跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2000年11月7日；97(23):12475-80.
doi:10.1073/pnas.220418997。

蛋白激酶C介导NF-E2相关因子2磷酸化对抗氧化反应元件的调节

H C黄 1, T Nguyen（T阮）, C B皮克特
附属公司

蛋白激酶C介导NF-E2相关因子2磷酸化对抗氧化反应元件的调节

H C黄等。 美国国家科学院程序. .

中的勘误表

  • 美国国家科学院院刊2001年1月2日；98(1):379

摘要

细胞对氧化应激的协调反应部分通过一个称为抗氧化反应元件（ARE）的顺式作用序列进行转录调控。NF-E2相关因子2（Nrf2）是碱性区亮氨酸拉链（bZIP）转录因子Cap’n’Collar家族的一员，被认为是ARE结合转录复合物的重要组成部分，但导致其激活的信号通路尚不清楚。使用报告基因分析，我们发现ARE定向转录被佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）激活，但被staurosporine和Ro-32-0432（蛋白激酶C（PKC）的选择性抑制剂）完全抑制。免疫细胞化学和亚细胞分馏显示，PMA和叔丁基对苯二酚（tBHQ）一样，促进了Nrf2的核定位，这一过程被staurosporine或Ro-32-0432阻断。我们发现Nrf2，一个先前未识别的激酶靶点，在HepG2细胞中被磷酸化。PMA暂时激活Nrf2磷酸化，而tBHQ或β-萘黄酮（betaNF）的添加导致持续刺激，staurosporine可消除这种刺激，而U0126和SB203580则不能消除这种刺激。纯化的Nrf2在体外通过PKC催化亚单位或通过细胞裂解物中的PKC免疫沉淀进行磷酸化。值得注意的是，从tBHQ或βNF处理的细胞中沉淀的PKC对Nrf2的活性增强。这些发现表明PKC通路在ARE介导的基因表达中起着重要作用，并表明Nrf2的PKC定向磷酸化可能是该转录因子在氧化应激反应中核移位的关键事件。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
PKC抑制剂抑制ARE的转录激活。HepG2型用大鼠稳定转染细胞二维码CAT区域报告构造。在二甲基亚砜（溶剂）中培养后对照）、tBHQ（100mM）或PMA（100nM）在存在下持续18小时或无Ro-32–0432（0.2 mM），采集细胞对裂解产物进行CAT活性测定。结果的量化为由磷光体成像仪执行；CAT活性水平溶剂处理的细胞设置为1。所示数据为三种方法的平均值独立实验。
图2
图2
PKC参与Nrf2的核定位。(A类)用二甲基亚砜（对照）、tBHQ处理HepG2细胞（100μM）或PMA（100 nM）4小时。Nrf2定位为使用抗Nrf2抗体进行免疫细胞化学检测，然后FITC-结合二级抗体。要确认细胞核，同一场的PI复染分别显示并用Nrf2免疫荧光覆盖。(B类)HepG2型用溶剂或staurosporine（15 nM）预培养细胞暴露于tBHQ（100μM）4小时前1小时，Nrf2免疫荧光监测为A类.(C类)对HepG2细胞进行亚细胞分级tBHQ（100μM）或PMA（100 nM）处理1小时后是否存在staurosporine（15 nM）。80微克细胞溶质部分和20μg核部分的蛋白质通过SDS/PAGE进行解析。Nrf2蛋白的相对量用抗Nrf2蛋白免疫印迹法测定每种蛋白的表达抗体后进行增强化学发光检测。
图3
图3
HepG2细胞中Nrf2的磷酸化。HepG2细胞代谢标记为[32P] 正磷酸盐，然后是用抗Nrf2抗体免疫沉淀细胞裂解物。这个免疫沉淀物用SDS/PAGE和放射自显影分析。细胞暴露于tBHQ（100μM）、βNF（50 mM）或PMA（100 nM）在裂解前的指定时间。使用模拟免疫沉淀正常兔IgG未恢复任何磷酸蛋白。
图4
图4
PKC参与Nrf2磷酸化体内.32HepG2细胞的P标记后如图3所示的Nrf2免疫沉淀。(A类)细胞是用tBHQ（100μM）、βNF（50μM）或PMA（100 nM）处理30分钟，在溶剂或15 nM中预培养1小时后葡萄孢菌素。(B类)细胞暴露于tBHQ（100μM）30分钟，在溶剂中预培养1小时后，staurosporine（15 nM）、U0126（10 mM）或SB203580（10μM）。
图5
图5
体外PKC对Nrf2的磷酸化。在体外使用纯化的Nrf2和大鼠脑PKC的催化亚单位。(A类)Nrf2（2 mM）为用5 mM PKC和2 mCi的[γ]孵育-33P] ATP用于30°C时的指示时间。反应产物的分析方法如下SDS/PAGE和放射自显影。[γ-33P] 列车自动防护系统用荧光成像仪定量掺入。(B类)在30°C的温度下，在存在不同浓度的staurosporine或Ro-32-0432。
图6
图6
抗氧化剂诱导PKC对Nrf2活性增加。PKC是HepG2细胞裂解物中抗PKC抗体的免疫沉淀用tBHQ（100 mM）或PMA（100 nM）处理指定时间。PKC公司通过将抗PKC免疫复合物与纯化Nrf2和[γ-33P] ATP在30°C下持续30分钟。定量由荧光成像仪进行。结果如下典型的三个单独的实验。Nrf2没有磷酸化正常家兔模拟免疫复合物激酶试验观察IgG。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Scandalios J G，编辑。氧化应激与抗氧化防御的分子生物学。纽约州普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1997
    1. Sies H.Eur生物化学杂志。1993;215:213–219.-公共医学
    1. Berlett B S，Stadtman E R.J生物化学。1997;272:20313–20316.-公共医学
    1. Jacobson M D.趋势生物化学科学。1996;21:83–86.-公共医学
    1. Cerutti P A.科学。1985;227:375–381.-公共医学

MeSH术语

LinkOut-更多资源