微RNA水平、靶位点互补性和协同性对竞争性内源性RNA调控基因表达的影响

靶mRNA的去抑制发生在增加靶位点的高阈值

MRE之间对miRNA结合的竞争预计不仅发生在m樱桃色mRNA，但也在添加的MRE和内源性靶点之间。为了检测对内源性靶点的影响，转染miR-293或miR-92的0s或3s报告基因的ESCs根据其eYFP表达被分为三个箱子(图S1A、 在线提供）。每个箱子的RNA测序（RNA-seq）显示了每个细胞添加的MRE数量，以及3s报告基因与0s报告基因相比细胞内源性mRNA水平的差异。根据TargetScan 6.2的context+模型对miRNA的预测反应强度，对具有预测MRE的内源性mRNA进行分组(Garcia等人。，2011). 对于中部，而不是下部，箱子（1.4×10⁴和0.85×10⁴每个细胞分别添加miR-293 MRE），内源性miR-292靶点被解除表达，如预测的最高miR-293mRNA折叠变化值分布的显著变化所示(图1D–1F和S1（第一阶段）D–S1F；表S1). 同样，在超过1.3×10之前，未观察到令人信服的miR-92靶点去表达⁴添加了miR-92 MRE(图1G–1I和S1（第一阶段）G–S1I）。

通过qRT-PCR（qPCR）测量mCherry和eYFP荧光与相应转录副本数的比较，发现荧光与mRNA丰度高度相关，尽管这种关系不是一一对应的(图1J） 。由于蛋白质荧光强度是一种间接读数，与mRNA和miRNA水平上发生的竞争没有直接关系，我们将流式细胞术测量的荧光值转化为图1B通过使用图1J型(图1K和S1（第一阶段）J） 。引人注目的是，miR-293和miR-92报告者的DRT为0.9×10⁴和1.3×10⁴每个细胞的位点；图1K和1L）与RNA-seq观察到的内源性靶点相似，从而验证了内源性靶蛋白去表达的报告输出（将荧光转化为转录副本数后）。

接下来，我们计算了每个细胞必须添加的MRE数量，以观察到半最大抑制浓度₅₀)不同的记者结构(图1K和1M）。据报道，每个ESC的miRNA分子数量为5.7×10⁴对于miR-294，2.6×10^三对于miR-293，1.7×10^三对于miR-92和1.8×10^三用于miR-16(Bosson等人。，2014)这与小RNA-seq测定的ESCs中这些miRNAs的相对水平一致(图S1L；表S2). 因此，正如在肝细胞中观察到的miR-122(Denzler等人。，2014)、IC₅₀值超过了每个ESC的miRNA分子数。在这种制度下，IC₅₀提供了有效内源靶区丰度的经验测量，因为当竞争位点达到与内源位点的有效浓度相匹配的有效浓度时，应实现半最大降压(Denzler等人。，2014).

在肝细胞中，miR-122 IC₅₀(4.5 × 10⁵每个细胞的位点）恰好对应于转录组的所有3′UTR 6-、7-和8-nt位点的总和，这导致了这样的想法，即这个总和被定义为TA_应用程序，可以估计其他miRNA的有效靶区丰度(Denzler等人。，2014). 为了验证这个想法，我们检查了新确定的IC之间的对应关系₅₀值和TA_应用程序ESC转录组的值。将RNA-seq数据与m樱桃色,电子YFP和三个不同表达的基因，观察到线性关联(图S1K） ，它提供了一条标准曲线，将RNA-seq数据转化为每个细胞的绝对mRNA拷贝，使TA_应用程序待确定的8个活性ESC miRNA的值(图1N） ●●●●。对于所有四个带有IC的miRNAs₅₀值，TA_应用程序接近IC₅₀，在IC上方约2倍₅₀（miR-16、-92和-294），比IC低1.5倍₅₀（miR-293）。因为TA值是通过交联估算的(Bosson等人。，2014)与TA密切相关_应用程序值(图S1M和S1N），但较低约7倍，交联免疫沉淀（CLIP）估计的TA值对于估计有效靶区丰度的目的信息不多。我们的结论是，转录组中3′UTR6-、7-和8-nt位点的总和提供了内源性靶位点有效丰度的合理近似值。

DRT在TA的12%（miR-92）和30%（miR-293）之间_应用程序重要的是，没有内源性转录物对转录组TA有如此大的贡献_应用程序检测的ESC miRNAs。最大的贡献者是核糖体蛋白S15A(15a卢比)mRNA，占TA的6.5%_应用程序对于miR-294和miR-16(图1O） ●●●●。因此，在ESCs和肝细胞中(Denzler等人。，2014)ceRNA通过上调或下调单个转录物来调节基因表达的可能性不大。在HEK293细胞中也报告了类似的结果(Yuan等人。，2015).

降压阈值对miRNA活性的变化不敏感

混合亲和力模型和层次亲和力模型之间的一个关键区别是miRNA水平对检测目标基因去表达所需阈值的影响(Bosson等人。，2014,Denzler等人。，2014). 为了研究这个问题，我们在单细胞分析中检查了miRNA活性降低对DRT的影响。除了不同浓度的Antagomir-293（Ant-293）外，还使用0s或3s miR-293报告子转染ESCs。mCherry阻遏作用的减少与Ant-293浓度的增加相关，这证实了经Antagomir处理的ESCs中miR-293活性降低(图2A） ●●●●。肝细胞中miR-122的观察结果(Denzler等人。，2014)、DRT和IC₅₀随着ESCs中miR-293活性的降低，这些值并没有降低(图2B和S2系列A–S2C）。

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图2

抑郁症阈值对miRNA活性的变化不敏感

（A–F）ESCs与miR-293（A–D）、miR-92（E和F。

（A、C和E）20箱eYFP中mCherry荧光平均值（左）和mCherri荧光标准化为0s对照值（右）。

（B、D和F）使用下列等式将（A）、（C）和（E）中显示的蛋白质荧光值转换为每个细胞的RNA拷贝数：图1J.垂直虚线表示DRT。

数据表示所有面板的平均值±SEM。

接下来，我们增加了miRNA活性，并检查了其对DRT的影响。用双荧光报告子和不同浓度的miRNA双链转染ESCs。当根据eYFP荧光或电子青年党mRNA拷贝，我们检测到随着更多miRNA转染，DRT增加(图2C、 2E、，S2D、S2E、S2G和S2H). 然而，与mCherry不同，eYFP不是MRE诱导的好方法，因为它不受miRNA的抑制，因此不能告知细胞中实际表达了多少MRE。事实上，当量化与m樱桃色当转染更多miRNA时，竞争转录物的DRT保持不变(图2D、 2楼，S2系列F、 和S2I）。这些在减少或增加miRNA活性后监测DRT的结果支持混合亲和性模型，在该模型中，含量较少的miRNA不应比含量较多的miRNA更容易受到ceRNA的影响(Denzler等人。，2014).

广泛配对位点比8-nt位点更有效并触发miRNA衰变

我们研究了DRT是否对原代肝细胞中增加的miRNA水平不敏感。通过用表达miR-122前体的重组腺病毒（Ad-miR-122）感染肝细胞，miR-122增加了4倍，导致内源性miR-122靶mRNA水平降低(图S3A–S3C）。为了操纵miR-122 MRE并测量对miR-122靶基因的后续影响，我们增加了miR-122靶标的水平醛固酮酶A(阿尔多A)mRNA使用携带突变位点（Mut）、一个（1s）或三个位点（3s）到miR-122的腺病毒（Ad-AldoA）(图3A） ●●●●。肝细胞在不同的感染多重性（MOI）下受到感染，无论是基础的还是升高的miR-122水平(图3B和第3章D–S3G）。在内源性miR-122水平上，当超过2.1×10时，我们开始观察miR-122靶点的去表达⁵引入了miR-122 MRE(图3C） ●●●●。内源性miR-122水平升高4倍时，DRT没有增加(图3C） 这与我们在ESCs中的观察结果一致。值得注意的是，与ESCs相比，肝细胞中观察到的DRT更高，这是因为肝细胞中的细胞质更大，每个细胞中的mRNA数量也更多。

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图3

广泛配对位点比8-nt位点更有效并触发miRNA衰变

（A） 不同的示意图概述阿尔多A-表达腺病毒构建物。

（B–G）原代肝细胞（n=4）感染了不同的Ad-AldoA1s（B和C）、bu4（D–G）或相应的Ad-AaldoA-Mut对照组基础miR-122水平（B-G）或共同感染的Ad-miR-122（B和C）的MOI。的相对水平阿尔多A（B和D），miR-122靶基因和对照非靶基因(阿波姆)（C和E）或miR-122（F）。垂直虚线表示DRT。miRNA水平与基础miR-122水平下Ad-AldoA-Mut的最低MOI有关。（G） miR-122、miR-16和U6基础miR-122水平的Northern blot分析。

数据表示所有面板的平均值±SEM。另请参见图S7.

我们的发现是，只有在增加的靶位点的高阈值时才会出现去表达，这似乎与一项在HeLa细胞中使用具有近乎完美互补性的“膨胀”结合位点的研究不一致(Mukherji等人。，2011). 我们试图测试与miRNA 3′区完全互补的位点可能产生不同结果的可能性，因为它们介导miRNA降解。肝细胞感染含有突变或隆起（bu4）结合位点的Ad-AldoA(图3A） ●●●●。有趣的是，当压力仅超过5×10时，就已经观察到了减压⁴每个细胞凸起的miR-122 MRE(图3D、 3E、，第3章H、 和S3I），证实隆起位点在影响miRNA活性方面比8-nt位点更有效。突起位点介导的靶向mRNA去表达效率与miR-122水平的降低密切相关，而与miR-16水平的降低无关(图3F和第3章J） 这表明，去表达是由miRNA降解增强而非miRNA结合位点之间的直接竞争诱导的。

靶向介导的miRNA衰变与miRNA的拖尾和修剪有关(Ameres等人。，2010). 事实上，我们观察到miR-122信号减少，有证据表明隆起时出现拖尾和修剪现象，而不是8-nt，种子匹配导致靶基因去表达(图3G和第3章K） ●●●●。这些结果证实，与miR-122 3′区完全互补的隆起位点主要通过miRNA降解而不是与其他结合位点竞争来降低miRNA活性。因此，为了有效，这些突起位点不需要接近miRNA靶位点的有效丰度，而只需要足够丰度，使靶介导的RNA衰变量显著降低miRNA丰度。

let-7、miR-194和miR-192的miRNA靶向去抑制也发生在增加MRE的高阈值

为了考虑其他肝细胞miRNA对ceRNA-介导的基因调控的敏感性，我们首先测量了肝脏中高表达的miR-122和其他六个miRNA种子家族的绝对水平(Denzler等人。，2014). 这些水平范围为3.8×10^三至1.4×10⁵每个单元格的副本数(图4A和S4系列A） 与较小的RNA-seq数据关联良好(图S4B类；表S2). 我们选择了四个不受对照病毒表达影响的家族（let-7、miR-194、-192和-101）(图S4C） 在1.8×10以上表达⁴每个单元格的副本数。为了研究这四个miRNA家族对竞争性RNA干扰的敏感性，我们构建了Ad-AldoA结构，其中miR-122位点被各自miRNA的单个8-nt位点（1s）取代(图4B） ●●●●。我们首先用Ad-AldoA-Mut或1s（let-7）的不同MOI感染肝细胞。通过转染let-7f模拟物验证let-7靶点的去抑制作用(图S4D–S4G），当>2.1×10时观察到⁵每个细胞表达let-7 MRE(图4C、，S4系列H、 和S4I）。该DRT与RNA-seq结果一致(图4D–4F和S4系列J–S4L；表S3). 相比之下，最多可添加10个⁶miR-192、miR-194或miR-101通过各自的Ad-AldoA感染的MRE没有导致可检测到的经验证靶点的去表达(图S4M–S4P；数据未显示），表明内生水平为1.8×10⁵每个细胞的miRNA分子没有给予足够的抑制作用，而去抑制作用可以发挥作用。因此，我们使用重组腺病毒表达（Ad-miR-192/194）在miR-192和miR-194水平升高的条件下进行了类似实验(图S4M） ●●●●。miR-194增加4.5倍将抑制增加到可以观察到目标去抑制的水平，DRT>3.2×10⁵每个细胞增加miR-194 MRE(图4G、 4I、，S4系列Q、 和S4R）。RNA-seq分析证实了预测miR-194靶点的类似DRT(图4J、 4K，S4系列S、 以及S4T）。因为当miR-192水平增加3.7倍时，预测的靶点不易被抑制(图S4O） ，减压也很难衡量(图4H、 4I、，S4系列Q、 和S4R），尽管在1.1×10时检测到一些减压信号⁶添加了miR-192 MRE(图4L和S4系列U） ●●●●。总之，这些结果表明肝细胞中let-7、miR-192和miR-194靶点的去表达发生在与之前观察到的miR-122靶点相似或更高的DRT上。

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图4

let-7、miR-194和miR-192的miRNA靶向去抑制也发生在增加MRE的高阈值

（A） 肝细胞miRNAs每个细胞的绝对拷贝数。

（B） 携带突变位点（Mut）或let-7、miR-194、-192或-101的一个（1s）8-nt结合位点的Ad-AldoA构建体的示意图概述。

（C–F）感染Ad-AldoA-Mut或1s不同MOI的原代肝细胞（let-7）。

（C） let-7靶基因与对照非靶基因的相对表达(载脂蛋白).

RNA-seq数据（n=2）的（D–F）CDF，显示let-7预测靶基因的mRNA变化，显示cs+bins（颜色）或无miRNA位点的转录物的mRNA改变（黑色）。

（G–L）肝细胞感染不同的Ad-AldoA-Mut、1s（miR-192）或1s（miR-194）MOI，以及MOI 15 Ad-miR-192/194。miR-194（G）或miR-192（H）靶基因和对照非靶基因的相对水平(阿波姆)（一）。RNA-seq数据的CDF（n=2）显示了具有指示的cs+bins（彩色）的miR-194（J和K）或miR-192（L）的预测靶基因或没有miRNA位点（黑色）的基因的mRNA变化。

阿尔多A每个图上显示了通过qPCR评估的每个细胞的MRE。^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001，^∗∗∗∗p<0.0001，单侧K-S试验。垂直虚线表示DRT。

数据表示所有面板的平均值±SEM（n=4）。

6、7和8-nt站点对目标丰度的贡献相当大

6、7和8-nt位点类型观察到的不同水平的抑制效果和优先保护(巴特尔，2009年)提出了这样一个问题，即这些网站类型作为竞争对手的功效在多大程度上存在差异。因此，我们用Ad-AldoA构建物的不同MOI感染肝细胞，该构建物含有miR-122的突变或一个6-、7-或8-nt位点(图5A） ●●●●。当添加三种位点类型中的每一种时，观察到miR-122靶点的去抑制，竞争位点类型和DRT之间有明确的关系(图5B–5D）。当我们将分析扩展到转录组时，也观察到这种关系，即DRT随着位点大小的减小而增加(图5E和第5章A） ●●●●。例如，MOI 63的6-nt站点的降压介于MOI 11和20的8-nt站点的减压之间，这表明作为竞争对手，它的有效性约为8-nt站点20%。就7-nt站点而言，MOI 63处的降压超过MOI 20处8-nt站点的降压，MOI 20的降压超过了MOI 11处8-nt的降压，表明作为竞争对手，7-nt站点的有效性约为8-nt站点50%。利用这些因素计算加权TA_应用程序只降低了TA_应用程序，不影响各自miRNA TA的相对排名_应用程序(图S5B） ●●●●。这些结果表明，总的来说，7-nt位点的丰度是8-nt位点的3-8倍，它们对有效靶区丰度的贡献大于8-nt位点，而6-nt位点对有效靶点丰度的影响大于它们对靶区抑制的边际功效的预期。

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图5

6-、7-和8-nt位点对miR-122靶丰度的贡献相当大

（A） 本图中使用的Ad-AldoA结构的示意图概述。

（B–E）感染Ad-AldoA miR-122 8-mer、miR-122 7-mer-m8、miR-1226-mer或Mut的不同MOI的原代肝细胞。每个单元格的绝对拷贝数阿尔多A（B） ，相对基因表达GFP公司（C） 和miR-122靶基因或控制非靶基因(阿波姆)（D）。（E） RNA-seq数据的CDF（n=2）显示了带有所示cs+bins（颜色）的miR-122预测靶基因或没有相应miRNA位点的基因（黑色）的mRNA变化。阿尔多A通过qPCR评估的每个细胞的MRE显示在每个图上。^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001，^∗∗∗∗p<0.0001，单侧K-S试验。另请参见图S5C和S5D。

垂直虚线表示DRT。数据表示所有面板的平均值±SEM（n=4）。

近距离MRE介导的降压作用增强

尽管已经在mRNA抑制的背景下研究了紧密间隔的miRNA-结合位点的协同效应(Doench等人。，2003,Grimson等人。，2007,Saetrom等人。，2007,Broderick等人。，2011)合作间隔的miRNA-结合位点在位点竞争环境中的作用尚未被研究。因此，我们分析了紧密间隔的miRNA-结合位点是否可以协同隔离miRNA分子，从而减少去抑制所需的位点数量。

内源性3′UTR内协同作用的MRE的间距一般在8～60 nt之间(Grimson等人。，2007,Saetrom等人。，2007). 因此，我们生成了Ad-AldoA结构，其中一个8-nt位点用于miR-122，另一个用于let-7，由58 nt（Ad-Aldo A 2x+58nt）分隔，或各自的单位点控制(图6A） 以及不同MOI的感染肝细胞。有趣的是，当let-7 MRE通过包含附近miR-122位点的构建物添加时，预测的缺少miR-122位置的let-7靶点显示出更强的去抑制作用(图6B–6D，S6系列A、 和S6B）。具有相邻let-7位点的miR-122 MRE对miR-122靶点的去表达也获得了类似的结果，表明与一个miRNA家族结合的竞争可能受到另一个家族的邻近位点的影响。为了达到与孤立位点相同的去抑制水平，具有邻近合作位点的位点只需要每个细胞20%–50%的分子(图6B） ●●●●。

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图6

近距离MRE介导的降压作用增强

（A） 此图中使用的Ad-AldoA构造的示意图概述。

（B–J）感染不同Ad-AldoA结构MOI的原代肝细胞，如（A）所示。let-7靶基因（B、E和H）、miR-122靶基因（C和F）或对照非靶基因的相对基因表达(阿波姆)（D、G和I）。（J） RNA-seq结果的CDF（n=2）显示了感染Ad-AldoA let-7+58nt或2x+58nt的MOI 80的肝细胞的mRNA变化，其中let-7的预测靶基因（没有预测的miR-122靶位点）带有指示的cs+bins（颜色），或者没有let-7或miR-122 miRNA位点的基因（黑色）。^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001，^∗∗∗∗p＜0.0001，单侧K-S检验。

（K–N）肝细胞感染不同的Ad-AldoA-Mut、miR-122、let-7或2x+58nt的MOI。let-7和miR-122（K）、let-7靶基因（L）、miR-122靶基因（M）或对照非靶基因的预测靶基因的相对基因表达(阿波姆)（N）。垂直虚线表示DRT。

数据表示所有面板的平均值±SEM（n=4）。

为了研究miR-122和let-7位点的间距对引起合作竞争能力的影响，我们用不同间距Ad-AldoA2x结构的各种MOI感染肝细胞(图6A） ●●●●。虽然Ad-AldoA-2x介导的基因调控的协同效应独立于let-7结合位点是miR-122位点上游还是下游的58 nt，这表明不需要特定的干预序列或结构，但当这两个位点相距255或997 nt时，没有观察到协同效应(图6E–6G，S6系列C、 和S6D）。将Ad-AldoA 2x+58nt上的8-nt miR-122站点更改为7-nt或6-nt站点时(图6A） ，在站点类型和合作效应的大小之间观察到强烈的关系(图6H、 6I，和S6系列E–S6G）。此外，在转录组水平上，如果竞争的let-7位点有一个相邻的miR-122位点，那么缺少预测miR-122位置的预测let-7靶点会被显著地释放(图6J和S6系列H） 从而证实，共表达miRNAs的紧密结合位点可以提高竞争位点的功效。

然后，我们通过使用Ad-AldoA miR-122、let-7和2x+58nt感染具有不同MOI的肝细胞，研究在存在协同性的条件下，DRT是否较低。当7×10时检测到miR-122和let-7靶基因的去抑郁⁴ 阿尔多A超过了2x+58nt构造的副本(图6K–6N，S6系列一、 和S6J）。根据合作DRT中是否包含miR-122或let-7的结合位点，7×10⁴ AldoA公司副本将对应于7或14×10的DRT⁴MRE分别比先前确定的DRT低3.1倍或1.5倍（let-7），或2.2倍或1.1倍（miR-122）。不管DRT的解释如何，这些结果表明，位点的协同作用可以显著提高ceRNA-介导的基因去表达的前景。

单细胞报告试验

荧光报告质粒基于pTRE-Tight-BI（Clontech）系统，其中双向Tet启动子表达eYFP和mCherry(Mukherji等人。，2011). 的3′UTRm樱桃色包含零个（0s）、一个（1s）或三个连续的（3s）48-nt长序列延伸，由一个8-mer MRE和±20-bp侧翼区域组成(Bosson等人。，2014). 用报告质粒和rtTA质粒转染ESC株E14，转染后6小时用强力霉素诱导，18小时后收获。使用FACSAria IIIu流式细胞仪对样品进行分析，并对eYFP和mCherry荧光值进行自荧光校正，如Bosson等人。(2014).

肝细胞分离与病毒感染

动物实验由Kantonale Veterinäramt Zürich批准。对8至12周龄雄性C57BL/6N小鼠（Janvier）的肝细胞进行计数，并在低糖培养基中以每孔300000个细胞的速度将其置于表面处理的六孔板（Corning）中。电镀后4至6小时，用肝酶培养基（生命科技）中的腺病毒构建物感染细胞，并在感染后24小时收获。

腺病毒

本研究中产生的重组腺病毒基于阿尔多A中描述的构造Denzler等人。(2014)和快递GFP公司来自独立发起人。请参见表S5和S6系列所有Ad-AldoA构建物的核苷酸序列。

我们要感谢J.Zamudio、C.JnBaptise和P.Sharp提供的技术建议和有益的讨论；B.Kleaveland，针对小型RNA-seq；和C.Ciaudo提供ESC。本研究部分得到了国家科学基金会研究生研究奖学金（V.A.）、ERC赠款“代谢组学”和NCCR“RNA与生物学”（M.S.）以及NIH赠款GM067031（D.P.B.）的支持。D.P.B.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。