NIH全长cDNA项目的现状、质量和扩展：哺乳动物基因收集（MGC）

其他生物体收集状况

基于这些特征鲜明的人和鼠的完整ORF克隆的实用性以及科学界对来自其他生物体的完整ORF-克隆集的渴望，MGC最近扩大了其范围，将大鼠包括在内。此外，MGC管道正用于支持从青蛙中生成此类克隆（参见http://xgc.nci.nih.gov/Info/)和斑马鱼（见http://zgc.nci.nih.gov/Info/). 这些项目的目标和进展总结如下表1B虽然他们使用MGC基础设施，但每个项目都是单独管理的(Klein等人，2002年;Rasooly等人，2003年). 这三个项目的目标与人类和小鼠项目的目标不同，因为它们的目标不是捕获代表这些生物体所有基因的克隆。根据在生成人类和小鼠标本方面获得的经验，通过使用已经制定的随机选择协议以及明智地使用来自不同发育阶段和组织的15-20个文库，这些更有限的目标应该很容易实现。

人和小鼠克隆的分析

人类和小鼠的ORF平均大小分别为1186和1299 nt。这些大小小于RefSeq ORF的平均大小，人类为1607 nt，小鼠为1437 nt（L.Wagner，未解释）。规模差异表明，大型ORF目前在MGC中的代表性不足。与参考序列相比，MGC克隆的尺寸分布可在补充材料#1中找到；应该注意的是，该集合确实包括具有大CDS的几个克隆。此外，MGC在罕见的抄本（补充材料#2）中的代表性不足，这在随机抄本抽样方法中是意料之中的。Ohara等人(1997)生成长度为3-10 kb的大小选定的cDNA文库，以克隆大型转录物。迄今为止，他们分离并完全测序了1954个cDNA，平均ORF为2905 nt。

有8412个人类基因与小鼠同源，7808个小鼠基因与人类同源。对于5351个基因，从这两种生物体中获得了克隆(图1). 由于这种重叠约占每组的三分之二，克隆选择协议显然在很大程度上没有偏向于在两种生物体中选择相同的基因。由于小鼠项目包括相当多的早期开发cDNA文库，而人类项目没有，因此可以预期胚胎期特异性克隆将在小鼠集合中得到丰富。然而，有趣的是，仅在小鼠而非人类中获得克隆的基因在胚胎中既没有得到更高的表达，也没有得到胚胎特异性表达的富集（数据未显示）。

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图1

同源人类和小鼠基因与代表性MGC克隆的重叠。按照方法进行分析。有8412个人类基因与小鼠同源，7808个小鼠基因与人类同源。在8%的组中，同源基因组的数量可能包括同源基因以外的同源基因。

将MGC集合中代表的人类基因集与RefSeq数据库中的综合、注释、非冗余基因集进行比较(普鲁特等人，2000年). RefSeq包含11233条人类基因，根据两份或多份独立出版物，这些基因被视为具有生物学意义的转录物。MGC包含9081个候选基因。这种高频率表明，基于随机EST的策略在识别已知基因的完整ORF克隆方面非常成功。此外，还恢复了大量以前未经特征化的全ORF序列，其功能尚不清楚。然而，这种方法现在已经达到了人类回报递减的程度，并且正在达到老鼠采集的饱和状态(图2). 因此，对于这两种生物，该项目现在必须转向更直接的策略，以获得缺失基因的克隆。

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图2

基因捕获的进展。数量(A类)人类和(B类)显示了小鼠完整ORF MGC克隆以及这些克隆在项目生命周期内代表的基因数量。(插入)按时间顺序排列的EST数量。来自先前数据集的EST，包括来自CGAP的人类和小鼠cDNA库(Schaefer等人，2001年;斯特劳斯伯格2001,Strausberg等人，2002a)用于启动MGC项目。

评估了两种定向策略。第一种是基于缺失基因的组织表达分布的测定（数据未显示）。从胎盘组织中制作了一个标准化和消减的cDNA文库，其中表达了许多缺失的基因。然而，代表它们的克隆的产量太低，无法使这成为一种实用的方法。具体来说，在16800个EST读数中，该项目为已知基因（0.6%）确定了101个全长克隆用于全长测序。在第二种方法中，使用基因特异性引物扩增表达组织转录物的编码区，然后将PCR产物克隆到cDNA载体中，并对每个基因的多个候选基因进行测序。初步研究表明，这种方法可以恢复50%到80%的缺失基因(Baross等人，2004年;Wu等人，2004年)，尽管很可能很难获得分数。

除了特征明确的转录本外，MGC项目还将研究另外两类缺失基因。第一种包括推测的、计算机预测的基因，这些基因有一些实验证据证明转录物的存在（例如一个或多个EST，或通过大规模项目生成的无特征cDNA）。第二类是完全基于计算方法的从头开始基因预测。

人和小鼠MGC克隆的验证

参考人类基因组序列的可用性(Lander等人，2001年;Venter等人，2001年; 国际人类基因组测序联合会（正在筹备中），小鼠基因组序列的预先草案(Waterston等人，2002年)以及丰富的人类EST和其他克隆序列库(Adams等人，1991年;Boguski等人，1993年;威廉姆森1999;Brentani等人，2003年)为更详细地分析MGC克隆的质量提供了机会。MGC克隆序列与完成的人类基因组序列的比较显示，编码区中每1147个位置大约有1个位置存在差异，频率为0.00087。这些差异可能是由于生物原因（例如，自然变异，预期核苷酸序列多样性为0.00075；Bamshad和Wooding 2003)，转录后信使核糖核酸编辑(公园2000;Schaub和Keller 2002;Anant等人，2003年)或一个或多个实验伪影。在组织培养、RNA制备、文库生成（由于逆转录酶或DNA聚合酶缺乏保真度）、克隆繁殖或cDNA或基因组测序的细胞生长过程中，可能会出现实验伪影。由于MGC克隆的序列质量非常高（误差频率<1/50000nt），序列质量不是主要的误差来源。在观察到的与人类基因组的差异中，32%与多态性数据库dbSNP中记录的变异一致(Sherry等人，2001年;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP网站). 由于目前并非所有人类变异都在dbSNP中表示，毫无疑问，MGC克隆中还有其他变异代表真正的生物变异。因此，我们得出结论，MGC克隆和人类参考序列之间观察到的序列差异的很大一部分代表了人类种群的自然变异。

利用cDNA序列与基因组的比对，分析了两种特殊情况，在这两种情况下，基本上所有可能的序列都应该是已知的，因此，预计不会出现显著的新变异。对这些病例的分析应提供对克隆质量的独立估计。第一个涉及HLA基因克隆；由于之前对该基因座的研究程度，在MGC中应该很少发现新的等位基因。28个MGC HLA克隆中24个克隆的序列编码了与已知多态性相对应的氨基酸组成，表明至少85%的HLA MGC克隆对应于已知人群中存在的变异。

第二个案例代表了一种情况，即人口多态性应该降低到一个非常低的水平。将从近交系C57BL6/J非标准化、高质量cDNA文库中分离的小鼠MGC克隆与同一小鼠株的完成序列进行比较。这里，97%的MGC克隆完全对齐，估计错误率为1/77000 nt。由于这与序列准确性本身有关，这意味着这些MGC克隆中几乎没有其他类型的错误。然而，其他C57BL6/J文库也与基因组序列不匹配。归一化文库中克隆的差异率为1/650 nt，而通过旨在丰富长全长克隆的协议制作的几个文库的总差异率为1/1253 nt。这些数据表明，cDNA文库合成协议对最终产品的错误率有很大影响（见下文）。

人类克隆验证的另一种方法是分析观察到的编码变化的性质。编码区上的选择性压力将不利于改变氨基酸的多态性（非同义或NS改变）。因此，与PCR、克隆或逆转录酶错误引起的单个克隆的人为变化相比，MGC中生物学有效的变异预计显示更少的NS变化。如果MGC克隆中的核苷酸差异是完全随机的，转换：转换比为4:1，则非同义部分(（f）_NS公司)将为0.71（D.Lipman和L.Wagner，不容置疑）。然而，事实上（f）_NS公司是0.52，这表明错义变化实际上是被选择来反对的。然而，应将其与观察到的（f）_NS公司对于dbSNP中的所有编码SNP，该值为0.43，并已通过一组基因组DNA样本的测试进行验证（S.Sherry和L.Wagner，未提交）。假设观察到的差异是伪影和多态性的混合，则得出简单的公式：

因此，实验引入了整个MGC中约32%的非同义变体。

在另一种评估MGC克隆和参考人类基因组之间观察到的序列差异是否为人为来源的可能性的方法中，还将MGC cDNA序列与黑猩猩的部分完整序列进行了比较(黑猩猩;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview网站;网址：http://www.ebi.ac.uk/embl/indiex.html)基因组来确定任何已确定的核苷酸差异是否与祖先的等位基因相匹配。大约24%的非同义cDNA等位基因与平移等位基因。在这些情况下，可以得出结论，人类cDNA和基因组序列之间的差异可能是多态性（或者，很少是基因组序列中的错误），因此，这些cDNA被认为是有效的。

由文库提供商对NS编码改变的人类克隆进行分类，确定了核苷酸差异的一个潜在来源。结果(表2)表明图书馆来源对观察到这种差异的速度有显著影响。尽管这一现象没有进一步调查，但有趣的是，序列差异率最高的库制造商#4使用了热稳定逆转录酶，并执行了减法和标准化协议，其中第二链合成是由热稳定聚合酶完成的，而其他制造商没有使用这两种酶中的任何一种。

有1980个人类基因仅由MGC克隆表示，与参考基因组相比，该克隆至少有一个NS替代，而dbSNP中不存在NS替代。MGC编码蛋白和基因组编码蛋白之间的氨基酸差异可能是由于多态性、克隆伪影和序列错误的混合。实际的测序错误可能很罕见，而且由于前面列出的实验参数，大多数克隆伪影可能在MGC克隆中。当cDNA克隆中人类基因组的差异与相应的平移序列中，20%的MGC克隆与黑猩猩完全一致，因此这些可能代表真正的多态性。但对于真正的多态性，期望是平移序列将以相同的频率匹配cDNA和基因组序列。因此，通过推断，另外20%的MGC cDNA克隆可能携带生物学上有效的NS变化，尽管不可能确定这些是哪些克隆。这在MGC中留下了约1200个人类基因（占总收集量的10%），其中NS变化可能是由于实验伪影。值得注意的是，考虑到热稳定聚合酶、逆转录酶和生成全长cDNA克隆的各种协议的其他组成部分不可避免的非零错误率，在任何cDNA集合中都可能在某种程度上发现这些相同的伪影。

本节中的结果说明了在确定MGC克隆与参考基因组相比对核苷酸差异的各种生物和实验贡献程度方面的挑战。每个分析都使用不同的数据子集，因此，不可能直接比较结果。此外，对于人类来说，罕见的多态性很难确定，与祖先基因组的比较也受到后者差距的限制。在小鼠克隆的情况下，只有14个文库来自与基因组序列相同的菌株，因此，分析中使用的克隆数量不是很大。

克隆特征分析期间发现的变异使得必须在每个MGC克隆的每个GenBank记录中包含详细注释。因此，每个人类克隆记录现在都包括以下内容：与参考人类序列的每个核苷酸差异的识别、推断的氨基酸变化（如果有）以及dbSNP参考编号（如果变体已经记录在案）。未来，将添加差异的其他属性，包括保守基序内的变化和祖先等位基因的存在，以及小鼠记录的注释。

全ORF候选克隆的文库特征、筛选、选择和测序

前面已经描述了核心方法(Strausberg等人，2002b). 最近对管道的修改包括：（1）不生成3′-序列爪蟾项目，其中约40%的克隆具有3′-读；（2） 每个文库中2000-5000个克隆在5′端测序，如果一个文库被认为是高质量的，则添加5000个克隆。全插入测序克隆的鉴定爪蟾和达尼奥基于以下标准之一：针对特征明确、完整的mRNA进行BLAST搜索；起始甲硫氨酸的存在和在至少100nt上的至少95%同一性的比对；或者翻译BLAST搜索来自基因组测序的生物体的蛋白质，该基因组测序既需要起始蛋氨酸，也需要序列与e（电子）-值最多为10^-6，除了蛋白质N末端的区域。这个区域是例外的，因为许多远缘同源基因没有很好的保守的N末端，如果不对齐的长度相同，克隆可能是全插入测序的候选基因X.laevis，X.热带，或斑马鱼cDNA和同源蛋白。选择大鼠克隆与描述的相同爪蟾和达尼奥，但要求与5′端同源，因为大鼠和小鼠的同源性至少为93%(Makalowski和Boguski 1998年). 通过所述的三种方法之一进行全长测序(Strausberg等人，2002b)精确度小于每50000 nt 1个错误。MGC项目生成的GenBank登录号可在补充材料#4中找到。

核苷酸差异的测定

将所有人类和小鼠MGC克隆的序列与原始生物体的基因组序列对齐（人类为NCBI构建34，小鼠为NCBI-构建31），并记录MGC克隆与基因组序列之间的所有差异。使用了具有典型剪接位点识别的基因组序列上每个克隆的最佳位置。在ORF中，通过使用MGC克隆的蛋白质编码序列，所有差异被确定为同义或非同义。这些差异与dbSNP v.117中记录的已知mRNA变异相对应(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP网站/)，已识别。最后，人类MGC克隆与P.三角石生成基因组以鉴定祖先等位基因。由于进化距离和黑猩猩基因组连续序列的未完成状态，使用了至少98%一致性的非重叠局部比对平移基因组。

其他生物信息学和MGC网站

张元熙，⁵史蒂文·雪莉，⁵Mike Feolo，⁵莱昂妮·米斯奎塔，⁵爱德华多·李，⁵基里尔·罗特米斯托夫斯基，⁵苏珊·格林胡特，⁴卡尔·F·谢弗，¹¹Kenneth H.Buetow，¹¹汤姆·邦纳，¹⁷David Haussler，¹²吉姆·肯特，¹²马克·迪坎，¹²特里·福雷，¹²和迈克尔·布伦特¹³

cDNA克隆管理

Christa Prange，¹⁴Kirsten Schreiber，¹⁴和尼科尔·夏皮罗¹⁴

mRNA制备

纳拉扬·K·巴特¹⁰和拉尔夫·霍普金斯¹⁰

cDNA文库制备

弗洛伦斯·谢，¹⁵汤姆·德里斯科尔，¹⁵M.Bento Soares先生，¹⁶玛丽亚·博纳尔多，¹⁶Tom L.Casavant，¹⁶Todd E.Scheetz，¹⁶Michael J.Brown-stein，¹⁷特德·B·乌斯丁，¹⁷Shiraki Toshiyuki，¹⁸皮耶罗·卡尼奇，¹⁸玉兰飘，¹⁹达伍德·B·杜德库拉，¹⁹Minoru S.H.Ko，¹⁹川上光一，³²铃木裕隆，²⁰Sugano Sumio先生，²⁰C.E.Gruber，²¹M.R.史密斯，²¹布莱克·西蒙斯，²²特洛伊·摩尔，²²理查德·沃特曼，²³斯蒂芬·约翰逊，²³阮怡君，²⁴贾林伟，²⁴和S.Mathavan²⁴

cDNA全插入测序

哺乳动物基因收集计划是国家卫生研究院的一项跨机构工作，得到国家卫生研究所内许多独立研究所和中心的财政和科学支持。MGC网站上提供了这些机构的完整列表。特别感谢参与启动该项目的Robert L.Strausberg和Richard D.Klausner。MGC项目得到了外部科学委员会成员的出色指导：芭芭拉·沃尔德、菲利普·夏普、杰弗里·杜克、康妮·塞普科、斯图亚特·谢勒、林肯·斯坦、罗纳德·戴维斯、理查德·克劳斯纳和爱德华·哈洛。XGC项目得到了Aaron Zorn、Ken Cho、Bruce Blumberg、Enrique Amaya、Nancy Papalopulu和Jane Rogers的出色指导。ZGC项目得到了咨询委员会成员的出色指导：布鲁斯·伯伦、简·罗杰斯、威尔·塔尔博特、蒙特·韦斯特菲尔德和莱恩·宗。Judy Mietz（NCI）、Michael Chang（NCRR）、Adam Felsenfeld（NHGRI）、Tyl Hewitt（NICHD）、Deborah Henken（NICHD）、Nancy Freeman（NIDCD）、Rochelle Small（NIDCR）、Danilo Tagle（NIND）和Lynn Schriml（NCBI）也做出了额外贡献。霍华德·雅各布的建议和参与使老鼠计划受益匪浅。D.S.G.感谢Cyndy Izadi在编写这份手稿过程中提供的宝贵帮助。根据合同号N01-C0-12400，该项目全部或部分由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金资助。感谢贝勒医学院人类基因组测序中心的成员对该项目的支持。系统生物学研究所的Rachel Dickhoff和Julia Greene提供了有益的讨论和出色的帮助。NIH壁内测序中心的基思·韦瑟比（Keith Wetherby）、拉塞尔·皮尔森（Russell Pearson）、妮可·迪特里希（Nicole Dietrich）、佩吉·广（Peggy Kwong）和斯蒂芬·格拉尼特（Stephen Granite）提供了卓越的技术和计算帮助。特别感谢斯坦福大学人类基因组中心的许多贡献成员对该项目的支持。感谢不列颠哥伦比亚大学基因组科学中心的以下成员在cDNA测序和有益讨论中作出的宝贵贡献：J.Asano、S.Chan、N.Girn、R.Guin、R.Kustsche、S.Lee、K.MacDonald、C.Mathewson、T.Olson、P.Pandoh、A.-L.Prabhu、L.Spence、J.Stott、S.Taylor、K.Teague、M.Tsai、G。Yang和S.Zuyderduyn。