抑制集落刺激因子-1受体影响肺癌细胞对顺铂的耐药性

CSF-1R的表达可能对化疗诱导的应激产生抵抗

CSF-1R的异位表达可向乳腺癌和间皮瘤细胞传递促肿瘤特性[36,47,51]. 因此，我们评估了CSF-1R的表达是否能够抵抗化疗诱导的应激，而应激是肺癌进展的常见驱动因素。首先，对4个代表性肺癌细胞株（H1975、NCI-H1299、A549和Calu-1）的mRNA进行定量PCR，结果显示，顺铂治疗后受体和配体CSF-1 mRNA均稳定增加（24小时，CC₅₀)（图​（图2A）。2安培). 对来自相同细胞的条件培养基的分析显示，顺铂处理的培养基中CSF-1的蛋白水平增加（图​（图2A）。2安培). 因此，肺癌细胞系在顺铂治疗后可以上调CSF-1的mRNA和蛋白，并在培养基中分泌CSF-1。有趣的是，这些发现与顺铂治疗的样本中CSF-1R表达细胞的持续存在有关，这是通过对CC治疗的细胞进行FACS分析来评估的₅₀和CC₇₅药物剂量，持续72小时（图​（图2B，2B型、和补充图S1B–S1C). 因此，CSF-1R的表达确定了一个能够存活顺铂治疗的细胞亚群。

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图2

CSF-1R及其配体的表达对顺铂耐药的影响

(A类)顺铂治疗增加CSF-1和CSF-1R的mRNA和蛋白水平。直方图报告了24小时收集的细胞中CSF-1和CSF-1R的mRNA水平（定量PCR），以及48小时条件培养基中CSF-1的蛋白水平（ELISA分析），这些细胞系是在CC中用顺铂处理的₅₀剂量。(B类)表达CSF-1R的细胞能够经受化疗诱导的应激。上部面板。显示CSF-1R百分比的典型FACS点图^{销售时点情报系统}在CC处用顺铂处理的H1299细胞中₅₀和CC₇₅72小时（门控）。门控细胞和同型控制在补充图S1B下部面板：柱状图条，报告CSF-1R的百分比_{销售时点情报系统}所示细胞系中的细胞。在下部面板中，报告了两个独立实验的平均值±SE。(C类——D类)CSF-1R抑制影响肺癌细胞系的克隆形成性和对顺铂的耐药性。（C） 用递增浓度JNJ-40346527处理的H1299细胞的指示抗体对CSF-1R免疫沉淀物进行免疫印迹。（D） 上部面板。递增剂量JNJ-40346527处理H1299细胞形成的集落的代表性显微照片。下部面板。直方图报告了在三个独立实验中由4个代表性细胞系形成的菌落的平均±SE。(E类)CSF-1R抑制影响肺癌细胞株对顺铂的耐药性。报告在CC用JNJ-40346527处理的A549和H1299细胞形成的菌落百分比的图表₂₅2D测定的剂量和顺铂的指示剂量。三个独立实验的平均值±SE。(F类)JNJ-40346527治疗调节CSF-1R的数量^{销售时点情报系统}细胞。报告CSF-1R数量的直方图^{销售时点情报系统}在先前确定的CC下处理96小时的H1299细胞中的细胞（由FACS评估）₅₀顺铂和JNJ-40346527的剂量。报告了三个独立实验的平均值±SE*=第页< 0.05.

为了将CSF-1和CSF-1R的表达与顺铂处理后CSF-1R表达细胞的持久性联系起来，我们使用了针对CSF-1R或CSF-1的siRNA，并评估了在稳态和顺铂处理后耗尽受体/配体对细胞克隆能力的影响(补充图S2A–S2B). 我们在用针对CSF-1或CSF-1R的siRNA转染的H1299和H1975细胞中观察到集落形成显著受损（与扰乱的对照相比）。亚毒性剂量（CC）的顺铂治疗显著增加了这种效应₂₅) (补充图S2B). 最后，通过用编码配体非依赖性、组成型活性CSF-1R受体的表达载体转染H1299和H1975细胞，部分挽救了敲低CSF-1R对肺癌细胞克隆性的影响CSF-1R型L301S型/Y969F型[52,53] (补充图S2B).

为了将上述结果转化为更具临床相关性的设置，我们评估了“临床试验”级CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂（TKI）（JNJ-40346527）的效果[48,49]四种代表性肺癌细胞系的克隆原性研究。首先，我们发现TKI治疗揭示了JNJ-40346527治疗对Tyr数量的剂量依赖性影响⁷²³磷酸化CSF-1R（图​（图2C），2摄氏度)在亚微摩尔剂量下，对形成的菌落数量有伴随影响（图​（图2D，二维上下面板）。接下来，我们测试了TKI治疗是否会使细胞对顺铂的作用敏感。用增加剂量的顺铂和JNJ-40346527联合治疗细胞，后者在先前确定的CC中₂₅剂量（表​（表2），2)，显示顺铂的作用增强（图​（图2E）。尤其是，2个).值得注意的是，当使用无关的CSF-1R TKI，BLZ-945时，我们观察到非常相似的化学增敏作用[54,55] (补充图S3A). 因此，抑制CSF-1R可能会损害肺癌细胞系的克隆形成性和化疗耐药性。这与CSF-1R的坚持相呼应^{销售时点情报系统}顺铂处理的样本中的细胞，并显示抑制部分细胞中的CSF-1R会影响细胞系对化疗诱导的细胞死亡的集体抵抗力。

抑制CSF-1R会影响耐药CSF-1R的数量^{销售时点情报系统}细胞

由于TKI的化学增敏作用可能通过改变CSF-1R的数量发生^{销售时点情报系统}细胞，我们通过FACS评估CSF-1R的数量^{销售时点情报系统}在先前确定的CC处处理96小时后的细胞₅₀JNJ-40346527和顺铂单独或联合用药的剂量（表​（表2）2)（图​（图2F）。2楼). 如图所示​图2B）2B型)CSF-1R^{销售时点情报系统}顺铂治疗后细胞存活。JNJ-40346527治疗显著减少CSF-1Rpos细胞的数量(第页< 0.05); 然而，当顺铂和TKI同时给药时，这种效果要强烈得多（图​（图2F）。2楼). 对CSF-1R的类似影响^{销售时点情报系统}当CSF-1或CSF-1R被siRNA耗尽时，观察到细胞(补充图S2C)这意味着，由于配体/受体水平较低或其激酶活性受到抑制，表达CSF-1R的细胞数量减少可能是TKI化学增敏作用的基础。

CSF-1R TKI影响治疗肺癌细胞的成球能力

细胞在锚定无关、克隆密度和无血清培养基中的生长丰富了表达干细胞样标记物和化疗耐药基因的祖细胞样细胞亚群[56]. 因此，我们评估了JNJ-40346527治疗对治疗肺癌细胞系的球体形成效率（SFE）的影响。更具体地说，我们评估了JNJ-40346527的作用（在先前确定的CC₅₀)通过在上述条件下对原始细胞亚群进行连续传代获得的第二代和第三代球体的形成。这表明TKI对4个代表性细胞系的成球效率（SFE）有非常显著的影响，这些细胞系对TKI的影响具有类似的动力学反应（图3A–3B级). 为了详细说明这些观察结果，我们评估了JNJ-40346527对SFE的影响是否伴随着EMT/茎样标记和化疗耐药基因的调节，如定量PCR评估的那样。这表明TKI处理的H1299和H1975细胞中CD44、OCT4、SOX2、NANOG、VIMENTIN、MMP-9和ABCG2分别显著下调。此外，我们观察到JNJ-40346527治疗增加了p21的水平，降低了Cyclin D1和c-MYC的水平（图​（图3C，3C公司，热图）(第页< 0.05). 值得注意的是，后一种基因的启动子最近被证明与SKBR3乳腺癌细胞中的CSF-1R结合[37]. p21水平的增加与JNJ-40346527处理样品中观察到的抗克隆效应相关。联合治疗（TKI+顺铂）强烈增加了p21的水平，并在更大程度上影响了EMT/化疗耐药基因的水平（图​（图3C）。3C公司). 当使用无关的BLZ945化合物时，我们观察到非常相似的效果(补充图S3B). JNJ-40346527单独或与顺铂联合治疗后，H460细胞中所有上述变化均在整体上减弱（图​（图3C）。3C公司). 如图所示​图1，1，H460细胞缺乏可检测的CSF-1/CSF-1R（图​（图1）。1). 这表明，至少部分地，观察到的基因表达变化可能源于CSF-1R信号的直接抑制。

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图3

抑制CSF-1R影响肺癌细胞的某些原癌特征

(A类)CSF-1R抑制会影响球形细胞在3D培养中的增殖。H1299培养物在无血清、无粘附条件下，在存在生长因子的情况下连续繁殖的代表性显微照片。球体形成效率（SFE）计算为形成球体/种子细胞比例尺的百分比：100微米。(B类)报告4个代表性细胞系经递增剂量JNJ-40346527处理后的成球效率（SFE）的图表。两个独立实验的平均值±SE。(C类)抑制CSF-1R会影响癌症相关mRNA的水平。热图。定量PCR。H1299和H1975细胞（表达CSF-1R）和H460细胞（不表达受体）经载体或JNJ-40346527单独或与顺铂（CC）联合治疗24小时后，所示基因的mRNA水平₅₀). 请注意，在处理24小时后，收获时（24小时）未观察到明显的细胞死亡（数据未显示）。(D类——F类)抑制CSF-1R影响耐药ALDH的数量^明亮的细胞。（D） H1299在载体或JNJ-40346527存在下用顺铂治疗72小时的代表性点图（分别为上下面板）。ALDH高表达细胞是指在添加合成的ALDH底物BAAA后，与含有ALDH抑制剂DEAB（二乙氨基苯甲醛）的对照染色反应相比，荧光更强的细胞（右面板）。（E） 报告ALDH数量的直方图^明亮的在指定的处理96小时后，从四个具有代表性的细胞系中提取细胞。对每个分析样本减去DEAB处理细胞获得的背景染色。报告了三个独立实验的平均值±SEM。（F） 定量PCR。JNJ-40346527（CC）处理的H1299细胞中指示的ALDH亚型mRNA水平₅₀)在有无顺铂的情况下，持续24小时。使用PP1A作为内部对照。报告了两个独立实验的平均值±SE。在不显著（ns）时显示统计差异。H1975细胞获得了非常相似的结果（数据未显示）。

CSF-1R-TKI治疗影响化疗耐药ALDH的数量^明亮的细胞

此外，我们评估了JNJ-40346527对肺癌细胞株和标本中表达的醛脱氢酶（ALDH）活性的影响[57,58]. ALDH是一种解毒酶，其表达可提供应激抵抗力，并鉴定多种肿瘤中的抗治疗细胞亚群[59——62]. FACS分析显示，四分之四的代表性肺癌细胞株中有四个含有ALDH^明亮的细胞和ALDH数量增加^明亮的根据表达ALDH的细胞的化学抗性性质（96小时，第页< 0.05; 图​图3D）。三维). JNJ-40346527治疗（CC₅₀)显著影响ALDHbright细胞的数量，当TKI与顺铂联合应用于细胞时，这种影响更为强烈（图​（图3E）。第三方). 缺乏诱导的ALDH活性可能部分解释了JNJ-40346527治疗的化学增敏作用。事实上，定量PCR分析显示，肺癌细胞系中表达的两种主要ALDH亚型的mRNA，即ALDH1A3和ALDH1A1[57,58,63]TKI治疗显著降低了，这强烈阻碍了顺铂的诱导(第页<0.05）（图​（图3F）。第三层). ALDH2亚型的mRNA水平不受顺铂和TKI治疗的影响，而ALDH2异构体的mRNA浓度并不表示对治疗产生耐药性。因此，CSF-1R抑制可能会强烈影响靶向肺癌细胞培养中祖细胞样人群的生存和耐药性，这进一步支持了观察到的化疗增敏效应。

CSF-1R抑制影响肿瘤生长体内

一些人认为球体形成试验是肿瘤发生的替代物体内[64]因此，我们之前的观察可能揭示CSF-1R TKI的潜在用途体内。这鼓励我们在体内设置。为此，我们在注射荧光素酶表达-H1299细胞的NOD-SCID小鼠中建立了肿瘤异种移植（图​（图4）。4). 肿瘤达到≥100 mm时开始治疗^三体积（第14天）。JNJ-40346527（20 mg/Kg，口服灌胃，每天一次，持续16天，从第14天开始）单独或与顺铂联合给药（4 mg/Kg，在第16天和第23天腹腔注射）(补充图S4A). 活体内成像显示，JNJ-40346527治疗影响了植入肿瘤的生长，其效果与单用顺铂相当（图​（图4A4A级上下面板：第页与车辆相比<0.05）。然而，当TKI与化疗相结合时，效果比单一治疗强得多（图​（图4A4A级 第页<0.05），表明具有协同效应在体外观察。第48天pi时对切除肿瘤的大小和干重的评估证实了成像数据，并显示联合给药JNJ-40346527和顺铂的小鼠切除的肿瘤重量显著降低（图​（图4B，4B类上下面板）。此外，分离和合并肿瘤细胞胞浆切片的染色(n个=4），具有增殖标记物Ki-67，在联合治疗后，Ki-67表达细胞的数量显著减少，JNJ-40346527和顺铂作为单一药物给药于荷瘤小鼠时表现出较弱的活性（图​（图4C）。4摄氏度). 一般来说，顺铂和JNJ-40346527治疗都会影响小鼠的体重。这是一种可逆的现象，因为小鼠在停止治疗后恢复了体重(补充图S4B).

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图4

CSF-1R抑制影响肿瘤生长

(A类)上部面板。代表性显微照片。腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg），并在细胞注射（p.i）后第36天对麻醉小鼠进行成像。下部面板。报告各组在时间（第9天、第23天、第35天、第42 p.i.）内发出的平均光子的图表。每组报告的平均±SE*第页< 0.05. (B类)上面板：第42天p.i.从载药（左面板）和顺铂+JNJ-40346527（右面板）治疗小鼠中切除的肿瘤的代表性显微照片。比例尺：10毫米。下部面板。报告所有组在第38天p.i切除肿瘤的干肿瘤重量的图表。报告各组小鼠的平均值±SE。p值每个配对组报告s。(C类)CSF-1R TKI影响治疗肿瘤的增殖。左侧面板。从分解和合并的肿瘤中获得的单个细胞进行胞浆染色，并用抗Ki67抗体染色。显示Ki-67平均值±SE的直方图^{销售时点情报系统}每个治疗组的细胞数。(D类)JNJ-40346527治疗肿瘤的靶向参与。CSF-1R TKI针对人类CSF-1R^{销售时点情报系统}细胞和小鼠CD45^{销售时点情报系统}细胞。报告人类CSF-1R百分比的直方图^{销售时点情报系统}细胞和小鼠CD45的百分比^{销售时点情报系统}通过分泌物肿瘤的FACS染色评估细胞。报告各组小鼠的平均值±SE。

试剂

顺铂（美国得克萨斯州塞勒克化学公司）根据制造商的说明进行了溶解。JNJ-40346527由Janssen Research&Development善意提供，并溶解在DMSO中。对于体内研究表明，根据供应商的说明，JNJ-40346527在用于口服灌胃之前溶解在0.5%的Methocel中。

ALDH活性测定

ALDEFLOUR试剂盒（加拿大温哥华干细胞技术公司）是根据制造商的说明使用的。ALDH阳性细胞是指在添加合成的ALDH底物BAAA后，与含有ALDH抑制剂DEAB（二乙氨基苯甲醛）的对照染色反应相比，荧光更强的细胞。在一些实验中，排除了SYTOX红细胞染色阳性的死细胞（纽约州格兰德岛生命科技公司）。

流式细胞术

用PBS1X/EDTA 2mM分离细胞，用4%PFA固定（冰上10分钟），用PBS1X洗涤两次，再悬浮1×10进行抗体染色⁶PBS1X/BSA中细胞/100 uL，1%。根据制造商说明，使用SYTOX-橙色染料（Thermo Scientific）进行活细胞/死细胞鉴别。为了排除>99%的背景染色（基于同种型染色的样品），绘制了门（在活细胞群体中）。使用FACS CALIBUR仪器（BD Biosciences）获取数据，并使用Summit 5.0.0（美国加利福尼亚州安捷伦科技公司达科）进行分析。对于CSF-1R染色，使用偶联的抗CD115-APC及其高度吸附的同种型匹配对照（Biolegend）。

细胞因子定量

基于ELISA的细胞因子定量试剂盒用于条件培养基中分泌的CSF-1（台湾台北市Abnova）和IL-34（美国加州BioLegend）。

siRNA

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen-GIBCO）将沉默剂预先设计的siRNA CSF-1和siRNA IL-34（Ambion-Life Technology，Foster City，CA，USA）转染到肺癌细胞中。

RNA提取

使用RNEasy minikit提取总RNA（德国希尔登市齐根）。

cDNA合成与基因表达

第一链cDNA是根据制造商的说明合成的（高容量RNA-to-cDNA试剂盒；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）。在StepOne仪器上使用SYBR绿色染料（Applied Biosytems）通过实时PCR测量基因表达。qPCR引物在补充表S1和之前描述的[47,62,78]. PPIA被用作内源性对照。

集落形成试验（CFA）

肺癌细胞株生长到70%的汇合处，并用指定的药物进行脉冲处理或按指定进行转染。16小时后，将细胞分离并以500–1500个细胞/孔接种到无药培养基（2ml培养基/孔）中的6孔培养皿中。每三天添加一次新鲜培养基（25%）。用结晶紫（SIGMA）对菌落进行染色，并在7-14天后计数菌落（>50个细胞）（这种大范围反映了每个肺癌细胞系菌落增殖的差异）。对于3D克隆形成分析，将细胞放置在不依赖锚定和无血清条件下的DMEM-F12/1:1+谷氨酰胺中，补充有BSA和EGF（10ng/ml）以及FGF-2（10ng/ml）（生命科技），如前所述[56].

细胞溶解、免疫沉淀和蛋白质印迹

简单地说，在细胞裂解缓冲液中裂解细胞：50 mM Tris-HCl（pH 8）、2%SDS、50 mM NaCl、1 mM EDTA和10%甘油，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche），以生成总细胞提取物。使用以下抗体进行免疫印迹：兔抗CSF-1R（C-20）（圣克鲁斯生物技术公司）；抗人CSF-1R抗体（1:800，HPA012323）（意大利米兰SIGMA-Aldrich）；抗磷酸化CSF-1R（tyr723）抗体（细胞信号）；小鼠抗TUBULIN（Santa Cruz Biotechnology）被用作负荷控制。在免疫沉淀研究中，使用了针对CSF-1R的小鼠单克隆抗体（D-8，Santa Cruz Biotechnology）。为了化学发光检测二级抗体，使用了Western Bright ECL HRP底物（ADVANSTA，Menlo Park，CA，USA）。

动物研究

5×10的悬浮⁶将H1299细胞皮下注射于PBS1X/Geltrex（BD Bioscience）中至5周龄雄性NOD/SCID小鼠（Charles River，意大利）。每7天测定一次小鼠的体重和临床症状。在细胞注射（pi）后第9、23、35、42天进行活体内成像（IVIS）。第9天（当肿瘤已经可以触及时）的数值用于将每只小鼠分配到同质组。小鼠腹腔内注射赋形剂（methocel，0.5%）、顺铂（4 mg/kg，每周一次/14天，从第16 pi天开始）、JNJ-40346527（20 mg/kg经口灌胃，每天一次，16天，从14 pi天起）、顺丁+JNJ-40.346527。所有动物工作均按照纽约大学指南并经IACUC批准进行。

肿瘤分解

新鲜切除的肿瘤在用Accutase（干细胞技术，加利福尼亚州温哥华）酶分解2小时之前被手动切碎，然后混合。通过用抗人Ki-67抗体（1:300，克隆MIB-1）（Dako，CA，USA）在分解的肿瘤的细胞旋切片上用Ki-67免疫组织化学定量来评估细胞增殖。通过对10个随机选择的至少含有100个细胞的区域进行目视检查，对阳性细胞进行评分。对于肿瘤衍生细胞的FACS分析，使用抗人CSF-1R抗体（1:200，HPA012323）（SIGMA Aldrich，Milan，Italy）和抗小鼠CD45抗体（1:100，ABCAM，Cambridge，UK）

我们感谢Martine Roussel（美国田纳西州孟菲斯市圣裘德医院）提供CSF-1R L301S/Y969F表达结构。我们感谢Simona di Martino和Carla Azzurra Amoreo（意大利罗马Regina Elena癌症研究所）在体内研究及其有益的考虑。