357，光束线为BL17U1（中国上海同步辐射设施）。我们感谢iHuman研究所的克隆、细胞表达和蛋白质纯化核心设施的支持。我们感谢A.Walker对手稿的帮助；F.Xu、V.Cherezov、V.Katritch、A.Ishchenko、H.Tao、J.Cheng、D.Liu、W.Zhong和W.Liu进行了有益的讨论。NIDA药物供应计划提供了本研究中使用的标准。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

接入号码

坐标和结构因子已保存在CB蛋白质数据库中1-AM6538（PDB:5TGZ）。

作者贡献

概念化，L.M.B.，A.M.，R.C.S.，Z.J.L。；方法学，K.V.，A.M.J-H.H.，R.B.L.E.L.S.，B.W.，Q.Z。；验证，G.W.H。；形式分析，T.H.，M.P.，L.Q.，G.W.H.，Y.W.，S.Z.，W.S.，S.L.，R.B.L.，E.L.S.，N.Z.，B.W.，Q.Z.，M.A.H.，L.M.B.，A.M.，Z.J.L。；调查、T.H.、K.V.、L.Q.、G.W.H.、W.S.、S.L.、A.K.、R.B.L.、E.L.S.、J-H.H.、N.Z.、H.Z.、I.K。；写作——原稿，T.H。；写作、审查和编辑，T.H.、K.V.、Y.W.、S.Z.、I.K.、M.A.H.、L.M.B.、A.M.、R.C.S.、Z.J.L。；可视化，T.H.，M.P.，M.A.H。；监理、L.M.B.、A.M.、R.C.S.、Z.J.L。

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