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单元格。作者手稿；2017年9月22日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2016年9月22日；167（1）：233–247.e17。
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2016.08.056
预防性维修识别码：项目编号：5062609
NIHMSID公司：NIHMS813126
PMID：27662091

编辑哺乳动物基因组中的DNA甲基化

X肖恩·刘,1,5 郝武,1,5 熊基,1,三 约纳坦·斯特泽尔,1 吴学兵,1 Szymon Czauderna公司,1,4 健舒,1 丹尼尔·达顿,1,2 理查德·A·杨,1,2和鲁道夫·杰尼什1,2,6,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

哺乳动物DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，在许多生物过程中协调基因表达网络。然而，对特定甲基化事件功能的研究仍然具有挑战性。在这里，我们证明Tet1或Dnmt3a与催化失活的Cas9（dCas9）的融合能够实现靶向DNA甲基化编辑。将dCas9-Tet1或-Dnmt3a融合蛋白靶向甲基化或非甲基化启动子序列分别导致内源性报告子的激活或沉默。靶向去甲基化BDNF公司启动子IV或MyoD公司dCas9-Tet1远端增强子分别诱导有丝分裂后神经元BDNF表达或激活MyoD促进成纤维细胞重编程为成肌细胞。有针对性的从头开始通过dCas9-Dnmt3a使CTCF环锚定点甲基化，阻断CTCF结合并干扰DNA环，导致相邻环中的基因表达改变。最后，我们表明，这些工具可以编辑小鼠的DNA甲基化，证明了它们在表观遗传调控功能研究中的广泛用途。

图形摘要

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引言

哺乳动物5-胞嘧啶的DNA甲基化在许多生物过程中起着关键作用，包括基因组印迹、细胞命运决定、染色质结构组织和基因表达调控(伯德，2002;Jaenisch和Bird，2003年;Smith和Meissner，2013年). 遗传学研究表明，DNA甲基化对哺乳动物的发育和适应环境信号至关重要(Jaenisch和Bird，2003年). 在癌症和神经疾病中观察到异常DNA甲基化(罗伯逊，2005年). 由于测序技术的进步，许多类型的人类和小鼠细胞和组织的单核苷酸分辨率甲基化图谱被描绘出来(李斯特等人，2013年;李斯特等人，2009年). 重要的是，这些图谱允许在正常发育和疾病的不同阶段以碱基对分辨率识别差异甲基化区域（DMR）(De Jager等人，2014年;Landau等人，2014年). 然而，由于缺乏适当的分子工具，无法以有针对性的方式有效编辑DNA甲基化，因此对这些DMR的功能重要性的研究仍然是一个挑战。

我们开始通过将DNA甲基化途径中的关键酶与可重新编程的序列特异性DNA靶向分子机制杂交来建立这样一个工具箱。DNA甲基化由两个因素决定从头开始DNA甲基转移酶（Dnmt3a/b），由Dnmt1维持(Smith和Meissner，2013年). 发育过程中的基因激活与启动子和增强子序列的去甲基化有关，最为人所知的机制是通过抑制Dnmt1进行被动去甲基化。此外，脱甲基可以通过TET（十-十一易位）双加氧酶氧化甲基形成5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），然后通过DNA复制依赖性稀释或DNA糖苷酶启动的碱基切除修复（BER）恢复为未修饰的胞嘧啶来实现，一种称为主动去甲基化的过程，建议在特定的发育阶段进行，如植入前胚胎或有丝分裂后神经元(Wu和Zhang，2014年).

簇状规则间隔回文重复序列（CRISPR）是一种II型细菌适应性免疫系统，已被修改以将Cas9核酸酶靶向所需的基因组位点，并使用序列特异性指导RNA进行基因组编辑(Cong等人，2013年;Jinek等人，2012年;马里等，2013年). 重要的是，在多个系统中产生了一种催化活性不活跃的Cas9（dCas9），并将其作为DNA靶向模块进行工程，以带来诸如转录激活物/抑制物、染色质修饰物和绿色荧光蛋白等效应蛋白来调节基因表达，修饰染色质，并分别对基因组位点进行成像(Chen等人，2013年;Gilbert等人，2013年;希尔顿等人，2015年;Jinek等人，2012年;Konermann等人，2015年;Qi等人，2013).

在本研究中，我们证明了dCas9与Tet1酶域或Dnmt3a的融合分别允许靶向擦除或建立DNA甲基化。作为原理证明，我们首先在整合在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的两个合成甲基化报告子中诱导DNA甲基化的改变。我们的结果表明BDNF公司启动子IV足以激活其在小鼠皮层神经元中的表达，并靶向MyoD公司远端增强子促进成纤维细胞重编程为成肌细胞并促进肌管形成。利用dCas9-Dnmt3a，我们证明CTCF结合位点的靶向甲基化能够阻止CTCF募集，并通过增加其与靶向环中绝缘的超增强子的相互作用频率来改变邻域环中基因的表达。此外，dCas9-Tet1与靶gRNAs的慢病毒传递可使小鼠获得体内通过启动子去甲基化激活甲基化报告子。因此，dCas9-Tet1和dCas9-Dnmt3a提供了强有力的工具来研究DNA甲基化在特定位置的功能意义。

结果

修改的CRISPR系统编辑DNA甲基化

为了实现DNA甲基化的目标编辑，我们将dCas9与甲基化/去甲基化途径中的酶融合(图1A). 基于先前使用TALE系统靶向特定CpG的研究(Bernstein等人，2015年;Maeder等人，2013年)在我们的系统中，Tet1和Dnmt3a被选为效应器。序列特异性引导RNA（gRNA）的共表达有望将dCas9-Tet1或dCas9-Dnmt3a靶向特定位点，并在不改变DNA序列的情况下介导DNA甲基化状态的改变。为了优化嵌合CRISPR/dCas9效应器系统，我们在不同位置测试了两种带有核定位信号（NLS）的dCas9-Tet1慢病毒结构：dCas9-NLS-Tet1和NLS-dCas9-NSS-Tet1(图S1A和S1B). 我们还测试了两种类型的gRNA慢病毒结构，一种广泛使用的嵌合单导向RNA，称为gRNA(Jinek等人，2012年)和一种改良的引导RNA，其引导Cas9到达被称为E-gRNA的设计基因组位点的能力增强(Chen等人，2013年). 两种gRNA结构都包含[希神]普洛选择盒和樱桃荧光蛋白盒由独立CMV启动子驱动，允许慢病毒转导后gRNA-表达细胞的荧光激活细胞分选（FACS）(图S1A). 这些结构体的特征表明，dCas9-NLS-Tet1结构体的gRNA诱导的核转位很强(图S1C–E)因此，为了尽量减少DNA的非特异性修饰，在所有实验中都选择了这种结构。两种gRNA表现相似(图S1C-E)因此可以互换使用。

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dCas9-Tet1激活Dazl-Srrpn-GFP报告子。

（A） 上面板：催化非活性突变体Cas9（dCas9）的示意图，与Tet1融合以消除DNA甲基化，与Dnmt3a融合以消除从头开始特定序列的甲基化。下面板：一个优化的dCas9效应器构建和一个带有[希神]普洛和樱桃磁带。

（B） 目标的示意图Snarpn公司启动子区由dCas9-Tet1和特异性gRNAs清除甲基化并激活GFP表达。

（C） 用表达dCas9-Tet1（dC-T）的慢病毒感染Dazl-Srrpn-GFP mESCs，慢病毒带有一个打乱的gRNA（sc gRNA）或4 gRNA靶向Snarpn公司启动子区（靶gRNA）。感染后3天通过流式细胞仪分析计算这些细胞的GFP阳性细胞百分比，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。

（D） 左，培养1周后C中分类樱桃阳性细胞的代表性荧光图像。比例尺：250 um。右，量化GFP阳性菌落的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。

（E） C中描述的细胞亚硫酸氢盐测序。

（F） 中单个CpG的甲基化水平Snarpn公司启动子区及其邻近区域达兹尔轨迹。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。另请参见图S1和第2页。

dCas9-Tet1和dCas9-Dnmt3a能够靶向改变CpG甲基化状态

评估dCas9-Tet1和-Dnmt3a融合构建物是否会诱导去甲基化或从头开始分别对特定序列进行甲基化，我们使用了我们实验室先前开发的甲基化报告系统(Stelzer等人，2015年). 该报告系统由合成的甲基化感应启动子（来自印迹基因启动子的保守序列元件，Snarpn公司)控制绿色荧光蛋白（GFP）的表达。将该报告构建物插入基因组位点，可以忠实地报告相邻序列的甲基化状态(Stelzer等人，2015年).

a.特定CpG的脱甲基

为了测试定义的序列是否可以去甲基化，我们引入了dCas9-Tet1结构与gRNAs结合，以靶向插入到达兹尔发起人(图1B和图S2A).达兹尔是一种生殖细胞特异性基因，在ES细胞中高度甲基化且不活跃，因此GFP报告基因不表达。为了通过dCas9-Tet1激活GFP表达，我们设计了4个gRNAs，靶向细胞内所有14个CpGSnarpn公司启动子区。在感染共同表达dCas9-Tet1和4个gRNAs的慢病毒载体三天后，一些由gRNA构建物表达的Cherry阳性信号标记的感染阳性细胞开始启动GFP(图S2B). 为了评估dCas9-Tet1与靶gRNAs的激活效率，我们使用FACS分析了两种病毒感染的细胞。在樱桃阳性的人群中，约26%的靶gRNA细胞激活了GFP，而只有1%的带有干扰gRNA的细胞是GFP阳性(图1C和图S2C). 进一步培养这些樱桃阳性单细胞，以形成ES细胞集落。含有靶gRNA而非干扰gRNA的细胞表达GFP(图1D). 为了证实GFP在这些细胞中的激活是由Snarpn公司启动子，我们对这些样本的基因组DNA进行了亚硫酸氢盐测序。如所示图1E和1F，来自具有靶gRNA的细胞的样品仅在Snarpn公司启动子区，但不是相邻的达兹尔基因座和带有干扰gRNA的细胞样本显示出与未感染（模拟）对照相似的甲基化状态。我们进一步分析了受感染的Cherry阳性细胞中的GFP阳性和阴性群体。如所示图S2D，更强劲的去甲基化Snarpn公司在双阳性细胞（Cherry+；GFP+）中观察到启动子区。这些结果证实了增殖细胞中dCas9-Tet1与gRNAs靶向清除DNA甲基化。

b.特定CpG的从头甲基化

评估dCas9-Dnmt3a融合蛋白是否可以从头开始甲基化启动子序列和沉默基因表达，我们使用携带Snarpn-GFP报告子的细胞Gapdh公司发起人。这些细胞GFP阳性是因为Gapdh公司未甲基化并在ES细胞中表达(Stelzer等人，2015年). 我们用表达dCas9-Dnmt3a和gRNAs的慢病毒感染Gapdh-Srrpn-GFP ESCsSnarpn公司启动子或扰乱的gRNA(图2A和图S2E)然后进行FACS分析。在感染阳性（樱桃阳性）人群中，约12%的靶gRNA细胞使GFP失活，而只有2%的带有干扰gRNA的细胞是GFP阴性(图2B和S2F（平方英尺）). 当樱桃阳性细胞在培养基中生长时，带有目标gRNA的细胞的GFP表达保持关闭，而带有打乱gRNA和模拟对照的细胞保持GFP阳性(图2C). 此外，亚硫酸氢盐测序表明，dCas9-Dnmt3a/gRNAs的转导导致DNA甲基化显著增加Snarpn公司启动子区，但不在邻近区域Gapdh公司地区(图2D和2E). 对受感染的Cherry阳性细胞中GFP阳性和阴性人群的进一步分析表明Snarpn公司樱桃+基因启动子区；GFP-细胞(图S2G). 为了克服dCas9-Dnmt3a和gRNA慢病毒共转导效率低可能造成的限制，使用PiggyBac转座子系统将多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a表达盒整合到Gapdh-Snrpn-GFP mES细胞系中(图S2H). 在交付同一组靶gRNAs后，FACS分析显示GFP灭活效率提高到25%(图2F和S2I公司). 经筛选的Cherry阳性细胞在多西环素处理后显示GFP表达缺失(图2G)并且在Snarpn公司启动子区(图2H). 我们还产生了dCas9-Dnmt3a-P2A-BFP的新构建体，其能够通过FACS分离表达dCas9-Dnmt3a的细胞~慢病毒将该构建物与gRNAs一起传递给FACS分选的双阳性细胞（BFP+；Cherry+）后，GFP灭活效率达到70%(图S2J).

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dCas9-Dnmt3a沉默Gapdh-Srrpn-GFP记者。

（A） 目标的示意图Snarpn公司启动子区由dCas9-Dnmt3a与特定gRNAs甲基化启动子并沉默GFP表达。

（B） Gapdh-Srrpn-GFP mESCs被表达dCas9-Dnmt3a（dC-D）的慢病毒感染，慢病毒带有一个打乱的gRNA（sc gRNA）或靶向Snarpn公司启动子区（靶gRNA）。感染后3天通过流式细胞仪分析计算GFP阴性细胞的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。

（C） 左，培养1周后B中分类的樱桃阳性细胞的代表性荧光图像。比例尺：250 um。对，GFP阴性菌落的百分比进行了量化，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。

（D） B中描述的细胞亚硫酸氢盐测序。

（E） 中单个CpG的甲基化水平Snarpn公司启动子区及其邻近区域Gapdh公司轨迹。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。

（F） Gapdh-Srrpn-GFP mESCs与多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a被表达gRNAs的慢病毒感染Snarpn公司多西环素（2 ug/ml）存在下的启动子区域。感染后3天通过流式细胞仪分析计算GFP阴性细胞的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。

（G） 左侧，F中分类的樱桃阳性菌群在使用或不使用多西环素培养1周后的代表性荧光图像。比例尺：250 um。对，GFP阴性菌落的百分比进行了量化，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。

（H） 中每个CpG的甲基化水平Snarpn公司启动子区及其邻近区域Gapdh公司G中细胞的位点表示两个生物复制品的平均百分比±SD。另请参见图S2。

总之，我们的结果表明，上述dCas9融合结构要么有效地去甲基化序列（dCas9-Tet1），要么从头开始当特定导向RNA靶向时，分裂细胞中的甲基化非甲基化序列（dCas9-Dnmt3a）。

基于dCas9和TALE的甲基化编辑的比较

为了比较dCas9-Tet1/Dnmt3a和基于TALE的方法的甲基化编辑效率和有效范围，我们选择了两个先前报道的基于TALE方法编辑的位点(Bernstein等人，2015年;Maeder等人，2013年)并设计了一个单一的gRNA靶向由TALE-Tet1/Dnmt3a结合的同一位点的dCas9-Tet1/Dnmt3。如所示图S3A和S3C，dCas9-Dnmt3a，其中一个gRNA靶向第16页该位点诱导的甲基化平均增加了25%，位于第16页而TALE-Dnmt3a仅在650 bp的区域内诱导13%的增加。类似地，dCas9-Tet1与一个单一gRNA靶向RHOXF2型该基因座在150 bp区域内诱导甲基化平均下降28%RHOXF2型启动子而TALE-Tet1仅在200 bp区域内诱导14%的减少(图S3B和S3C). 这些结果表明，与基于TALE的方法相比，dCas9-Tet1/Dnmt3a系统在甲基化编辑方面具有更高的效率和分辨率。

为了评估dCas9-Tet1/Dnmt3a介导的甲基化编辑的特异性，我们进行了dCas9-ChIP-seq分析，并在靶向细胞的gRNAs存在的情况下鉴定了9个结合位点Dazl-Snrpn公司中描述的区域图S2A和18个结合位点，在靶向与290英里轨迹（见下文图S6A).图S3D表明在每一组gRNAs的已识别结合位点中，目标位点(Dazl-Snrpn公司或290英里)显示了dCas9-Dnmt3a的最高结合水平(表S1). 每个靶位点的第二和第三强结合位点如图所示图S3E这些基因座的亚硫酸氢盐测序分析显示甲基化水平只有微小变化(图S3F和S3G)可能是因为与目标基因座相比，dCas9-Dnmt3a/Tet1在这些非目标基因座上的结合亲和力显著降低。这些结果表明，基于dCas9的表观遗传编辑具有高度的特异性。

靶向去甲基化BDNF公司启动子IV激活神经元中的BDNF

DNA复制无关的主动去甲基化被提议用于有丝分裂后神经元(郭等，2011;Martinowich等人，2003年). 为了测试是否可以在有丝分裂后的神经元中诱导主动去甲基化，我们应用dCas9-Tet1系统来研究细胞凋亡的调节BDNF公司基因。BDNF的表达可由伴随其启动子IV去甲基化的神经元活动诱导(Chen等人，2003年;Martinowich等人，2003年). 我们设计了4个针对11个CpG的gRNAsBDNF公司启动子IV(图S4A)确定dCas9-Tet1是否可以通过诱导该启动子去甲基化来激活BDNF(图3A). 从E17.5胚胎中分离小鼠皮层神经元并培养两天体外（DIV2）遵循既定的实验程序进行原代神经元培养(Ebert等人，2013年). 如所示图S4B-DKCl处理诱导这些神经元表达BDNF，但未检测到细胞增殖。培养第3天的神经元（DIV3）被表达dCas9-Tet1的慢病毒载体感染，无论是否含有4个gRNAs，其转导效率几乎为100%(图S4E). 感染后48小时，用KCl处理一些培养物以诱导神经元活动。如所示图3B和3CdCas9-Tet1/gRNAs诱导BDNF表达约6倍，而在没有gRNAs的情况下，dCas9-Tet1仅表现出轻微的诱导（少于2倍），而催化死亡形式的Tet1（dC-dT）没有诱导。重要的是，同一组dCas9-Tet1/gRNA没有诱导Npas4型表达式(图S4F)，另一种神经元活动诱导基因(Lin等人，2008年). dCas9-Tet1与靶向BDNF公司启动子IV显示出2–3倍的BDNF诱导(图S4G). 我们进行了亚硫酸氢盐测序，以检测BDNF公司启动子IV。如所示图3D和3E与gRNA阴性对照组相比，dCas9-Tet1/gRNAs显著降低了该区域的甲基化，而KCl处理也诱导了CpGs在−148、−66和19位置（相对于转录起始点）的去甲基化。

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靶向去甲基化BDNF公司启动子IV通过dCas9-Tet1激活神经元中的BDNF。

（A） 瞄准示意图BDNF公司启动子IV通过dCas9-Tet1（dC-T）与特定gRNAs清除甲基化并激活BDNF表达。

（B） 培养的小鼠皮层神经元体外用表达dC-T的慢病毒感染3天（DIV3），所述慢病毒具有或不具有靶向BDNF公司促进剂IV或催化死亡形式的Tet1（dC-dT）BDNF公司gRNAs 2天，然后在采集用于RT-qPCR分析之前，使用或不使用KCl（50 mM）处理6小时。条形图是三个生物复制品的平均值±SD。

（C） B中BDNF诱导的典型共焦图像。MAP2（顶部两个面板）或樱桃色（底部两个面板的）为红色，BDNF为绿色，DAPI为蓝色，dCas9为灰色。比例尺：50 um。

（D） C.神经元亚硫酸氢盐序列测定。

（E） 中每个CpG的甲基化水平BDNF公司启动子IV区。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。

另请参见图S4。

我们的结果表明BDNF公司启动子IV可由dCas9-Tet1/gRNAs诱导，足以激活BDNF表达。因为有丝分裂后的神经元被用于这些实验，甲基化的丧失很可能是由于活跃的去甲基化。为了进一步支持这一结论，我们检测了BDNF公司启动子IV在dCas9-Tet1通过Tet-assisted Bissublite sequencing（TAB-seq）分析诱导去甲基化的时间过程中。如所示图S4H感染dCas9-Tet1和gRNA慢病毒40小时后检测到5-hmC，60小时后减少。同样，KCl处理后也检测到5-hmC(图S4I). 由于亚硫酸氢钠测序方法无法区分5-hmC产生的非甲基化5-胞嘧啶（5-C）和5-甲氧基胞嘧啶/5-羧基胞嘧啶（5fC/5-caC），因此可能一些CpG在以dCas9-Tet1/gRNA为靶点后被5-fC/5-caC修饰。然而，用ABT-888（PARP抑制剂）治疗抑制基底切除修复通路可减少KCl治疗对BDNF的激活(图S4J)，表明去甲基化BDNF公司启动子IV有助于BDNF的激活。

为了测试内源性Tet活性是否需要在神经元活动刺激时调节BDNF的表达，我们用2-羟基谷氨酸（α-酮戊二酸依赖性氧合酶的竞争性抑制剂，包括Tet酶）处理DIV3神经元(Xu等人，2011年). 如所示图S4K，对Tet酶活性的药理学抑制完全消除了KCl处理对BDNF表达的诱导。此外，携带Tet1缺失突变体的小鼠初级皮层神经元显示BDNF的激活动力学显著减弱(图S4L)，支持内源性Tet在诱导神经元活动中的作用。

靶向去甲基化MyoD公司远端增强子促进成纤维细胞肌源性重编程

MyoD作为肌肉发育主调节因子的作用最初是通过观察到5-Aza（5-Aza-2'-脱氧胞苷）处理使成纤维细胞中的DNA去甲基化导致MyoD的激活以及随后的成肌细胞转化和肌管形成来确定的(Constantinides等人，1977年;Davis等人，1987年;Lassar等人，1986年). 在50 kb的上游区域内描述了六种肌肉特异性DMRMyoD公司基因(Schultz等人，2015年)和DMR-5与已知的远端增强子重叠MyoD公司(Brunk等人，1996年)如所示图4A为了测试DMR-5去甲基化是否会激活成纤维细胞中的MyoD，我们设计了4个针对DMR的gRNA(图S5A). dCas9-Tet1与这些gRNAs在C3H10T1/2细胞中的共表达，C3H10T2/2细胞是以前用于5-Aza介导的MyoD激活的小鼠胚胎成纤维细胞的亚克隆(Constantinides等人，1977年)，导致MyoD表达适度诱导（3倍），如图4B.dCas9-Tet1组合/MyoD公司DMR-5 gRNAs与5-Aza治疗导致MyoD的诱导率较高，如图S5F亚硫酸氢盐测序显示，用dCas9-Tet1和靶gRNAs慢病毒转导的分选感染阳性细胞的DMR-5区域甲基化显著降低，但没有用催化死亡的Tet1（dC-dT）或扰乱的gRNA(图4C和4D). 调查MyoD公司远端增强子区可以将成纤维细胞重新编程为肌肉细胞，我们用表达dCas9-Tet1和gRNAs的慢病毒感染C3H10T1/2细胞。细胞培养14天，分析MyoD和MHC（肌球蛋白重链，肌管特异性标记物）的表达。如所示图4E和4FdCas9-Tet1与靶向DMR-5的gRNAs的联合表达诱导了MyoD的中等表达水平，但在没有5-Aza治疗的情况下不足以诱导肌管形成。

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靶向去甲基化MyoD公司dCas9-Tet1促进成纤维细胞向成肌细胞转化的远端增强子。

（A） 目标的示意图MyoD公司通过dCas9-Tet1（dC-T）和特异性gRNAs在DMR-5中的远端增强子（DE）区域。

（B） 用目标gRNAs表达dC-T的慢病毒感染C3H10T1/2细胞，或用目标gRNA表达催化死亡形式的Tet1（dC-dT），持续2天。樱桃阳性细胞经FACS筛选后进行RT-qPCR分析。条形图代表三个实验重复的平均值±标准差。

（C） B.细胞亚硫酸氢盐测序。

（D） 中单个CpG的甲基化水平MyoD公司DE区域。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。

（E） 成纤维细胞-成肌细胞转化试验第14天C3H10T1/2细胞的典型共焦图像。MyoD为绿色，MHC为洋红色，DAPI为蓝色。比例尺：200 um。

（F） 用靶向DMR-5的gRNAs对仅表达dC-T、dC-T或dC-dT的慢病毒感染14天后MyoD阳性细胞比率进行量化。

（G） 感染后14天，基于每个MHC+簇的细胞核数的MHC阳性细胞簇分布情况（分为2-5、6-10、11-20和>20个细胞核/MHC+束）。

（H） 感染后14天，具有2个或5个以上细胞核的MHC阳性簇中肌管密度的定量。从3-5张F-H代表性图像中量化数据。条形图表示平均值±标准偏差。

另请参见图S5。

然后我们研究了DMR-5的靶向去甲基化是否会与5-Aza治疗协同诱导肌管形成(图S5B). 为了跟踪5-Aza治疗后肌管的形成过程，进行了一个时间过程实验。治疗后14天，大小不等的多核肌管（MHC阳性）开始形成，MyoD阳性细胞比率和肌管密度和大小随后增加到25天(图S5C–E). dCas9-Tet1与gRNAs靶向共表达MyoD公司与仅表达dCas9-Tet1或dC-dT的细胞相比，DMR-5在治疗后14天促进了肌管的形成，表现为明显更成熟的多核MHC+簇（每个MHC+团>2个核）MyoD公司DMR-5 gRNA(图4E、4G和4H). 在治疗后的稍后时间点（16天）对细胞进行分析时，也进行了类似的观察(图S5G–J). 我们的结果表明MyoD公司dCas9-Tet1/gRNA远端增强子与C3H10T1/2细胞中的5-Aza协同作用，显著促进成肌细胞转化和肌管形成。

有针对性的从头开始CTCF结合位点甲基化改变CTCF介导的染色质环

CTCF是一种高度保守的锌指蛋白，在染色质结构的全球组织中起主要作用(菲利普斯和科尔塞斯，2009年). 转录增强子通常通过DNA环的形成与其靶基因相互作用(Gibcus和Dekker，2013年;Gorkin等人，2014年;Kagey等人，2010年)，通常被限制在较大的CTCF介导的环路内，称为绝缘社区(Dowen等人，2014年;Ji等人，2016年;Phillips-Cremes等人，2013年)，这反过来可以形成循环簇，有助于拓扑关联域（TAD）(Dixon等人，2012年;Nora等人，2012年). 绝缘社区CTCF环锚定位点的缺失会导致增强子与环外基因发生不适当的相互作用，从而增加其表达(Dowen等人，2014年). 有趣的是，据报道CTCF的DNA识别位点甲基化可以阻断CTCF结合(贝尔和费尔森菲尔德，2000年;Wang等人，2012年). 为了研究特定CTCF位点的甲基化是否会改变CTCF介导的染色质环，我们将dCas9-Dnmt3a系统应用于靶向CTCF锚定位点(图5A). 我们设计了特定的gRNAs(图S6)将dCas9-Dnmt3a定位于两个CTCF站点，以调查是否从头开始甲基化会干扰CTCF的循环功能(图5B和5F). 多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a mES细胞(图S2H)被表达gRNAs的慢病毒感染，转导的细胞经FACS分类进行后续分析。

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CTCF结合位点的靶向甲基化。

（A） dCas9-Dnmt3a靶向CTCF结合位点的示意图从头开始甲基化，阻断CTCF募集，打开CTCF环，改变相邻环中的基因表达。

（B） CTCF目标-1的示意图(290英里基因座）与超级增强器和290英里在循环中，8091年8月1日左邻接环中的基因，以及第12页右邻近环中的基因（靠近靶向CTCF结合位点）。这个Myadm公司基因位于包含第12页。超级增强器域以红色条表示。目标CTCF站点用方框突出显示。图中还显示了黑色CTCF和红色H3K27Ac（超级增强器）的ChIP-seq结合谱（每对碱基百万读数），以及黄色甲基化轨道和蓝色DMR。

（C–E）多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a mESCs被表达扰乱gRNA或CTCF靶1 gRNA的慢病毒感染。对樱桃阳性细胞进行FACS分类，在多西环素存在下培养，然后在C中采集用于RT-qPCR分析，在D&E中进行亚硫酸氢序列分析。条形图表示三个实验重复的平均值±SD。

（F） 具有超级增强子和Pou5f1基因的CTCF靶标-2在该环中的示意图，如在B中。

（G–I）按照C-E中的描述，对CTCF靶点-2进行了相同的一组实验，并采集细胞进行RT-qPCR分析，如C中所述，并进行亚硫酸氢盐测序，如D和E中所述。条形代表三个实验重复的平均值±SD。

另请参见图S6。

将dCas9-Dnmt3a靶向与290英里容纳超级增强器的环路(图5B)诱导的从头开始该位点CpG甲基化(图5D和5E). 转基因细胞的基因表达分析显示第12页该基因位于含有超增强子的绝缘邻域之外，紧邻靶向CTCF位点，但不影响位于细胞内的基因的表达290英里环或其他相邻环中的基因，包括2008年8月1日和Myadm公司(图5C). 类似地，将dCas9-Dnmt3a靶向与磅5f1含有另一种超增强子的基因环(图5F)CTCF结合序列中CpG的诱导甲基化(图5H和5I)，增加H2Q10的表达，H2Q10位于邻近的环中，紧邻靶向CTCF位点，但不影响磅5f1基因本身或19立方英尺另一个相邻环中的基因(图5G). 对于任一靶向CTCF位点，催化失活的Dnmt3a形式（dC-dD）并不像dC-D那样诱导甲基化水平或基因表达的变化(图5C-E和5G-I). 这些观察结果与删除这些CTCF站点时获得的结果一致(Dowen等人，2014年)支持CTCF结合位点甲基化干扰其绝缘体功能的观点。

为了测试CTCF结合位点的靶向甲基化是否会导致绝缘超增强子和激活基因之间的相互作用频率增加，在这些位点进行了染色体构象捕获（3C）分析。如所示图6A，超增强器之间的相互作用频率290英里loop和新激活的基因(第12页)在相邻回路中显著增加，但第12页和Myadm公司基因保持不变，表明该靶向CTCF环的开放构象。为了确认增加的相互作用频率是由于阻断CTCF锚定所致，我们进行了CTCF-ChIP分析。CTCF与靶向基因组位点的结合在具有290英里靶gRNAs与含有干扰gRNA、靶向其他CTCF结合位点或具有催化活性的dC-dD的样品相比290英里靶gRNA(图6B)支持DNA甲基化阻断CTCF锚定从而改变CTCF环构象的观点。对第二个CTCF环路进行了一组类似的实验(磅5f1loop）显示绝缘超增强子与新激活基因之间的相互作用频率增加(2010年第2季度)靶向甲基化结合位点后CTCF的结合降低(图6C和6D).

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靶向甲基化CTCF结合位点以操纵CTCF环。

（A） 细胞的定量染色体构象捕获（3C）分析图5C在290英里轨迹。超级增强器域以红色条表示。目标CTCF站点用方框突出显示。箭头表示分析相互作用频率的染色体位置。星号表示3C锚点。还显示了黑色CTCF和红色H3K27Ac（超级增强子）的ChIP-seq结合谱（百万碱基对读数），以及黄色DMR和蓝色DMR的甲基化轨迹。所示染色体位置和3C锚定位点之间的相互作用频率在底部面板上显示为条形图（平均值±SD）。qPCR反应重复进行，数值根据细胞内干扰gRNA的平均相互作用频率进行标准化。（所有三个区域均p<0.05；Student’s t检验，ns代表无显著性，NC代表阴性对照。）

（B） 使用A中的细胞进行抗-CTCF ChIP实验，然后进行定量PCR分析。条形图代表三个实验重复的平均值±标准差。

（C） 细胞的定量染色体构象捕获（3C）分析图5G在磅5f1A中的轨迹。

（D） 使用C中的细胞进行抗-CTCF ChIP实验，然后进行定量PCR分析。条形图代表三个实验重复的平均值±标准差。

总之，我们的结果表明，dCas9-Dnmt3a系统可用于改变特定CTCF锚定位点的甲基化状态，从而干扰CTCF循环功能。

体内dCas9-Tet1激活基因的内源性位点去甲基化

测试dCas9介导的DNA甲基化编辑工具是否可以用于改变甲基化体内我们使用了一个先前生成的甲基化敏感报告小鼠(图7A,Stelzer等人，单元格报告, 2016，按）。在这些转基因小鼠中，甲基化敏感的Snarpn-GFP盒被插入Dlk1-二极管3报告其基因间差异甲基化区域（IG-DMR）甲基化状态的基因座。当该基因座的IG-DMR在精子发生过程中获得父系甲基化时，GFP报告子GFP/专利)在携带父系Snarpn-GFP等位基因的杂合小鼠中被组成性抑制(Stelzer等人。，单元格报告, 2016，按）。如上所示，GFP报告人达兹尔靶向启动子去甲基化激活了mES细胞中的位点(图1). 评估Dlk1-二极管3在我们从IG-DMR尾部获得的成年小鼠皮肤成纤维细胞分化细胞中，dCas9-Tet1可以激活GFP位点报告子GFP/专利转基因小鼠，然后由表达dCas9-Tet1的慢病毒转导Snarpn公司靶gRNA或扰乱的gRNA，或具有催化活性的Tet1（dC-dT）死亡形式Snarpn公司靶gRNAs(图7A). 中的结果图7B和7C在约80%的Cherry（gRNA）阳性成纤维细胞中显示GFP报告基因激活，但仅当通过dCas9-Tet1和Snarpn公司gRNAs慢病毒。对这些细胞的FACS分析进一步证实了这一观点(图S7A–C).

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有针对性的体外和体内通过dCas9-Tet1进行DNA甲基化编辑以激活沉默的GFP报告基因。

（A） 演示实验程序的示意图体外在小鼠成纤维细胞中激活沉默的GFP报告子。小鼠尾部成纤维细胞来源于携带父亲IG-DMR-Snrpn-GFP等位基因（IG-DMR）的转基因小鼠系GFP/专利)在中Dlk1-二极管3轨迹。这个IG-DMR-Snrpn公司父系等位基因上的启动子被高度甲基化，因此GFP报告子构成性沉默。用表达dCas9-Tet1和gRNAs的慢病毒载体感染培养的成纤维细胞，使其去甲基化Snarpn公司启动并激活GFP报告子。

（B） IG-DMR的典型免疫组化图像GFP/专利感染慢病毒的成纤维细胞用sc-gRNA表达dCas9-Tet1（dC-TSnarpn公司靶gRNA或dCas9-Tet1Snarpn公司靶gRNA。红色代表樱桃，绿色代表GFP，DAPI代表细胞核。比例尺：100 um。

（C） IG-DMR百分比的量化GFP/专利樱桃（gRNAs）阳性细胞中GFP激活的小鼠成纤维细胞。条形图代表三个实验重复的平均值±标准差。

（D） 演示以下实验程序的示意图体内IG-DMR中GFP报告子的激活GFP/专利小鼠大脑。表达dC-T和sc-gRNA、dC-dT和Snarpn公司靶gRNAs、dC-T和Snarpn公司靶gRNAs通过立体定向微注射方法传递。大脑切片并用免疫组织化学方法进行分析。

（E） IG-DMR的代表性共焦显微照片GFP/专利感染dC-T和sc-gRNA、dC-dT和Snarpn公司靶gRNAs、dC-T和Snarpn公司靶gRNAs。只有带有靶gRNAs的dC-T激活了GFP表达。比例尺：100 um。

（F） E.装箱区域的共焦显微照片。樱桃为红色，GFP为绿色，E和F细胞核为DAPI。比例尺：25 um。

（G–H）IG-DMR百分比的量化GFP/专利绿色荧光蛋白激活的细胞中樱桃（gRNAs）阳性细胞体内慢病毒在大脑（G）和皮肤表皮（H）中的传递实验。横线表示来自2只动物的四个以上代表性图像的平均值±SD。

另请参见图S7。

研究DNA甲基化状态是否可以被修改体内，我们感染了IG-DMR腹侧的3个表皮部位GFP/专利dCas9-Tet1和Snarpn公司gRNA(图S7D). 仅在部分毛囊中见到樱桃表达的细胞被稀疏感染。dCas9-Tet1，带Snarpn公司gRNAs，但不包括dCas9-Tet1和扰乱的gRNA或dC-dTSnarpn公司gRNAs能够激活约85%感染皮肤真皮细胞中GFP报告基因的表达体内(图7H,S7E&F公司). 此外，我们感染了IG-DMR的大脑GFP/专利使用立体定向装置将慢病毒载体转基因小鼠，并通过共焦显微镜分析对脑切片中靶向DNA甲基化的影响。为了消除可能的诱导间变异，我们注射表达dCas9-Tet1和Snarpn公司gRNAs以及两种阴性控制载体组合到同一大脑的不同区域(图7D). 如所示图7E&F如Cherry表达所示，感染所有三种慢病毒组合后，只有表达dCas9-Tet1的慢病毒载体Snarpn公司gRNAs，但不是用sc gRNA或dC-dT表达dCas9-Tet1的载体Snarpn公司gRNAs激活GFP报告子，激活效率约为70%(图7G).

讨论

在本研究中，我们重新调整了CRISPR/Cas9系统的用途，以编辑基因组序列的甲基化状态。将无催化活性的Cas9蛋白（dCas9）融合到Tet1的催化结构域（dCas9-Tet1）或Dnmt3a（dCas9-Dnmt3a），以可预测地改变靶序列的表观遗传状态。一个GFP报告子插入甲基化和沉默的达兹尔当dCas9-Tet1靶向时，该基因被去甲基化并激活，而GFP报告基因插入到活性和非甲基化的启动子区域Gapdh公司基因是从头开始当被dCas9-Dnmt3a靶向时甲基化并沉默。当dCas9-Tet1针对非活性BDNF公司在有丝分裂后的神经元中，启动子IV被去甲基化并激活。重要的是，该工具可预测地改变了调节区的甲基化状态和活性：MyoD公司激活该基因并促进肌肉分化和CTCF锚定位点的靶向甲基化抑制CTCF结合并干扰其作为染色质环之间绝缘体的功能。最后，编辑工具可以体内将带有靶gRNAs的dCas9-Tet1慢病毒载体注射到转基因小鼠的真皮或大脑中，从而改变调节序列的甲基化状态Snarpn公司发起人Dlk1-二极管3印迹位点并激活甲基化敏感GFP报告子。

动态DNA甲基化被提出用于解码神经元活动(斯威特，2013). 例如，KCl对神经元的治疗已被证明是对神经元的去唾液酸启动子IVBDNF公司并诱导启动子区一些甲基化CpG去甲基化相关的BDNF表达(Chen等人，2003年;Martinowich等人，2003年). 当BDNF公司启动子IV被dCas9-Tet1靶向，观察到甲基化CpG的广泛去甲基化，BDNF被激活到与KCl处理培养物时相似的水平。由于神经元是有丝分裂后的，dCas9-Tet1介导的启动子序列去甲基化很可能是先前提出的主动去甲基化的结果(Wu和Zhang，2014年). 尽管有可能BDNF公司在用dCas9-Tet1/gRNA靶向后，启动子被修饰为5-fC/5-caC，通过抑制BER通路减少5-fC/5-caC向非甲基化胞嘧啶的恢复BDNF公司表达，表明BDNF公司启动子IV有助于激活BDNF公司重要的是，我们的结果在BDNF公司启动子IV和基因激活。

DNA甲基化作为细胞谱系间屏障的作用与之前的观察一致，即5-Aza处理后成纤维细胞中的DNA去甲基化可以激活MyoD并介导肌管形成(Constantinides等人，1977年). dCas9-Tet1靶向甲基化远端增强子MyoD公司在成纤维细胞中诱导CpG去甲基化，并导致MyoD公司但未能生成成肌细胞。然而，当dCas9-Tet1/gRNA慢病毒转导与5-Aza治疗相结合时，与单独5-Aza处理相比，观察到成肌细胞和肌管形成显著增强。可能需要将额外的DMR与远端增强子联合去甲基化，以诱导成纤维细胞有效转化为成肌细胞。

最近对哺乳动物染色体结构的研究表明，染色质组织在拓扑关联域和基因环中，由染色质结构蛋白如凝集素和CTCF介导(Dekker和Mirny，2016年). 新的数据表明，高阶染色质结构在发育过程中传递表观遗传信息，在癌症中经常发生改变(Ji等人，2016年;Narendra等人，2015年). 据报道，当CTCF的识别序列被甲基化时，CTCF的结合被抑制(贝尔和费尔森菲尔德，2000年;Wang等人，2012年). 诱导dCas9-Dnmt3a靶向两个CTCF结合位点从头开始这些位点中CpG的甲基化并干扰蛋白质的绝缘体功能，如靶环中的绝缘超增强子与相邻环中的基因之间的相互作用频率增加，导致这些基因的上调。这表明，dCas9-Dnmt3a系统是一种有用的工具，可用于控制染色质结构，并评估其在发育和疾病背景下的功能意义。

我们的结果表明，dCas9与表观遗传学效应物Tet1和Dnmt3a融合，代表了编辑特定基因组序列的DNA甲基化的强大工具箱。将这些工具与基于TALE的方法进行比较，显示出更高的甲基化编辑效率和分辨率，dCas9 ChIP-seq随后对潜在的非靶向结合位点进行亚硫酸氢盐测序，显示出甲基化水平的微小变化，表明适当设计的gRNAs可以实现高特异性。在我们手稿的准备过程中，Vojta等人还报道了融合了Dnmt3a的dCas9可以用于甲基化两个人类基因启动子(Vojta等人，2016年)Xu等人和Choudhury等人报告称，与Tet1融合的dCas9可用于去甲基化基因启动子(Choudhury等人，2016年;Xu等人，2016年). 因此，这些dCas9-Dnmt3a/Tet1工具将有助于深入了解DNA甲基化在不同生物过程中的功能重要性，例如基因表达、细胞命运决定和高阶染色质结构的组织。

方法和资源（6小节）

试剂和资源共享联系人

有关试剂的更多信息和要求，请联系通讯作者Rudolf Jaenisch(jaenisch@wi.mit.edu)

实验模型和受试者详细信息

小鼠品系和繁殖策略

Tet1突变小鼠之前是在我们的实验室中产生的(Dawlaty等人，2011年). 研究中的Tet1 KO小鼠维持在129和C57BL/6混合背景中。为了获得Tet1 KO小鼠，对Tet1杂合的雄性和雌性小鼠进行杂交。为了获得野生型小鼠初级皮层神经元，雄性和雌性C57BL/6小鼠交配。IG-DMR型GFP/专利甲基化报告鼠系的产生如所述（参考：Stelzer等人，小鼠发育过程中的亲本DNA甲基化动力学，单元格报告，按）。IG-DMR雄性小鼠GFP/专利报告等位基因与C57BL/6雌性杂交，产生携带父系遗传等位基因的成年后代体内DNA甲基化编辑分析。按照机构指南处理小鼠，并由动物护理委员会（CAC）和麻省理工学院比较医学系（DCM）批准。

小鼠原代皮层神经元培养、EDU标记及神经诱导

如前所述，从野生型或Tet1 KO小鼠胚胎中分离出E17.5皮层神经元培养物(Ebert等人，2013年). 简单地说，在含有1 X pen/strep（Gibco:15140122）、1 X丙酮酸（Gibco：11360070）和30 mM葡萄糖的冰镇1 X HBSS（Gibco-14185-052）中解剖E17.5皮质。组织被切成大约1毫米三并按照制造商的指示，使用木瓜蛋白酶神经组织分离系统（沃辛顿生化）进行分离。细胞在NM5培养基（%5 FBS（Hyclone）、2%B27补充剂（Gibco 17504044）、1 x pen/strep和1 x glutamax I（Gibco35050-061）中重新悬浮。1 x 106细胞在涂有聚-D-赖氨酸（PDL，Sigma）的6孔板上每孔进行电镀。在DIV2上，用2.5μM AraC（Sigma C-6645）处理细胞过夜，以消除有丝分裂星形胶质细胞和神经祖细胞的过度细胞分裂。用新鲜NM5培养基在DIV3培养基中培养，随后用50 mM KCl使膜去极化或感染首选慢病毒。我们从一开始就开始治疗体外因此，在KCl处理之前，AP5和TTX（河豚毒素）处理以沉默培养物中的基础活性的步骤被省略。对于EDU标记，根据制造商的说明（赛默飞世尔科技公司），用最终浓度为10μM的EDU处理原代神经元培养物24小时，然后进行点击式EDU标记程序。将细胞固定用于免疫组织化学分析，在Trizol中裂解以提取总RNA用于RT-qPCR，或裂解以提取DNA用于亚硫酸氢盐测序分析。

方法详细信息

质粒的设计和建造

PCR扩增pJFA344C7的Tet1催化域（Addgene质粒：49236）、MLM3739的Tet1-非活性催化域（添加基因质粒：49959）或pcDNA3-hDNMT3A的Dnmt3a（添加基因载体：35521），并将其克隆到带有BamHI和EcoRI位点的改良pdCas9质粒（添加基因基因质粒：44246）中。然后用PCR扩增dCas9-NLS-Tet1或dCas9-NLS-Dnmt3a，并将其克隆到带有AscI和EcoRI的FUW载体（Addgene质粒：14882）中包装慢病毒。NLS-dCas9-NLS-Tet1是通过将退火寡聚物（NLS）插入带有XbaI和AscI的FUW-dCas9-NLS-Tet1中克隆的。通过将退火寡核苷酸插入带有AarI位点的修饰pgRNA质粒（Addgene质粒：44248）中，克隆了gRNA表达质粒。用改良的PiggyBac转座子载体从FUW构建物中连接PCR-扩增的dCas9-NLS-Tet1或dCas9-NLS-Dnmt3a，克隆PiaggyBac-dCas9-Tet1和-dCas9-Dnmt3a(Wilson等人，2007年)用NheI和EcoRI。在转染前对所有结构进行测序。gRNA设计和构建的引物信息列于补充表S2相关质粒已存入Addgene质粒数据库。TALE-Dnmt3a构建靶向性第16页基因座是克劳斯·凯斯特纳博士的礼物，TALE-Tet1靶向RHOXF2型该位点来自Addgene（质粒#49943）。dCas9-Dnmt3a和dCas9-Tet1CD及其突变体的全长蛋白质序列列于补充表S6。

细胞培养、慢病毒生产和稳定细胞系生成

将小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养在照射过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，使用标准ESCs培养基：（500 ml）DMEM补充10%FBS（Hyclone）、10 ug重组白血病抑制因子（LIF）、0.1 mMβ-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）、青霉素/链霉素、1 mM L-谷氨酰胺、，和1%非必需氨基酸（全部来自Invitrogen）。C3H10T1/2细胞在含有10%FBS的标准DEME培养基中培养。表达dCas9-Tet1、dCas9-Dnmt3a和gRNAs的慢病毒是通过用FUW构建物或pgRNA构建物与标准包装载体（pCMV-dR8.74和pCMV-VSVG）转染HEK293T细胞，然后进行超离心浓缩产生的。根据293T细胞的感染效率计算病毒滴度（T），其中T=（P*N）/（V），T=滴度（TU/ul），P=荧光标记阳性细胞的%，N=转导时的细胞数，V=使用的病毒总体积。注：TU代表转导单元。为了用整合的多西环素诱导的dCas9-Tet1或dCas9-Dnmt3a转基因产生稳定的细胞系，PiggyBac-dCas9-Tetl或-dCas9-Dnm t3a构建物，以及表达转座酶的辅助质粒，使用X-tremeGENE 9转染试剂（Roche）转染到C3H10T1/2细胞，或使用Xfect转染试剂转染到mESCs细胞（Clontech），根据提供商的协议。用G418（400 ug/ml）筛选稳定整合细胞10天。成年小鼠成纤维细胞来源于IG-DMR尾部GFP/专利报告鼠。简单地说，从携带父亲传递的IG-DMR-Snrpn-GFP甲基化报告子的3个月大小鼠身上获得了长约2cm的小鼠尾巴，并用70%的EtOH灭菌用5 ml 1mg/ml胶原酶IV在37°C下在15 ml Falcon管中消化2 mm x 2 mm绞碎的尾片90 min。向试管中加入5 ml MEF培养基以终止消化。分离的细胞通过一个40微米的细胞过滤器挤压出来，用注射器塞轻轻研磨。然后收集细胞并培养用于病毒感染。本研究在感染后3天对细胞进行分析。

小鼠的病毒感染和组织样本制备

根据机构指南，并经动物护理委员会（CAC）和麻省理工学院比较医学系（DCM）批准，用适当的慢病毒鸡尾酒感染小鼠。具体来说，为了感染小鼠皮肤，通过Hamilton注射器将表达dCas9-Tet1和sc gRNA的慢病毒、带有靶gRNA的dC-dT的非活性突变体和带有靶gRNAs的dCas9-Tet1传递到携带父系IG-DMR的深度麻醉小鼠腹侧的多个皮肤部位GFP公司报告等位基因(图S7D). 为了感染小鼠大脑，通过立体定向装置（徕卡生物系统、BenchMark Digital stereotaxic with Manual Fine Drive）将各种慢病毒混合物输送到携带父亲IG-DMR的深度麻醉小鼠的以下位置（相对于Franklin和Paxinos小鼠脑图谱）GFP/专利报告基因(图7D)：dCas9-Tet1，带有sc gRNA（A-P 0.70mm，M-L 1.50mm，D-V 1.50mm），是dC-dT的一个非活性突变体Snarpn公司gRNAs（A-P−1.90mm，M-L−1.50mm，D-V 1.50mm）和dCas9-Tet1Snarpn公司gRNAs（A-P−1.90mm，M-L 1.50mm，D-V 1.50mm）。dC-T/dC-dT和gRNA慢病毒的滴度为1.2 x 104时间单位/ul和1.2 x 105分别为TU/ul。感染3天后处死小鼠。用4%多聚甲醛（PFA）/PBS经心灌注固定动物。解剖固定的皮肤垫和脑标本，用4%的多聚甲醛/PBS在4°C下过夜固定。大脑样本用震动器（Leica VT1100）在150微米厚处切片，皮肤样本用冷冻器（Leica）在10微米厚处进行切片，然后进行免疫组织化学分析。振动切片时，将组织包埋在3%琼脂糖凝胶中。对于冷冻切片，在包埋在最佳切割温度（OCT）化合物中之前，组织在30%蔗糖/PBS中平衡。

免疫组织化学、显微镜和图像分析

用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定神经元、HEK293T细胞、小鼠ES细胞和C3H10T1/2细胞10分钟。用PBST（1 x PBS溶液，含0.1%Triton x-100）使细胞渗透，然后用10%的正常驴血清（NDS）在PBST中阻断。然后用适当稀释的一级抗体在PBST（含5%NDS）中培养细胞，在室温下培养1小时，或在4°C下培养12小时，在室温下用PBST洗涤3次，然后在含有5%NDS和DAPI的TBST中与所需的二级抗体孵育，以反染细胞核。在用Fluoromount G（SouthernBiotech）将细胞安装到载玻片上之前，用PBST清洗细胞3次。先前描述了组织切片的免疫染色程序(Wu等人，2014a). 简言之，切片在RT下用PBST（1 x PBS溶液，含0.5%Triton x-100）渗透1小时，然后用10%的正常驴血清（NDS）在PBST中封闭。然后切片在4°C下与含有5%NDS的PBST中所需的一级抗体孵育24小时，在室温下用PBST洗涤3次，然后在含有5%NDS和DAPI的TBST中与二级抗体孵育，以反染细胞核。在滑动安装之前，用PBST清洗各部分3次。本研究中使用了以下抗体：鸡抗GFP（1:1000，Aves Labs）、小鼠抗Cas9（7A9，1:1000，Active Motif）、兔抗BDNF（1:1000、Thermo Fisher）、鸡抗MAP2（1:1000；Encor Biotech）、小鼠抗MAP2（1-1000，Sigma-Aldrich）、鼠抗Tuj1（1:1000）、，兔抗MyoD（C-20，1:1000，Santa Cruz Biotechnology）、鼠抗MHC（MF20，1:100，研发系统）、鼠抗MyoG（F5G，1:1000、Thermo Fisher）。图像在蔡司LSM710共焦显微镜上拍摄，并使用Zen软件、ImageJ/Fiji和Adobe Photoshop进行处理。对于基于成像的量化，除非另有规定，否则对3-5个代表性图像进行量化，并使用Excel或Graphpad将数据绘制为平均值±SD。

荧光辅助细胞筛选分析

为了评估治疗后GFP和/或Cherry阳性细胞的比例，用胰蛋白酶将处理过的细胞分离，并根据怀特黑德研究所流式细胞术核心的制造商协议，在BD-FACSAria细胞分选机的生长培养基中制备单细胞悬浮液。数据采用FlowJo软件进行分析。

成纤维细胞向成肌细胞转化试验

成肌细胞转化试验如前所述(Constantinides等人，1977年). 简单地说，C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞被镀成1 x 104然后感染表达dCas9-Tet1和靶gRNAs的慢病毒。感染后24小时，用载体对照（HEPES缓冲液）或5-氮杂胞苷（1uM）处理细胞24小时，并在不同的时间点收获，用于随后的分析。鼠标上游的DMRMyoD公司根据人类/小鼠基因组同源性定义基因(Schultz等人，2015年).

蛋白质印迹

按照制造商的方案，使用X-tremeGENE 9试剂将各种构建物转染HEK293T细胞。转染后2天，用带有蛋白酶抑制剂（Invitrogen）的RIPA缓冲液溶解细胞，并进行标准免疫印迹分析。使用小鼠抗Cas9抗体（1:1000，Active Motif）和小鼠α-Tubulin抗体（1:100，Sigma）。

逆转录聚合酶链式反应

根据制造商的说明，先使用Trizol，然后使用Direct-zol（Zymo Research）采集细胞。使用第一链cDNA合成（Invitrogen SuperScript III）将RNA转化为cDNA。用SYBR Green（Invitrogen）制备定量PCR反应，并在7900HT Fast ABI仪器中进行。RT-qPCR引物信息列于补充表S3。

ChIP分析

如前所述进行ChIP实验(Dowen等人，2014年). 简单地说，细胞在室温下用1%甲醛在培养基中交联10分钟，然后通过添加0.125 M甘氨酸淬火5分钟。收集的细胞用PBS洗涤两次，然后在3.5 ml超声缓冲液中重新悬浮。超声进行了10个周期，脉冲持续0.5分钟，休息1分钟，在冰-水混合物中为24瓦。然后以14000 x rpm在4°C下旋转细胞裂解液10分钟。保存50 ul上清液作为gDNA输入。添加10 ul抗CTCF抗体（EMD Millipore:07729）或抗Cas9抗体（活性Motif），并在4°C下培养过夜。将50 ul蛋白G动态微球添加到抗体-细胞裂解物混合物中，并在4°C下培养过夜。然后用超声缓冲液、高盐（500 mM NaCl）超声缓冲液，氯化锂清洗缓冲液和TE缓冲液清洗珠子。结合蛋白-DNA复合物在65°C烘箱中培养15分钟，从珠子中洗脱出来，然后在65°C下过夜反向交联。用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒纯化结合DNA，然后进行qPCR分析或测序。

ChIP-seq数据分析

使用先前报告的方法分析测序数据(Wu等人，2014b). 读取数据被解复用，前25个碱基使用STAR映射到小鼠基因组（mm10）(Dobin等人，2013年)，需要允许一个不匹配的唯一映射。映射读取被折叠，从每个样本中随机抽取相同数量的读取（约1500万），以匹配排序深度。使用MACS调用峰值(Zhang等人，2008年)使用默认设置。对于每个样本，其他五个样本分别用作控制，只有在所有五个控制上调用的峰值才被定义为候选峰值。通过背景富集倍数过滤候选峰，并选择阈值，使得在四个对照样品（输入、模拟IP、单独dCas9和加扰gRNA）中没有峰通过该阈值。请注意，分析中排除了映射到45S rRNA和线粒体DNA的输入中的六个候选峰值。原始数据可在以下链接中获得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token=ktohskmgnhudhud&acc=通用电气83890

亚硫酸氢盐转化、PCR和测序

按照制造商的说明，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（Qiagen）确定了DNA的亚硫酸氢转化。在第二轮使用位点特异性PCR引物后，通过第一轮巢式PCR扩增出修改后的DNA(补充表S3). 第一轮巢式PCR的操作如下：94°C，持续4分钟；55°C持续2分钟；72°C持续2分钟；重复步骤1–3 1 X；94°C持续1分钟；55°C持续2分钟；72°C持续2分钟；重复步骤5–7 35X；72°C持续5分钟；保持12°C。第二轮PCR为：95℃，4 min；94°C持续1分钟；55°C持续2分钟；72°C持续2分钟；重复步骤2–4 35 X；72°C持续5分钟；保持12°C。将得到的扩增产物进行凝胶纯化，亚克隆到pCR2.1-TOPO-TA克隆载体（Life technologies）中，并测序。亚硫酸氢盐测序的引物信息列于补充表S4。

位点特异性TAB-seq

如前所述执行TAB-Seq(Yu等人，2012年). 简单地说，在含有50 mM HEPES缓冲液（pH 8.0）、25 mM MgCl2、100 ng/ml模型DNA、200 mM UDP-Glc和1 mM bGT的溶液中，将来自处理过的小鼠皮层神经元的1 ug基因组DNA在37℃下葡萄糖化1小时。反应后，对DNA进行柱纯化。在含有50 mM HEPES缓冲液（pH 8.0）、100 mM硫酸铁铵（II）、1 mMα-酮戊二酸、2 mM抗坏血酸、2.5 mM DTT、100 mM-NaCl、1.2 mM ATP、15 ng/ml葡萄糖基化DNA和3 mM重组mTet1的溶液中进行氧化反应。反应在37℃下培养1小时。蛋白酶K处理后，DNA经柱纯化，然后按照供应商的指示应用于EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（QIAGEN）。在第二轮使用位点特异性PCR引物后，通过第一轮巢式PCR扩增出修改后的DNA(补充表S3). 将得到的扩增产物进行凝胶纯化，亚克隆到pJET克隆载体（Life technologies）中，并测序。亚硫酸氢盐测序的引物信息列于补充表S4。

染色体构象捕获（3C）分析

5 x 106mESCs在室温下用1%甲醛固定20分钟，反应在室温下用0.125M甘氨酸猝灭5分钟。收集交联细胞并用1 ml冰冷PBS清洗。用550µl裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM NaCl，0.2%IGEPAL CA630，蛋白酶抑制剂）重新悬浮细胞颗粒，并在冰上培养20分钟。然后用1 x NEB缓冲液2（NEB，B7002S）清洗细胞颗粒两次，然后在62°C下用50µl 0.5%十二烷基硫酸钠培养10分钟。加热后，145µl H2将O和25µl 10%Triton X-100添加到混合物中，并在37°C下培养15分钟。添加25µl 10 x NEB缓冲液2和100 U BglII（NEB，R0144S），在37°C的温度下过夜消化染色质。在62°C下培养20分钟，使消化反应失活。然后添加713µl H2O、120µl 10 x T4 DNA连接酶缓冲液（NEB，B0202）、100µl 10%Triton x-100、12µl 10mg/ml BSA和5µl T4 DNA连接酶（NEB、M0202），并在16°C下培养22小时。染色质反向交联，DNA通过苯酚：氯仿：异戊醇（Sigma，P3803）提取纯化。3C在290英里和磅5f1位点(图6A和6C)使用定制Taqman探针通过实时定量PCR进行分析。qPCR反应中的DNA数量在3C文库中使用针对Actb公司轨迹。底漆和探针序列列于补充表5。

量化和统计分析

统计参数，包括n的准确值、中心的定义、离散度和精度度量（平均值±SEM）以及统计显著性，在图和图图例中进行了报告。当p<0.05时，通过双尾学生T检验或双向方差分析（如适用）判断数据具有统计学意义。

数据和软件可用性

ChIP-seq分析的原始数据文件以登录号存放在NCBI基因表达总览中GSE83890型。

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关键资源表

试剂或资源来源标识符
抗体
小鼠单克隆抗Cas9（IF染色）试剂盒分类号61577（7A9-3A3）
小鼠单克隆抗Cas9（ChIP）试剂盒类别号61757（8C1-F10）
兔多克隆抗CTCFEMD密理博分类号07729
鸡多克隆抗GFPAves实验室类别号GFP-1020
兔多克隆抗BDNF赛默飞世尔科技公司目录号OSB00017W
鸡多克隆抗MAP2Encor生物技术公司类别号CPCA-MAP2
小鼠单克隆抗MAP2西格玛-奥尔德里奇类别号M2320
小鼠单克隆抗Tuj1生物传奇类别号MMS-435P
兔多克隆抗MyoD（C-20）圣克鲁斯生物技术类别号sc-304
小鼠单克隆抗MHC（MF20）研发系统类别号MAB4470
小鼠单克隆抗MyoG（F5G）赛默飞世尔科技公司类别号MA5-11486
化学制品
2-羟基戊二酸盐TRC多伦多研究化学品公司类别号H942596
ABT-888塞勒克分类号S1004
5-氮杂-2-脱氧胞苷西格玛-奥尔德里奇类别号A3656-5MG
盐酸多西环素西格玛-奥尔德里奇产品目录号D9891-100G
关键商业分析
EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒凯杰分类号59104
TAB-seq试剂盒Wisegene公司类别号K001
DNeasy血液和组织试剂盒凯杰分类号69504
酵母菌凝胶DNA回收试剂盒Zymo研究分类号D4002
DNA清洁和浓缩-5Zymo研究分类号D4013
X-tremeGENE™9 DNA转染试剂西格玛-奥尔德里奇分类号6365809001
Xfect™mESC转染试剂克隆泰克分类号631320
直接zol RNA MiniprepZymo研究类别号R2050
SuperScript III第一股合成SuperMix生活科技分类号18080400
快速SYBR绿色混合料生活科技分类号4385618
木瓜蛋白酶神经组织分离系统型胶原酶猫#LK003150号
存放的数据
RNA测序的原始数据文件NCBI基因表达总览GSE83890型
实验模型： 生物体/菌株
老鼠：C57Bl/6J杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:000664
小鼠：B6；Tet1 KO鼠标Dawlaty等人，2011年不适用
小鼠：B6；Dlk1-Dio3 IG-DMR-Snrpn-GFPStelzer等人，2016年（印刷中）不适用
实验模型：细胞系
V6.5米电子稳定控制系统（C57BL/6 x 129S4/SvJae）Brambrink等人，2006年不适用
Dazl-Srrpn-GFP V6.5 mESC型Stelzer等人，2015年不适用
Gapdh-Srrpn-GFP V6.5 mESC型Stelzer等人，2015年不适用
C3H10T1/2细胞系Constantinides等人，1977年不适用
重组DNA
dCas9太特/Dnmt这篇论文不适用
前基因组这篇论文不适用
参见METHOD DETAILS一节中的“质粒设计和施工”
基于序列的试剂
请参见表S2,第3章,S4系列,S4系列用于引物序列这篇论文不适用
软件和算法
MACS（ChIP-seq算法）Wu等人，2014bhttp://liula.dfci.harvard.edu/MACS/
ImageJ（斐济）国家卫生研究院http://imagej.net/斐济

突出显示

  • dCas9-Tet1和-Dnmt3a能够精确编辑CpG甲基化体外和体内
  • 靶向去甲基化BDNF公司启动子IV激活神经元中的BDNF
  • 靶向增强子去甲基化促进MyoD诱导的肌肉细胞重编程
  • 有针对性的从头开始CTCF基序的甲基化改变CTCF介导的染色质环

简而言之

使用基于CRISPR/Cas9的方法，可以在哺乳动物细胞中特异性地改变DNA甲基化模式。

补充材料

1

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6

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2

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三

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5

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14

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致谢

我们感谢Patti Wisniewski和Colin Zollo对FACS进行分类，感谢Chuan He、Michael Greenberg、Robert Weinberg、Yupeng He、Joseph Ecker、Klaus Kaestner、Zipeng Fan、Chikdu Shivalila、Dongdong Fu、Johanna Goldmann、Carrie Garrett-Engele、Malkiel Cohen、Robert Plasschaert、Frank Soldner和Bluma Lesch提供试剂，技术援助和手稿输入。本研究得到了NIH资助HD045022和HG002668的支持。X.S.L.由Damon Runyon癌症基金会博士后奖学金资助，H.W.由NARSAD青年研究员奖学金资助，X.W.由Helen Hay Whitney基金会博士后奖学金资助。S.C.由波兰国家科学中心的HARMONIA拨款UMO-2014/14/M/NZ1/00010资助，Y.S.由人类前沿科学计划博士后奖学金资助。R.J.是Fate Therapeutics和Fulcrum Therapeunics的联合创始人，也是Stemgent的顾问，R.A.Y是Syros Pharmaceuticals的创始人。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

作者贡献

X.S.L.和R.J.构思了这个项目的想法。X.S.L.和H.W.设计并进行了实验，并对数据进行了解释。X.J.进行了ChIP和3C分析，Y.S.生成了Snarpn-GFP报告基因ES细胞系和IG-DMRGFP/专利报告鼠。S.C.、X.W.和J.S.协助进行测序分析。X.S.L.、H.W.和R.J.在所有其他作者的投入下撰写了这份手稿。

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