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氧化还原生物。2016年12月；10: 128–139.
2016年10月4日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.redox.2016.10.002
预防性维修识别码：项目经理5065647
PMID：27744118

合成的孕激素-去甲孕酮调节Nrf2信号，并在视网膜变性模型中充当抗氧化剂

阿什利·伯恩,安娜·M·鲁兹-洛佩兹,莎拉·罗什,詹妮弗·莫洛尼,爱丽丝·C·怀斯-杰克逊、和托马斯·G·科特⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

色素性视网膜炎（RP）是影响全世界人民的最常见的视网膜变性疾病之一，目前是无法治愈的。其特征是光感受器逐渐丧失，其中杆细胞死亡导致锥体细胞继发死亡；最终失明的原因。随着杆细胞死亡，视网膜氧代谢受到干扰，导致活性氧（ROS）水平升高，从而导致氧化应激；锥体继发死亡的关键因素。在这项研究中，FDA批准的孕酮合成类似物norgestrel被发现是一种强大的神经保护抗氧化剂，可以防止感光细胞中的光诱导活性氧，以及随后的细胞死亡。诺孕酮还可阻止与ROS生成相关的光诱导感光细胞形态变化，这是RP的特征。进一步研究表明，诺孕酮通过主要抗氧化转录因子Nrf2的翻译后调节发挥作用；导致其磷酸化，随后发生核移位，并增加其效应蛋白超氧化物歧化酶2（SOD2）的水平。总之，这些结果证明了光感受器细胞对氧化应激的显著保护作用，并强调了去甲孕酮作为RP治疗选择的潜力。

关键词：色素性视网膜炎，光受体，ROS，Nrf2，诺孕酮

亮点

  • •
    诺孕酮可将感光细胞从RP特有的结构变化中拯救出来。
  • •
    诺孕酮降低线粒体衍生活性氧。
  • •
    诺孕酮导致光感受器内SOD2增加。
  • •
    诺孕酮增加了Nrf2的表达和激活。

1.简介

视网膜色素变性（RP）是一组高度异质性的遗传性视网膜疾病，所有这些疾病都包括视杆细胞和视锥细胞通过多种不同的信号级联进行性死亡，包括细胞凋亡、自噬和坏死[1],[2]目前，已在60个视杆感光基因中发现致病突变[The Retinal Information Network（RetNet），https://sph.uth.edu/retnet/2016年7月]。尽管涉及多种基因，但所有RP病例的特征都是杆状光感受器死亡，继而锥体细胞继发性逐渐死亡，最终导致完全失明[3],[4]氧化应激已被证明是RP和许多其他视网膜病变进展的关键因素[5],[6],[7],[8]由于光感受器是体内代谢最活跃的细胞，每克消耗的氧气比任何其他组织都多[9]体内和体外的许多研究都表明，RP继发核细胞死亡的一个关键原因是氧水平增加导致的氧化损伤，从而导致杆状细胞死亡时的活性氧（ROS）[6],[10],[11],[12],[13],[14],[15]除此之外，已经证明，在遗传性和年龄相关的视网膜病变（包括RP）中，由于光照产生的活性氧会加剧视网膜的退化[16],[17],[18],[19],[20].

细胞对氧化应激的主要反应之一是激活普遍表达的碱性亮氨酸拉链转录因子NF-E2相关因子-2（Nrf2）[21],[22]从其阻遏物kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）中释放后，Nrf2易位到细胞核中，在那里它结合抗氧化反应元件（ARE），导致各种抗氧化、解毒和细胞保护基因的上调[22],[23],[24],[25],[26]研究Nrf2在视网膜中的抗氧化作用，已证明其在视神经损伤后保护视网膜神经节细胞方面的重要性[27]以及减缓糖尿病视网膜病变的进展[28]虽然很少有研究关注RP，但Nakagami及其同事最近使用兔子模型进行的一项研究表明，Nrf2的激活及其效应蛋白的上调如何延缓感光细胞的丢失[29].

Nrf2可由多种信号分子调节，包括孕酮，一种多效性神经保护激素。研究还表明，孕激素作为激素替代疗法（HRT）的一部分，可以增加Nrf2调节的超氧化物歧化酶抗氧化酶（SOD）的表达[30],[31]在心脏中，孕酮上调Nrf2效应器NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）[32]孕酮在创伤性脑损伤的实验模型中也发挥抗氧化作用，包括增加SOD活性[33],[34],[35].

我们之前已经证明，在遗传性RP模型和视网膜变性光损伤模型中，去甲孕酮（孕酮的合成类似物）的神经保护作用。诺孕酮通过上调神经营养因子bFGF和LIF的机制使感光细胞免于死亡[36],[37]在这里，我们试图研究在光诱导视网膜变性中，去甲孕酮的活性是否包括氧化还原环境的调节。我们提供证据表明，去甲孕酮通过丝氨酸40上的磷酸化增加Nrf2的表达和激活，增加其靶向抗氧化剂超氧化物歧化酶2（SOD2）的表达，并减少线粒体氧化应激。

2.材料和方法

2.1. 老鼠

所有动物均按照视力和眼科研究协会关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行饲养和处理。实验在从Harlan Olac（英国比斯特）获得的balb/c小鼠上进行。小鼠因颈椎脱位而被安乐死。所有程序均由爱尔兰健康产品管理局（HPRA）批准。

2.2. 轻度损伤模型

光损伤模型的执行如前所述[37].简要说明：；Balb/c小鼠出生于小于10lx（12小时开启/12小时关闭）的昏暗循环光中并维持在该环境中。在4-7周龄时，在暴露于破坏性光线之前，小鼠适应黑暗18小时。在光损伤前1小时，小鼠接受50μL溶媒（25μL二甲基亚砜/25μL花生油）或50μL甲孕酮（100 mg/kg）的腹腔注射（i.p.）。在光损伤之前，他们的瞳孔在红光下用0.5%的环戊酸扩瞳。然后暴露在冷白色荧光灯（5000 lx）下2小时，导致视网膜光损伤。之后，如图所示，在安乐死之前，将小鼠置于黑暗中6、24或48小时。

2.3. 眼部切片准备

将去核的眼睛在4%多聚甲醛（PFA）中固定1.5小时，然后在4°C的30%蔗糖中冷冻保护过夜。然后将眼睛冷冻在Shandon™Cyrochrome™（ThermoFisher Scientific）中，然后使用低温恒温器切割7µm切片（Leica CM1950；Leica Co.，Meath，Ireland）。切片在使用前保存在−80°C。

2.4. 显微镜

使用Leica DM LB2显微镜和尼康数码视野DS-U2相机，使用40×和100×物镜观察视网膜切片。照片是使用日本尼康NIS-Elements 3.0版软件拍摄的。在每个时间点，对每组至少三只小鼠的视网膜切片进行免疫荧光检测。在所有时间点和治疗期间获取图像时，使用相同的显微镜设置。所示图像为中央视网膜的图像。

2.5. 免疫组织化学标记切片的定量

如前所述，使用ImageJ软件对外核层（ONL）厚度和荧光强度测量进行量化[38],[39]。平均ONL厚度通过从每只小鼠至少20个切片上进行测量来测量。在每个剖面中，进行了三次不同的测量并取平均值。Nrf2和SOD2荧光强度测量是在同一区域、同一方向、40倍放大率下进行的。这些图像用于创建感兴趣标记的绘图剖面，并测量曲线下的面积作为荧光强度的读数。

2.6. 末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡

用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测感光细胞核中的DNA链断裂。根据制造商的说明，将冷冻切片（7µm）与末端脱氧核苷酸转移酶（Promega，MyBio Ltd.，Kilkenny，Republic of Ireland）和荧光素-12-dUTP（Roche，Lewes，UK）在37°C下培养1小时。切片用Hoechst（1μg/mL）进行反染色，以观察细胞核，并在荧光显微镜下进行安装和观察（Leica DM LB2；Leica，Nussloch，Germany）。

2.7. 免疫荧光染色

将冰冻切片置于室温下，在PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCL、10 mM NaPO）中重新水化4，1.8 mM千赫2人事军官4)在室温下，用5%的驴血清和0.1%的Triton X-100在PBS中渗透30分钟，然后用5%驴血清在PBS内封闭。随后，用一级抗体或凝集素溶液在4°C下培养切片过夜(表1). 在室温下，使用1/500稀释度的共轭二级抗体（Alexa Fluor 488；Invitrogen，Carlsbad，CA）检测抗体结合1小时。用二级抗体孵育的切片仅用一级抗体证实免疫标记阳性（数据未显示）。使用Hoechst 33342（1μg/mL；Sigma-Aldrich）对细胞核进行反染色。用Mowiol安装介质（Sigma-Aldrich）安装切片，并在荧光显微镜下观察（Leica DM LB2；Leica）。

表1

使用的主要抗体/凝集素。

抗体/凝集素供应商目录#稀释/浓度
PNA-FITC公司矢量实验室FL-1071型1:500
视紫红质EMD微孔AB9279型1:200
编号2阿布卡姆ab31136号1:200如果
1:1000蛋白质印迹
SOD2标准阿布卡姆约135531:200
钠1阿布卡姆ab13498型1:200
磷酸-Nrf2（S40）阿布卡姆Ab76026号如果是1:100
1:5000西方印迹
GAPDH公司细胞信号51741:1000
组蛋白H3阿布卡姆抗体120791微克/毫升

2.8. 使用二氢乙锭（DHE）评估ROS

如前所述，使用二氢乙硫铵（DHE）原位评估细胞内活性氧[40],[41],[42]一旦与超氧自由基接触，DHE就会转化为与DNA嵌入的乙炔，并在大约600 nm处发出红色荧光。光损伤后，小鼠接受两次腹腔注射20 mg/kg DHE（分子探针，生命科技公司），间隔30分钟。安乐死前3.5/4小时进行注射，使用尽可能少的光线。然后将小鼠放回黑暗中，直至实施安乐死；光损伤后6、24或48小时。如上所述进行眼球摘除、固定、冷冻和再水化，然后用一级抗体或TUNEL和Hoechst进行反训练；如上述免疫荧光染色所述。红通道检测DHE染色；激发：543nm，发射>590nm。

2.9. 流式细胞术

2.9.1. 单细胞悬液的制备和细胞活力的评估

安乐死后，在尽可能少的光线下，在冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中解剖眼球摘除后的视网膜。单细胞悬液（SCS）是通过在37°C下，将每个视网膜在2.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）中消化15分钟，该溶液含有来自牛脾脏的50μL脱氧核糖核酸酶II（DNaseII）（10000单位/mL）。然后倾析该溶液，并将含有50μL DNase II的2.5 mL DMEM添加到视网膜中。用巴斯德吸管上下吸液10次，进行均质。允许大碎片沉降，收集2 mL单细胞悬浮液并放入FACs管（BD Biosciences）中，以装载MitoSox。使用血细胞仪通过胰蛋白酶蓝隔离试验（Sigma，cat.#15250061）评估SCS的细胞活力。

2.9.2. SCS质量评估

为了验证SCS由完整细胞而非碎片细胞组成，使用Shandon cytospin 11细胞离心机（Shandon）使用200μL每个SCS制备细胞球。然后将胞浆与视紫红质抗体孵育(表1)和Hoechst 33342（1μg/mL；Sigma-Aldrich），如上所述免疫荧光染色.

2.9.3. MitoSox评估

使用细胞内线粒体超氧化物探针MitoSox（分子探针，Life Technologies）评估光损伤视网膜中的线粒体ROS水平。在37°C下用5µM MitoSox加载单细胞悬浮液15分钟，并使用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪测量荧光。采用488nm激光激发MitoSOX-Red，在FSC、SSC、670LP（FL3）通道采集数据。在门控光感受器区域统计了10000个事件。以明显的低正向和侧向散射为代表的细胞碎片被选通进行分析。使用FlowJo软件（Leland Stanford Jr.University受托人）对结果进行分析。

2.10. RNA分离、cDNA合成和实时PCR

根据制造商的说明，使用RNeasy Midi试剂盒（Qiagen）从视网膜提取总RNA（tRNA），包括DNA酶处理以消化残余基因组DNA。使用颗粒杵无绳电机（Sigma，目录号Z359971）使视网膜均匀化。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）逆转录RNA。使用小鼠QuantiTect引物分析（Qiagen）和SYBR Green JumpStart进行实时PCR（rtPCR）塔克ABI Prism 7900HT序列检测系统中的ReadyMix（Sigma-Aldrich）（应用生物科学）。将mRNA值标准化为三个内源性参考基因的几何平均值；β肌动蛋白、gapdh和hprt。使用Livak和Schmittgen描述的比较Ct（ΔΔCt）方法量化基因表达的相对变化[43].

2.11. 蛋白质印迹

使用组织特异性试剂盒（Thermo Scientific，cat#87790）在snap冷冻视网膜上进行亚细胞蛋白分馏。使用颗粒杵无绳电机（Sigma，产品编号Z359971）将每组和每个时间点的100 mg视网膜（约4个视网膜）混合并均质。根据试剂盒说明制备细胞组分，并用Halt™蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，cat ~78440）替换Halt™蛋白酶抑制剂鸡尾酒（包括在试剂盒中）。以BSA为标准，通过Bradford试验测定每个组分的总蛋白浓度。在4X蛋白质样品加载缓冲液（LI-COR，目录号P/N 928-40004）中的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上解析等量的蛋白质，然后转移到硝化纤维素膜上（德国达塞尔州沃特曼Schleicher&Schuell）。在RT条件下，用Odyssey TBS封闭缓冲液（LI-COR，cat#P/N 927-50000）封闭膜1小时，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜(表1). 随后将膜在Tris-buffered生理盐水/0.1%吐温-20（TBST）中清洗三次5分钟，然后在Odyssey TBS Blocking Buffer/TBST溶液中加入1:10000稀释的适当Alexa Fluor荧光二级抗体。使用奥德赛红外成像系统（英国LI-COR生物科学公司）扫描印迹，以荧光检测二级抗体。使用Image Studio Lite软件（英国LI-COR Biosciences）量化荧光信号强度。

2.12. 统计分析

学生的t吨-假设方差不相等的检验用于确定两个样本均值之间是否存在显著差异。

3.结果

3.1. 诺孕酮将感光细胞从光诱导的活性氧生成和随后的细胞死亡中拯救出来

我们之前已经描述过诺孕酮如何保护感光细胞免受光诱导的细胞死亡[37]为了研究诺孕酮是否也能降低光诱导ROS，载体或诺孕酮治疗的小鼠被光损伤（LD），随后腹腔注射二氢乙锭（DHE）。DHE是原位活性氧的敏感指示剂.它是一种非特异性的超氧化物标记物，一旦有活性氧，就会转化为溴化乙锭并结合DNA，发出红色荧光。

6小时(图1Ai），24小时(图1Aii）和48小时(图1Aiii）LD后，溶媒（veh）治疗小鼠的DHE荧光呈阳性，表明ROS生成。DHE在光感受器层（PRL）中可见，该层包含视杆和视锥的内外段，以及外核层（ONL），后者包含视杆细胞体和视锥细胞体。在所有时间点，norgestrel（norg）均抑制DHE。在这里和随后的图中，还观察到视网膜色素上皮（RPE）中的DHE荧光，RPE对光诱导氧化应激敏感[44]ONL内的TUNEL显示LD后24小时和48小时，经载体处理的小鼠的感光细胞死亡，正如预期的那样，这也被去甲孕酮抑制。通过Hoechst细胞核染色评估，LD后24小时和48小时，溶媒处理小鼠的ONL明显变薄。测量ONL厚度，以量化因去甲孕酮导致的细胞死亡的减少(图2B） ●●●●。

图1

诺孕酮可防止光诱导的活性氧生成和随后的细胞死亡。在轻度损伤（LD）前1 h，给Balb/c小鼠腹腔注射载药（veh）或含100 mg/kg诺格（norg）的载药，并在LD后6 h、24 h或48 h实施安乐死。在安乐死前约4小时，小鼠接受两次腹腔注射20毫克/公斤二氢乙硫胺（DHE），间隔30分钟。按照方法所述，制备眼切片并通过显微镜进行评估。A；在LD后6 h（Ai）、24 h（Aii）和48 h（Aiii）分别用veh或norgestrel（norg）处理小鼠的视网膜，评估DHE荧光（红色）（指示ROS生成）和TUNEL染色（绿色）（指示细胞死亡）。视网膜细胞核的Hoechst染色可确定视网膜层的方向，并显示LD后ONL厚度的变化。B类；溶媒（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗小鼠LD后24和48小时ONL厚度的图示。RPE；视网膜色素上皮；光受体层，ONL；外核层；内核层，RGL；视网膜神经节细胞层。图像至少代表n=3。误差条表示来自三个独立实验的±SEM比例尺=50µm*第页=<0.05.（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

图2

诺孕酮可将感光细胞从光诱导的结构损伤中拯救出来。在轻度损伤（LD）前1 h，给Balb/c小鼠腹腔注射载药（veh）或含100 mg/kg诺格（norg）的载药，并在LD后24 h或48 h实施安乐死。在安乐死前约4小时，小鼠接受两次腹腔注射20毫克/公斤二氢乙硫胺（DHE），间隔30分钟。按照方法中的描述，获取眼部切片并通过显微镜进行评估。A、 B类；在LD后24（A）或48（B）小时实施安乐死的小鼠中，评估LD对veh或norgestrel处理的视网膜感光细胞形态的影响。通过花生凝集素（PNA）结合（Ai，Bi）评估球果形态。通过视紫红质染色（Aii，Bii）评估杆的形态。还显示了DHE反荧光（红色）。PRL；光受体层，ONL；外核层；外丛状层，INL；内核层。图像至少代表n=3。比例尺=50µm。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

3.2. 诺孕酮拯救光诱导感光细胞形态损伤

我们之前已经表明，在RP的rd10模型中，诺孕烯保留了光感受器的形态，这转化为通过视网膜电图测量的功能的保留[37]在这里，我们试图研究光损伤（LD）是否会导致与疾病模型相似的光感受器的结构损伤，这是否与活性氧的产生相关，以及诺孕酮是否可以预防这种损伤。在LD后24和48小时对感光器的形态进行了研究(图2); 观察细胞死亡的时间(图1). 用抗视紫红质（Rho）免疫荧光染色评估杆的形态，用凝集素花生凝集素（PNA）染色评估锥的形态。PNA特异性地结合锥体内外节质膜上的碳水化合物，以及位于外丛状层（OPL）内的突触蒂[45].

LD显著降低了接受溶媒（veh）治疗的小鼠的感光细胞密度，与接受诺格孕酮（norgestrel）治疗的鼠相比，剩余的感光层显示出长度和结构异常(图2Ai，ii和Bi，ii，上部面板）。到LD后24小时，载体治疗小鼠的锥体细胞开始分解，变得支离破碎，外观肿胀(图2Ai，上部面板），这是RP的rd10模型中出现的现象[46]到48小时时，这种异常形态更进一步，OPL中没有可见的突触蒂(图2Bi、上部面板）。相反，在去甲孕酮治疗的小鼠中，LD后锥体细胞结构保持不变，细胞保持其特有的神经元形态(图2Ai、Bi、下部面板）。

LD后24小时，经溶媒处理的小鼠的杆细胞形态比锥体细胞更为异常(图2Aii，上部面板），符合RP的疾病模型，其中锥体细胞死亡仅次于杆状细胞死亡[3],[4].视紫红质在杆外段表达，但与去甲孕酮治疗的小鼠相比，免疫反应似乎更接近于载体中的ONL(图2Aii、Bii、顶部面板）。这表明视紫红质在内层节段去定域，在遗传性RP模型的视网膜变性过程中也观察到这一现象[47]到48小时，与去甲孕酮治疗的小鼠相比，溶媒中的视紫红质免疫反应降低(图2Bii），因为杆细胞死亡增加。在这两个时间点，norgestrel都能恢复杆的形态；统一的视紫红质染色，距离ONL较远(图2Aii、Bii、下部面板）。用PNA或视紫红质对DHE进行反训练表明，ROS的产生与感光细胞的形态变化相关。

3.3、。诺孕酮降低光诱导线粒体活性氧

光受体在其内部片段中有密集的线粒体，因此具有很高的代谢需求[48]这种需求通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来满足，其扰动会产生过量的ROS，并与各种神经退行性疾病有关，包括RP[49]为了确定诺孕酮是否能降低光诱导的线粒体特异性活性氧，用荧光探针MitoSox负载光损伤（LD）小鼠视网膜的单细胞悬浮液（SCSs）进行流式细胞术(图3). MitoSox是DHE的改性衍生物，专门针对线粒体[50]氧化后，MitoSox转化为mito-2-hydroethidium，它结合线粒体DNA并发出红色荧光[51]与DHE不同，MitoSox不能用于活体动物，因此采取了这种方法。最初，通过对未经治疗的LD小鼠（LD后48小时）的视网膜进行流式细胞术，与未接受LD的未经治疗小鼠（健康）的视网膜比较，确定感光细胞群(图3A） ●●●●。在这两个样本中统计了10000个事件。健康细胞中存在的人群（78.8%）（图Ai），在LD小鼠（图Aii）中减少了（16.6%），根据图1其中，细胞死亡通过TUNEL分析在ONL内唯一可见。该区域在随后的所有实验中都被选通。LD后，去甲孕酮治疗小鼠的MitoSox荧光在6小时后降低(图3Bi），24小时(图3Ci）和48小时(图3Di）由直方图覆盖表示。在所有实验中，溶媒和去甲孕酮处理小鼠在6 h时的MitoSox荧光强度中值存在显著差异；对=<0.001 (图3Bii），24小时；对=<0.0042 (图3Cii）和48小时第页=<0.0044 (图3Dii）。

图3

诺孕酮降低光诱导的线粒体ROS。在轻度损伤（LD）前1 h，给Balb/c小鼠腹腔注射载药（veh）或含100 mg/kg诺格（norg）的载药，并在LD后6 h、24 h或48 h实施安乐死。按照方法中的描述，从眼睛中取出视网膜，消化并均质成单细胞悬浮液（SCSs），并装入MitoSox。流式细胞术检测线粒体荧光。A；最初，通过计算未经处理的健康小鼠（i）或未经处理小鼠在遭受LD（ii）48小时后SCS中的10000个事件来确定感光细胞群。根据侧面散射（SSC）绘制的前向散射（FSC）图显示，健康小鼠（78.8%）（Ai）的视网膜感光细胞（PR）数量显著减少（16.6%）。B（6小时）；C（24小时）；D（48小时）；代表性直方图叠加显示，与溶媒（veh）相比，去甲孕酮（norg）治疗小鼠的MitoSox荧光（i）。载体（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗小鼠体内MitoSox中值荧光强度（MFI）的图示（ii）。E；用台盼蓝排斥法测定SCSs的细胞活力。F；对健康小鼠SCS的胞浆制剂进行视紫红质免疫反应性评估，并在40倍放大（i，ii）（标尺=50µm）或10倍放大（iii）（标杆=25µm。所有结果至少代表n=3**第页=<0.01，***p=<0.001.（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

为了确保视网膜细胞在SCS制备后仍然存活，进行了台盼蓝排斥试验。这项测试基于这样一个概念，即活的健康细胞不会吸收不渗透的染料，而死亡或受损的细胞会吸收。细胞存活率约为80%(图3E） ●●●●。

为了进一步验证SCS制剂的质量，并确保细胞保持完整而不碎裂，使用健康小鼠视网膜中的SCS制备了胞栓。视紫红质免疫反应结合Hoechst染色证实感光细胞确实完好无损(图3Fi–iii）。

3.4. 诺孕酮增加Nrf2和SOD2的表达，但不增加SOD1的表达

接下来，我们试图研究去甲孕烯在LD后的抗氧化作用是否包括调节Nrf2及其效应蛋白SOD1和SOD2的表达。之所以选择Nrf2，是因为当细胞受到氧化应激时，Nrf2通常是第一个呼叫端口，并且与SOD一起被证明受孕酮调节[31],[32],[33],[34],[35]SOD1和SOD2分别清除细胞质和线粒体中的过氧化氢[52],[53]采用视网膜切片的免疫荧光染色，我们发现，去甲孕酮显著增加感光细胞中Nrf2和SOD2的表达。6小时时感光层（PRL）中的Nrf2免疫反应性增加(图4Ai），24小时(图4Bi）和48小时(图4Ci）LD后。在研究的所有时间点，PRL中SOD2的表达也增加(图4A、 B、C、ii）。荧光强度的量化显示，Nrf2和SOD2的这些增加在所有时间点都是显著的(图4D） ●●●●。在LD后的任何时间，诺孕酮都不能增加SOD1的表达（图Aiii、Biii和Ciii）。还通过DHE荧光观察ROS。

图4

诺孕酮增加抗氧化剂Nrf2和SOD2的表达，但不增加SOD1的表达。在轻度损伤（LD）前1 h，给Balb/c小鼠腹腔注射载药（veh）或含100 mg/kg诺格（norg）的载药，并在LD后6 h、24 h或48 h实施安乐死。在安乐死前约4小时，小鼠接受两次腹腔注射20毫克/公斤二氢乙硫胺（DHE），间隔30分钟。按照方法中的描述，获取眼部切片并通过显微镜进行评估。A；评估经溶媒（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗的小鼠LD后6 h Nrf2（i）、SOD2（ii）和SOD1（iii）的表达。B类；评估经溶媒（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗的小鼠LD后24小时Nrf2（i）、SOD2（ii）和SOD1（iii）的表达。C类；评估经溶媒（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗的小鼠LD后48小时Nrf2（i）、SOD2（ii）和SOD1（iii）的表达。还显示了DHE的反荧光（红色）。Hoechst染色（蓝色）可确定视网膜层的方向，并显示LD后ONL厚度的变化。PRL；光受体层，ONL；外核层；外丛状层，INL；内核层；内网状层。D；载体（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗小鼠的Nrf2或SOD2荧光强度的图示。结果至少代表n=3。比例尺=50µm。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

3.5. 诺孕酮在翻译后水平调节Nrf2表达

最后，我们试图研究诺孕酮上调Nrf2的机制。首先，我们通过定量实时PCR（qRT-PCR）研究了去甲孕酮对Nrf2转录的影响。在LD后的所有时间点，在自然频率2载体与去甲孕酮治疗小鼠的表达(图5A） ●●●●。接下来，我们在翻译后水平上研究了norgestrel对Nrf2的影响。事实上，Nrf2主要在翻译后水平上进行调节。它是组成性表达的，在基础条件下，大多数群体与抑制剂KEAP1结合，该抑制剂将Nrf2固定在细胞质内，并通过E3连接酶Cul-3促进泛素蛋白酶系统（UPS）持续降解Nrf2[54]为了响应刺激，Nrf2也可以以各种方式被激活，包括磷酸化。Nrf2含有许多潜在的磷酸盐类，这些磷酸盐类可能是不同激酶的靶点[55]一种已证实的Nrf2激酶是蛋白激酶C（PKC），它磷酸化丝氨酸40（S40）上的Nrf1，从而干扰其与KEAP1的相互作用，使其能够转位到细胞核中[56],[57]首先，我们研究了去甲孕酮是否对Nrf2磷酸化和核转位有任何影响。采用western blot分析法检测LD前用veh或norgestrel处理的小鼠全视网膜裂解液的细胞液和核组分中pNrf2（S40）的表达(图5B） ●●●●。诺孕酮治疗后，LD后核组分中的pNrf2始终显著增加，而总Nrf2仅略微增加，或在48小时内根本没有增加。然后，我们对视网膜切片进行免疫荧光染色，以观察pNrf2在光感受器中的表达(图5C） ●●●●。与经溶媒处理的小鼠相比，诺孕酮在6小时时提高了ONL内pNrf2的水平(图5Ai），24小时(图5Aii）和48小时(图5Aiii）。

图5

诺孕酮增加Nrf2的磷酸化及其核转位。在轻度损伤（LD）前1 h，给Balb/c小鼠腹腔注射载药（veh）或含100 mg/kg诺格（norg）的载药，并在LD后6 h、24 h或48 h实施安乐死。A；评估LD视网膜的相对变化编号2veh或norgestrel治疗后mRNA表达。通过实时（rt）PCR分析相对表达，与三个内源性参考基因的几何平均值相比，折叠变化(gapdh、hprt、β-肌动蛋白）结果代表n=2。B类；对接受溶媒（veh）或去甲孕酮（norgestrel）治疗并在LD后6h、24h和48h实施安乐死的小鼠的视网膜裂解液进行亚细胞分离。通过western blot分析评估细胞溶质和核组分中磷酸化Nrf2（pNrf2）或总Nrf2的表达。通过探测胞体定位的GAPDH和核定位的组蛋白H3（HH3），评估样品的等量装载和亚细胞组分的验证。Western blot代表n=4。C类；在实施安乐死前约4小时，小鼠接受两次腹腔注射20毫克/公斤二氢乙硫胺（DHE），间隔30分钟。如方法中所述，获得眼部切片并通过显微镜进行评估。在LD后6 h（Ci）、24 h（Cii）和48 h（Ciii），评估溶媒（veh）或去甲孕酮（norg）治疗小鼠的pNrf2表达（绿色）。还显示了DHE的反荧光（红色）。Hoechst染色（蓝色）可以确定视网膜层的方向，但为了提高pNrf2染色的清晰度，会从每张图像的一半中删除。PRL；光受体层，ONL；外核层。图像至少代表n=3。比例尺=50µm。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

4.讨论

无论潜在的遗传原因如何，光受体细胞死亡是所有RP病例的共同终点。随着RP的进展，由于致病突变，光传导减少，并且杆感光器无法利用其可用的氧气。随着光感受器层逐渐变得更加紊乱，这一点被加强，导致视网膜外层的高氧血症，进而引发细胞死亡途径[58],[59]虽然致病突变位于杆基因内，但锥细胞的继发性缺失导致了完全失明。这背后的机制尚不完全清楚，但众所周知，氧化应激是一个关键因素[6],[7],[8],[41],[60]基因治疗是一种很有前途的RP治疗方法，但针对多种RP相关基因是复杂的，因此ROS途径提供了可行的不分青红皂白的治疗靶点，其目的是延缓视网膜退化和保护视力。如果锥体细胞可以被保存，患者可以过上相对正常的生活，在明亮的环境下视力良好。

类固醇激素黄体酮是一种有效的神经保护剂，最近被证明可以减少反复轻度脑损伤模型中的氧化应激[35]我们之前已经使用RP的rd10模型和视网膜变性的光损伤模型证明了合成孕激素-去甲孕酮对受损视网膜的神经保护作用[36],[37].诺孕酮通过上调神经营养因子bFGF和LIF发挥作用，后者是一种有效的神经营养因子，有趣的是，它已被证明对视网膜具有抗氧化作用[61]在这里，我们进一步扩展了去甲孕酮在视网膜中的神经保护作用，使用视网膜退化的光损伤模型（一种公认的范式）研究其对氧化应激的影响[62]光损伤导致感光细胞内产生细胞内活性氧，如DHE荧光所示，这可通过使用诺孕酮进行预处理来阻止(图1). 由于DHE的非特殊性[63]这里我们指的是活性氧的检测，而不是超氧化物的检测。在只接受车辆治疗的小鼠中，PRL和ONL中的总ROS明显。PRL内是光感受器细胞的内段，线粒体含量高[48]因此，DHE荧光提示线粒体ROS。如前所述[37]TUNEL分析显示，去甲孕酮也抑制光诱导的细胞死亡。光诱导活性氧的产生先于细胞死亡，支持了氧化应激是光感受器丧失的关键因素的假设。

随着RP的进展和光感受器的退化，细胞发生各种结构变化。杆细胞表现出视紫红质去定域[47]而圆锥体内外节变得支离破碎和肿胀[46]。由于OPL内的突触连接受到干扰，椎弓根也会丢失[64]这些现象是RP过程中结构变化的特征，与光损伤后ROS的产生相一致(图2). 此外，光损伤后24小时，杆细胞结构的异常似乎比锥体更为严重(图2A） 正如在RP模型中观察到的那样，从死亡的杆细胞中获得的ROS是锥细胞死亡的关键因素[6],[10],[11]所有的结构畸变都被诺孕烯完全阻止；保持了正常的感光细胞形态和ONL厚度(图2).

使用DHE观察细胞内ROS总量后，我们试图研究线粒体衍生的ROS是否在光诱导的光感受器变性中起作用(图3). 事实上，它在其他视网膜病变的发展中起着重要作用，研究表明线粒体衍生的超氧化物是糖尿病组织中ROS的主要来源，并负责启动其他ROS信号通路[65],[66]我们在这里表明，光损伤确实会在光感受器内产生线粒体活性氧，而去甲孕酮可显著降低线粒体活性氧的生成(图3B） ●●●●。与DHE荧光完全抑制不同(图1)，norgestrel并没有消除MitoSox荧光。这里的差异可能是由于流式细胞术是一种更敏感的应用。此外，制备单细胞悬浮液可能会引入活性氧，如果可以原位评估，则诺孕烯对光诱导线粒体活性氧的减少可能会更大。同样，与DHE一样，MitoSox也是一种非特异性超氧化物探针[63]，因此我们指的是一般ROS的检测。

我们已经确定，诺孕酮可以减少感光细胞内的线粒体活性氧，我们试图研究其背后的机制。鉴于KEAP1-Nrf2通路是保护视网膜细胞免受内源性和外源性氧化应激影响的最重要途径之一[26]Nrf2对正常线粒体功能至关重要[67]，我们观察了去甲孕酮治疗后应激视网膜中Nrf2的表达。迄今为止，大多数关于视网膜病变背景下Nrf2的研究都是使用AMD模型进行的，其中感光细胞的丢失是视网膜色素上皮（RPE）变性的继发性。研究表明，衰老的RPE表现出Nrf2信号失调，导致抗氧化基因的诱导受损[68]，在击倒时自然频率2在其他健康的小鼠中，外层视网膜对年龄相关性变性的敏感性增加[69]类似地，通过施用萝卜硫烷激活Nrf2已被证明可以保护RPE细胞免受光氧化损伤[70]在这里，我们研究了光诱导氧化应激后感光细胞中Nrf2的表达。虽然在光损伤后6小时，经载体治疗的小鼠中观察到最小的Nrf2，但在24小时或48小时没有观察到Nrf2(图4艾、碧、词）。

在此基础上，我们检测了两个关键的Nrf2效应器SOD1和SOD2的表达，它们催化超氧物转化为过氧化氢。SOD1是细胞溶质，而SOD2定位于线粒体基质[71]SOD1表达没有增加(图4Aiii、Biii和Ciii），SOD2免疫反应在线粒体所在的感光细胞内段显著升高(图4Aii、Bii和Cii）。以前的研究已经证明了这两种酶在维持视网膜氧化还原环境中的重要性；然而，SOD2似乎对感光细胞内环境稳定更为重要。在草皮1基因敲除小鼠、Hashizume及其同事观察到，与wt小鼠相比，视网膜结构发生延迟变化[72].内核层（INL）变薄变得显著（第页<0.01)30周龄时(第页<0.05）仅在50周龄时观察到ONL厚度的降低，这表明SOD1对INL的健康比感光体更重要。事实上，外视网膜细胞的丢失可能是内视网膜细胞死亡的结果。与这种主要影响视网膜内层的缓慢进行性变性相比，草皮2与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在9天大时出现感光细胞退化[73]许多研究进一步支持了这一假设，其中SOD1被发现是视网膜最内层视网膜神经节细胞（RGC）层的一种重要抗氧化剂。SOD1缺乏小鼠RCG层ROS水平增加[74]在另一项研究中，草皮1-诱导视网膜氧化应激的空白小鼠仅在INL和RGC中显示TUNEL[75]。有趣的是，草皮1实际上，过度表达的小鼠表现出ROS水平增加，光感受器退化加速[5]结果表明，线粒体衍生的活性氧是光诱导视网膜损伤的一个重要后果，而诺孕雷可以通过上调Nrf2和随后的SOD2，显著降低这种毒性，使线粒体解毒，这是保持感光细胞数量和结构所必需的。

接下来，我们试图研究去甲孕酮诱导Nrf2表达的机制。我们首先检查了编号2去甲孕酮后的mRNA表达，但与载体相比没有变化(图5A） ●●●●。虽然诺孕酮是一种合成类固醇激素，但缺乏转录活性并不奇怪，因为它可以通过非经典受体发挥作用；孕酮受体膜组分1（PGRMC1）[76]此外，已知Nrf2几乎完全在翻译后水平调节，通过KEAP1介导的转换在基础水平上组成性表达和维持[54]这种基础表达使Nrf2能够对应激刺激产生快速有效的反应，在应激刺激下，Nrf2逃逸KEAP1并转位到细胞核，从而导致各种抗氧化基因的转录。据信，少量Nrf2仍存在于细胞核中，使靶基因得以组成性基础表达[77],[78]细胞溶胶Nrf2可被磷酸化，从而被PKC激活，从而中断其与KEAP1的相互作用[56],[57]在光诱导损伤后，去甲孕酮治疗的视网膜显示细胞核内磷酸化-Nrf2的数量增加(图5B） ●●●●。然而，western blot分析是对整个视网膜的分析。特别是在感光细胞方面，去甲孕酮治疗小鼠的ONL内pNrf2水平显著增加，持续48小时(图5C） ●●●●。这些数据表明，去甲孕酮通过PKC磷酸化介导Nrf2的活化，从而导致Nrf2核转位的增加和随后的抗氧化基因转录。需要进一步研究去探索去甲孕酮和PKC之间的联系，然而其他研究表明孕酮可以通过激活PKC发挥神经保护作用[79],[80].

Nrf2还含有一个磷氧还蛋白，其磷酸化可促进核输出和恢复基础抗氧化信号。以这种方式Nrf2的中央调节器是糖原合成酶激酶3β（GSK3β）[55]GSK3β磷酸化，从而激活细胞溶质Fyn，使其进入细胞核，在那里它又磷酸化并导致Nrf2的核输出[81],[82],[83]导致Nrf2重新绑定KEAP1并迅速降级。有趣的是，我们之前已经表明，去甲孕酮抑制GSK3β[84]，为此处报告的结果增添了分量。

总之，这项研究支持了先前的工作，表明诺孕酮是受损视网膜中一种有效的神经保护剂，并提供了强有力的体内证据，证明诺孕酮也是一种强大的抗氧化剂。我们展示了诺孕酮如何通过主要抗氧化转录因子Nrf2及其效应蛋白SOD2的翻译后调节，显著降低视网膜中线粒体衍生的活性氧。这些结果突出了去孕烯作为RP和其他视网膜退行性疾病的治疗选择的潜力，这不会区分遗传病因。

利益冲突

作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。

致谢

作者感谢生物服务部（BSU）所有成员提供的技术援助，以及Francesca Doonan博士提供的宝贵建议。这项工作得到了爱尔兰科学基金会（SFI）（赠款编号13/IA/1783）和《战胜失明》（注册慈善机构编号20013349）的支持。

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文章来自氧化还原生物学由以下人员提供爱思维尔