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分子细胞。作者手稿；2017年2月18日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2016年2月18日；61(4): 520–534.
2016年2月4日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2016.01.015
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NIHMSID公司：NIHMS808113标准
PMID：26853146

长非编码RNA CCAT2对癌症代谢的等位基因特异性重编程

Roxana S.Redis公司,1 Luz E.贝拉,2 魏勤路,三，4 朱利安娜·费雷拉·德·奥利维拉,5 克里斯蒂娜·伊凡,6 克里斯蒂安·罗德里格斯-阿瓜约,1 道格拉斯·阿达莫斯基,5 芭芭拉·帕斯卡利,1 田口阿久木,三 陈云云,8 阿古斯汀·费尔南德斯,9 路易斯·瓦利多,10 凯特里安·范·罗斯布鲁克,1 塞缪尔·张,1 迈特里·沙阿,1 Garrett Kinnebrew公司,11 冷寒,12 亚瑟·阿特拉西,13,¥ 劳伦斯·H·张,1 黄元杰（Gilbert Yuanjay Huang）,1 帕洛马·莫罗伊格,1 马克·拉米雷斯,14 蒂娜·卡特拉·伊夫科维奇,1,15 长厢式货车,2 慧玲,1 罗伯塔·加法,16 萨尼娅·卡皮坦诺维奇,15 乔瓦尼·兰扎,16 詹姆斯·班克森,14 彭黄,三 斯蒂芬·赖伊,8 罗伯特·巴斯特,1 迈克尔·罗森布鲁姆,1 米兰·拉多维奇,11 米尔恰·伊凡,11 杰弗里·巴塞洛梅乌斯,1 韩亮,17 马里奥·弗拉加,18 威廉·R·威杰,2 萨米尔·哈纳什,7 伊奥娜·贝林丹·尼戈,1,19,20 加布里埃尔·洛佩斯·贝雷斯坦,1 安德烈·伦布洛西奥,5 桑德拉·戈麦斯·迪亚斯,5和乔治·A·卡林1,6,#
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关联数据

补充资料

总结

能量代谢改变是癌症的标志，因为恶性细胞调整其代谢途径以满足其能量需求。葡萄糖和谷氨酰胺是促进细胞新陈代谢的主要营养素，癌症患者利用这些营养素的途径经常发生改变。这里，我们展示了长ncRNACCAT2、，位于癌症风险相关rs6983267 SNP的8q24扩增子上，调节癌症代谢在体外和在体内，通过将裂解因子I（CFIm）复合体与两个亚基（CFIm25和CFIm68）的不同亲和力结合，以等位基因特异的方式。这个CCAT2公司与CFIm复合物的相互作用微调谷氨酰胺酶(GLS公司)通过选择前体mRNA内含子14中的poly（A）位点。这些发现揭示了由长ncRNA等位基因调控的复杂的等位基因特异的癌症代谢调控机制。

图形摘要

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简介

长非编码RNA（lncRNAs）是哺乳动物非编码转录组的最大部分(Mercer等人，2009年)并且通常以发育、组织或疾病阶段特定的方式表达，这使它们成为有吸引力的治疗靶点(Ling等人，2013a). 虽然潜在的分子机制尚未完全了解，但lncRNAs在不同水平上控制基因表达，包括染色质修饰、转录和转录后处理(Wilusz等人，2009年).

沃伯格癌症理论的复兴(沃堡，1924年)与该领域的新发现相辅相成，促进了细胞代谢作为推动恶性转化和进展的基本分子机制(2015年，自治区和德贝拉迪尼斯). 各种研究揭示了蛋白质编码致癌基因和肿瘤抑制基因协调的代谢途径之间的精细相互作用(Chen和Russo，2012年)以及最近的ncRNAs（miRNAs和lncRNAs）(Gao等人，2009年;Yang等人，2014年). 谷氨酰胺是一种必需的营养素，通过谷氨酰胺酶(GLS公司)产生谷氨酸，谷氨酸进一步作为多种代谢途径（例如三羧酸循环–TCA）的底物。MYC通过miR-23a/b调节前列腺癌和b细胞淋巴瘤中的谷氨酰胺代谢(Gao等人，2009年)NF-kB p65亚单位也通过miR-23a下调白血病细胞(Rathore等人，2012年;Wang等人，2010年b).

C类结肠C类癌症A类有关联的T型手稿2（CCAT2）)，一种lncRNA，跨越高度保守的8q24区域，包含rs6983267 SNP(Ling等人，2013b;Redis等人，2013年)与各种类型癌症的风险增加有关(Tomlinson等人，2007年;Tuupanen等人，2009年)并且在微卫星稳定的结直肠癌（CRC-MSS）中特异性过表达。在普通人群中存在的rs6983267单核苷酸多态性的两个等位基因已被证明具有明显的CRC风险，即G等位基因比T等位基因与更大的CRC易感性相关(Tomlinson等人，2007年).CCAT2公司诱发染色体不稳定和转移(Ling等人，2013b)并调节MYC癌基因的表达水平，已知其可以协调支持细胞增殖、转移和癌症代谢的多个分子途径(Carroll等人，2015年;Stine等人，2015年). 然而，尚不清楚这两个等位基因是如何具体参与恶性过程的。在这项研究中，我们证明lncRNA，CCAT2公司，通过与裂解因子I（CFIm）复合体相互作用以等位基因特异的方式调节细胞能量代谢，以调节GLS公司.

结果

CCAT2在体内外以等位基因特异的方式调节能量代谢

我们观察到在体外当调节CCAT2公司这表明能量代谢可能发生变化CCAT2公司表达式。我们通过测量稳定过度表达的HCT116结肠癌细胞的代谢参数来验证这一假设CCAT2公司（OC1和OC3）(Ling等人，2013b)与对照细胞相比，观察到CCAT2公司-过表达克隆(图1A). 这些结果在具有CCAT2公司下调表达(图1B). 此外，我们还探讨了这些代谢变化是否正在发生体内也可以通过注射HCT116CCAT2公司-将过表达细胞和对照细胞皮下注射到裸鼠体内，并对其进行超极化磁共振成像（HP-MRI）。我们检测到来源于异种移植瘤的超极化[1-13C]丙酮酸到[1-13C]-乳酸的流量显著增加CCAT2公司-与来源于对照细胞的肿瘤相比，过表达细胞(图S1A和S1B)，与我们的在体外调查结果。这些发现证实了CCAT2公司改变新陈代谢，促进糖酵解和细胞呼吸。在高度增殖的细胞中，糖酵解增加与呼吸增加共存，转化为增强的回补反应，补充TCA循环中间产物(沃德和汤普森，2012年). 由于谷氨酰胺是补充TCA循环中间体的主要来源，我们用CCAT公司2-过表达和对照细胞。我们发现较高水平的细胞内外谷氨酸与较高水平的CCAT2公司(图S1C和S1D)，建议CCAT2公司促进谷氨酰胺代谢（谷氨酰胺水解）。令人惊讶的是，三个克隆的谷氨酰胺摄取量没有显著差异(图S1D)这意味着谷氨酸水平升高并不是由于谷氨酰胺消耗增加。因此，我们测量了相同细胞的整个裂解液中GLS的酶活性，GLS是谷氨酰胺水解的限速酶，并检测到细胞中的酶活性显著升高CCAT2公司表达式(图S1F). 此外，两种代谢途径（糖酵解和谷氨酰胺解）都被许多因素调节，包括MYC癌基因(Carroll等人，2015年;Stine等人，2015年)，的目标CCAT2公司根据我们之前的报告(Ling等人，2013b).

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CCAT2公司调节癌症代谢在体外和体内

(A类)HCT116稳定克隆（E–空白对照载体，OC1和OC3–CCAT2公司-过度表达–GG基因型）。(B)KM12SM细胞葡萄糖摄取、乳酸生成和耗氧量测定CCAT2公司下调（GT-基因型）。(C类)全细胞裂解物谷氨酰胺酶HCT116中测得的放射性CCAT2公司-G或T等位基因和对照细胞过度表达。(天)HCT116细胞稳定过度表达的偏最小二乘判别分析CCAT2公司带有G-或T-等位基因和对照细胞（E-空载体）在体外允许根据其代谢组对不同的细胞系进行适当的分类*。(E类)来自相同细胞系的异种移植瘤也通过sPLS-DA分析正确分类。结果以标准化平均值±SD表示。另请参见图S1和表S1.

*sPLS-DA算法允许根据每种代谢物的不同丰度对样本进行分类，试图找到治疗和代谢组之间的最大协方差，从而找到最重要的代谢物来解释治疗的不同效果。

接下来，我们探讨了rs6983267单核苷酸多态性是否影响这些代谢变化，并评估了HCT116中稳定过度表达G等位基因或T等位基因的葡萄糖和谷氨酰胺摄取、耗氧量、乳酸分泌以及细胞内外谷氨酸浓度CCAT2公司并控制HCT116细胞。有趣的是，我们发现，一方面，与对照细胞相比，G和T等位基因细胞的葡萄糖摄取和谷氨酸分泌都更高，而另一方面，我们观察到等位基因之间在乳酸分泌、耗氧量和细胞内谷氨酸产生方面的显着差异(图1C和第1版E). 此外，克隆之间的谷氨酰胺消耗量没有显著差异，与我们之前的结果类似(图S1E). 因此，我们测量了这些细胞中的GLS酶活性，并观察到CCAT2公司与对照组相比，等位基因诱导活性显著增加，但与T等位基因过度表达细胞相比，过度表达G等位基因的细胞显示出更高的酶活性(图1D). 我们还通过质谱分析了从在体外HCT116的培养CCAT2公司G-或T-等位基因和对照细胞体内皮下注射相同细胞产生的异种移植瘤。我们在执行时观察到了对比的分布模式P（P）艺术的我东S公司夸克天歧视的A类分析（PLS-DA）在体外(图1E)和体内分析(图1F)和主成分分析（PCA）分析类似(图S1G和S1H). 我们检测到85.04%(在体外)和59.55%(体内)代谢途径的上调CCAT2公司G等位基因与T等位基因的比较(图S1I,表S1B). 然后，我们比较了这两个数据集的通路分析，确定了40条G等位基因的常见通路和5条T等位基因常见通路(图S1J). 对于这些途径，差异累积化合物的代谢簇分布显示，与T等位基因细胞相比，G等位基因的葡萄糖代谢、TCA循环和谷氨酰胺代谢相关的代谢途径总体上显著增强(表S1A和S1B). 我们评估了HCT116之间MYC的表达CCAT2公司G和T等位基因细胞，但没有发现显著差异，这与我们之前的发现一致(Ling等人，2013b) (图S2A). 这些结果表明CCAT2公司表达，MYC以一般方式激活能量代谢，然而不同代谢途径的微调可能通过MYC非依赖性但SNP依赖性机制发生。因此，我们决定努力探索CCAT2公司MYC独立调节机制。

CCAT2调节GLS亚型的表达

我们的团队之前已经表明CCAT2公司诱发染色体不稳定，这一过程高度依赖核苷酸的供应(Bester等人，2011年)与谷氨酰胺代谢密切相关(Jeong等人，2013年). 在代谢数据的进一步支持下，我们将重点放在谷氨酰胺代谢途径上。我们首先评估了GLS公司KGA（谷氨酰胺酶肾亚型）和GAC（谷氨酰胺酶亚型C）作为CCAT2。我们对每个亚型使用特定抗体（识别不同的C末端）(Cassago等人，2012年)和/或一种普通抗体，根据细胞系识别两种亚型共享的N末端。尽管这两种异构体共享相同的活性位点，但GAC比KGA具有更高的催化活性，因此可能更适合补充TCA循环的中间体(Cassago等人，2012年;Le等人，2012年). 而对于GAC，我们观察到HCT116中的蛋白质表达增加CCAT2公司-用两种抗体过度表达细胞，KGA的蛋白表达与CCAT2公司上调(图2A,S2B和S2C). 类似地，GAC和KGA的mRNA表达模式反映了蛋白质表达(图2B). 此外，下调CCAT2公司在KM12SM细胞中，GAC蛋白表达分别减少34%和26%(图2C,S2D和S2E)而KGA蛋白表达没有改变或略有增加(图2C). 在同一细胞模型中测量两种亚型的mRNA表达时，也得到了类似的结果(图S2F). 有趣的是，当我们评估HCT116细胞过度表达的两种亚型的表达时CCAT2公司G或T等位基因和对照细胞在mRNA和蛋白质水平上，我们一致发现当CCAT2公司G等位基因上调(图2D,S2G、S2H和S2I). 然而KGA公司mRNA表达模式与蛋白质表达不一致(图2D,S2G、S2H和S2I). 观察到的KGA亚型的不一致可能是由于MYC-miR-23轴的调节(Gao等人，2009年-如作者要求，可提供其他数据）。这些结果暗示了CCAT2公司可能优先诱导GAC亚型的剪接。为了确定这一点，我们克隆了GLS公司RG6双色荧光报告基因中已知包含选择性剪接位点的前体mRNA(Orengo等人，2006年). 如果剪接机制与内含子14结合，它会诱导GFP标记的蛋白质剪接，这相当于GAC，否则会产生dsRED标记的蛋白质，这相当于是KGA(图S2J). 我们转染了HCT116对照CCAT2公司-用荧光报告物过度表达细胞，并使用VECTRA自动成像系统测定EGFP和dsRED荧光表达水平之间的比率。虽然EGFP标记蛋白（GAC-当量）在所有模型中占主导地位，但我们观察到在CCAT2公司-过度表达细胞，对应50%以上的选择性剪接事件(图2E). 流式细胞术分析细胞时也得到了类似的结果(表S2). 此外，当我们使用RG6报告子比较G和T等位基因中发生的选择性剪接事件时，我们发现EGFP/dsRED比率显著高于CCAT2公司G-等位基因与CCAT2公司T等位基因(图2F,表S2). 总之，这些数据表明CCAT2公司G等位基因更有效地促进GAC亚型的选择性剪接。

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CCAT2公司诱导GAC的优先拼接

(A类)HCT116中GAC、KGA的Western Blot分析CCAT2公司-过表达（OC1和OC3）和对照细胞。(B)RT-qPCR检测HCT116中GAC和KGA的mRNA表达CCAT2公司-过表达细胞（OC1和OC3）和对照细胞。(C类)用Western Blot分析KM12SM细胞中的GAC和KGACCAT2公司下调监管。(天)HCT116中稳定过度表达的GAC、KGA的Western Blot分析CCAT2公司G或T等位基因和对照细胞。(E类)HCT116稳定克隆的荧光显微镜图像（E–空白对照载体，OC1和OC3–CCAT2公司-过度表达）转染RG6内含子14载体并分析EGFP/dsRED比率。(F类)HCT116的荧光显微镜图像CCAT2公司G等位基因和T等位基因转染RG6内含子14载体并分析EGFP/dsRED比率。结果以标准化平均值±SD表示。另请参见图S2和表2。

CFIm25控制GLS剪接亚型之间的转换

阐明CCAT2诱导法规GLS公司交替拼接,我们将MS2标签（24个重复）引入包含CCAT2公司G等位基因或T等位基因，拉下结合蛋白CCAT2公司并通过质谱法对其进行分析(Yoon等人，2012年). Qiagen平台上的通路分析确定了与G等位基因相关的顶级通路中的“Pre-mRNA的裂解和多聚腺苷酸化”(图S3A)，使用CFIm25，CFIm的小（25kDa）亚单位由NUDT21号机组基因(Elkon等人，2013年;Yang等人，2011年)作为与该途径相关的主要蛋白质。值得注意的是，在T等位基因下拉中，CFIm25和CFIm复合体的较大亚单位（68 kDa）CFIm68（由CPSF6系列基因）被检测到（在G-等位基因下拉列表中未检测到CFIm68），但是对于CFIm25，G等位基因峰值下的面积比T等位基因高1.48倍(图S3B). 我们筛选了GLS公司内含子14，用于使用ASTRA（alternative splicing and TRanscription Archives database at网址：http://alterna.cbrc.jp/) (长崎等人，2006年)并确定了一个2型（跳过外显子）poly（a）位点(图S3C) (Lutz和Moreira，2008年)以及CFIm25的多个保守结合基序（UGUA），与之前的一份报告一致，该报告映射了CFIm25同一内含子内的两个poly（a）基序GLS公司前mRNA(Tian等人，2007年). 考虑到CFIm25和CFIm异四聚体复合物以前与选择性剪接有关(Millevoi等人，2006年;Zhou等人，2002年)，我们首先下调监管NUDT21号机组并评估GAC和KGA的蛋白质水平。我们注意到两种细胞模型中GAC蛋白表达均显著降低，KGA蛋白表达明显增加(图3A). 我们还测量了这两种亚型的mRNA表达，并观察到GAC/KGA公司mRNA比率NUDT21号机组击倒(图3B). 为了评估亚型表达中的转换是否是CFIm25与第14内含子内的UGUA序列结合的结果GLS公司我们设计了反义寡核苷酸（ASO）来阻断25kDa亚基与这些基序的结合(图3C). 在四个测试的ASO中，我们可以确定两个能够逆转GAC-KGA蛋白表达比率，类似于NUDT21号机组HCT116 OC1细胞中(图3C). 这一结果表明，CFIm25与内含子14的结合是诱导GAC优先表达的原因。为了进一步确认CFIm25与GLS公司前mRNA和CCAT2公司在HCT116细胞中，我们免疫沉淀了与CFIm复合物的组成蛋白CFIm25和CFIm68结合的RNA，这些细胞过度表达了CCAT2公司并通过实时定量PCR（RT-qPCR）测量不同下拉裂解物之间的RNA富集差异(图3D、3E和3F,S3D、S3E和S3F). 我们将两种lncRNA作为对照：NEAT1公司被选为阳性对照，因为之前已经证明它与CFIm复合物相互作用(Naganuma等人，2012年)，以及气体安全标准5由于与CCAT2公司(图S3G). 在评估褶皱富集度时GLS公司和CCAT2公司在过度表达的细胞中，我们分别检测到与CFIm25结合的RNA增加5.77倍和13.6倍CCAT2公司与对照细胞相比，G等位基因在细胞中过度表达CCAT2公司与对照细胞相比，T等位基因的倍增率仅为约一半（分别为2.95和6.02）(图3D). 此外，将G过表达细胞和T过表达细胞的富集倍数进行比较，我们观察到这两种细胞在G过表达细胞中的富集倍数大致为两倍GLS公司和CCAT2公司（1.95和2.26）(图3E和3F). 阳性对照(NEAT1公司)在过度表达的细胞中，与CFIm25结合的RNA增加6.3倍CCAT2公司与对照细胞相比，G等位基因和过度表达细胞中的RNA富集增加2.79倍CCAT2公司与对照细胞相比的T等位基因(图3D和S3D系列). 阴性对照(气体安全标准5)在过度表达的细胞中，与CFIm25结合的RNA仅增加1.79倍CCAT2公司与对照细胞相比，G-等位基因的过度表达与RNA富集无差异CCAT2公司T等位基因和对照细胞(图3D和S3E系列). 因此，我们得出结论，总的来说，在细胞中过度表达CCAT2公司，CFIm25和GLS公司和CCAT2公司在G-过表达细胞中含量最高。RNA与CFIm68的低结合并不奇怪，因为蛋白质的主要功能只是增强RNA结合并促进RNA循环，而25kDa亚单位在通过UGUA元件结合RNA方面起主导作用(Yang Q等人，2011年) (图3E和3F,S3D和S3E). 尽管如此，对于我们感兴趣的RNA，我们观察到与G等位基因过表达和对照细胞相比，T等位基因过表达细胞的富集增加，这表明CCAT2公司T等位基因可以缓解68kDa亚单位和RNA分子之间的相互作用。此外，我们在同一细胞模型和具有GT杂合子基因型的KM12SM细胞系中通过终点PCR证实了这些结果(图S4A和S4B). 作为进一步的验证，我们在KM12SM细胞中表达了带有内含子14的RG6双色荧光报告子，敲除了NUDT21。我们通过VECTRA和FACS评估了EGFP与dsRED的比率，发现在具有NUDT21号机组下调，对应较少的剪接事件，从而降低GAC当量的表达(图3G和表S2).

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CFIm蛋白复合物结合GLS公司前mRNA

(A类)用NUDT21、GLS（靶向两种异构体共享的编码序列）和siRNA对照的siRNA瞬时转染的HCT116 OC1和KM12SM细胞中CFIm25、GAC和KGA的蛋白质印迹分析。(B)RT-qPCR评估HCT116中GAC/KGA mRNA比率CCAT2公司-过表达细胞（OC1和OC3）和调控CFIm25表达的对照细胞（E）(C类)反义寡核苷酸短暂阻断CFIm25结合基序（UGUA）的HCT116 OC1细胞中GAC和KGA的Western Blot分析。机构示意图如下所示。(天)RT-qPCR评估GLS、CCAT2、NEAT1和气体安全标准5RNA与CFIm25蛋白结合（RNA免疫沉淀）。数据以对照HCT116细胞（E）和CCAT2公司-G或T等位基因过度表达。RT-qPCR评估GLS公司信使核糖核酸(E类)和CCAT2公司(F类)在HCT116细胞中与CFIm25和CFIm68结合CCAT2公司-过度表达G-或T-等位基因和对照细胞（E）。(G公司)转染siNUDT21和scr的KM12SM细胞的荧光显微镜图像，然后转染RG6内含子14载体，并分析EGFP/dsRED比率。结果以标准化平均值±SD表示。另请参见图S3和表2。

GLS的选择性剪接与CCAT2和CFIm复合体之间的相互作用有关

我们接下来的目的是更详细地研究导致CFIm25和CFIm68与CCAT2公司等位基因。我们首先扫描了CCAT2公司RNA序列并鉴定了围绕rs6983267的两个CFIm25结合基序，一个位于SNP上游，另一个位于其下游。我们使用RNAfold Webserver进行二级结构预测(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNfold.cgi)并注意到在假定的上游CFIm25结合序列附近，由单核苷酸变异引起的主要局部结构变化，特别是在G-和T-等位基因之间(图S4C). 这种变化可能会转化为不同的第三褶皱，这可能在原则上解释了G和T等位基因与不同亲和力的结合。为了进一步验证我们的结果并评估单核苷酸对结构变化和结合亲和力的贡献，我们将SNP突变为a或C（在人类中从未检测到的核苷酸），并删除了包含SNP的7个核苷酸区域，据报道该区域具有增强子活性(Tuupanen等人，2009年). 我们使用含有MS2标签的不同载体重复了RNA下拉分析(CCAT2公司-G、T、A、C和DEL），并通过western blot分析与RNA结合的蛋白质。当CFIm25抗体杂交到印迹上时，我们检测到G等位基因特有的约64kDa的强带（带对应于CFIm25二聚体-图4A). 当CFIm68抗体在印迹上杂交时，我们区分了T等位基因和带有缺失区域的等位基因约68kDa的条带(图4A). 这意味着T等位基因优先结合68kDa亚基，但不在SNP区域。值得注意的是，这两个基因都没有突变CCAT2公司等位基因（A和C）与CFIm复合体相互作用，有趣的是，两者都呈现不同于G-和T-等位基因的二级结构(图S4C).

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rs6983267 SNP支持CCAT2公司含CFIm蛋白复合物

(A类)MS2蛋白的Western Blot分析-CCAT2公司载体（G、T、A、C和DEL），其显示G等位基因的CFIm25和T等位基因的CFIm68的存在。(B)Northern Blot分析显示存在CCAT2公司和内含子14（600bp片段）在用TALON树脂拉下的裂解液中（上面板）。Western Blot分析显示His的存在6-用TALON树脂拉下的裂解液中标记的CFIm复合物（下面板）。(C类)Northern Blot分析显示存在CCAT2公司和内含子14（600bp片段）在裂解物中用链霉亲和素珠拉下。标有星形符号的车道1与中的车道3相同图S4D.的交互示意图CCAT2公司具有GLS公司前mRNA（表达不按比例）(天)Northern Blot分析显示存在CCAT2公司和内含子14（600bp片段）在裂解物中用链霉亲和素珠（上面板）拉下。Western Blot分析显示存在CFIm25、单体（26kDa）和二聚体（64kDa6-标记为CFIm68（38 kDa）（下面板）。(E类,F类)CCAT2:CFIm:内含子14第四纪复合体的AFM图像，包括CCAT2公司T等位基因(E类)或CCAT2公司G等位基因(F类). 另请参见图S4、S5和表3。

关于CCAT2公司具有CFIm复合体的G-和T-等位基因由His提供6-利用异源表达的CFIm68:CFIm25复合物（His6-标记的CFIm68亚单位，图4B)与…一起孵化在体外合成RNA。我们检测到CFIm复合物对CCAT2公司G等位基因，其次是CCAT2公司T等位基因。我们在下拉中还确定了600个核苷酸长的区域GLS公司前mRNA内含子14，包含一个2型poly（A）位点，与两个等位基因对应的蛋白复合体具有亲和力(图4B). 这表明内含子14也可能与CCAT2公司为了测试这一点，我们在在体外转录的CCAT2公司RNAs，将其与内含子14片段和/或CFIm复合体结合，并用链霉亲和素珠拉下复合体。我们不仅确认了这一点CCAT2公司G等位基因优先结合CFIm25，但也CCAT2公司以SNP独立方式与内含子14片段相互作用(图4C和S4D系列). 为了确保相互作用的特异性，我们重复了生物素RNA下拉测定，以包括生物素化的CCAT2公司C等位基因作为阴性对照。我们还添加了之前用于RG6剪接分析的整个内含子14，以确定CCAT2公司可以与整个区域进行交互。我们准备了CCAT2公司（G，T和C）和含有或不含内含子14片段的CFIm复合体，以评估其如何影响CCAT2公司和CFIm综合体。我们发现，在内含子14的存在下，CCAT2公司与C等位基因相比，G和T等位基因与CFIm复合体的结合亲和力增加(图4D,S4E系列和表S3). 在内含子14（较小片段和整个内含子）存在时，G和T等位基因对CFIm25二聚体具有显著的特异性，与G等位基因的结合增强(图S4E和表S3)，支持以下假设：CCAT2公司影响与蛋白质复合物的相互作用。在没有内含子的情况下，虽然与CFIm25二聚体相互作用的特异性部分保留，但在CFIm复合物的情况下似乎被撤销(图4D,S4E系列和表S3). 我们确认了CCAT2公司G和T等位基因也可以结合整个内含子14，并将CCAT2公司基因组序列GLS公司确定相互作用程度的基因组序列(图S4F). 我们观察到多个短片段（13到18 nt）的序列互补性跨越整个GLS公司序列，存在于内含子和外显子中(图S5A). 为了进一步验证，我们执行了6-在存在或不存在整个内含子14的情况下，使用G-、T-和C-等位基因进行标签下拉分析。正如预期的那样，当内含子包含在混音中时，我们只能检测到CCAT2公司下拉裂解物中的G-和T-等位基因(图S4G).

此外CCAT2公司制备RNA（G/T）、CFIm蛋白复合物和内含子14 RNA，以及单个组分的溶液，并进行原子力显微镜（AFM）观察RNA:protein:RNA四元复合物的形成(Lyubchenko等人，2011年) (图4E和4F). 扫描云母表面时检测到相当大的颗粒，表明形成了潜在的CCAT2:CFIm:内含子14复合物，与T等位基因相比，G等位基因的频率更高(图4E和4F)，而单个成分（CFIm蛋白质复合物，CCAT2公司RNA和内含子14 RNA）明显较小(图S5B、S5C和S5D). 此外，当测量复合物的直径（G-等位基因复合物-226.706 nm；T-等位蛋白复合物-182.844 nm）时，我们发现它大致对应于单个组分的直径之和(CCAT2公司–81.865纳米；CFIm–67.999纳米；内含子14–48.360 nm）。

总的来说，这些发现表明：1）GLS公司前mRNA影响CCAT2公司具有CFIm复合体；2)CCAT2公司可能充当支架或组装平台，促进对第14内含子中poly（a）位点的选择GLS公司前mRNA通过直接结合前mRNA和CFIm复合物形成，3）RNA:RNA:蛋白质复合物的形成依赖于rs6983267单核苷酸多态性和二级结构CCAT2公司.

作为额外的调节层，我们发现MYC是NUDT21号机组（作者可根据要求提供数据）。

GAC促进转移和细胞增殖

我们开始评估GAC对CRC攻击性的贡献。考虑到我们之前已经证明CCAT2公司促进转移(Ling等人，2013b)，我们首先评估了在体外HCT116的迁移潜力CCAT2公司-用GLS变构抑制剂968或siRNA处理过表达细胞(Katt等人，2012年). 我们观察到GLS被抑制或下调的细胞迁移减少一半(图5A). 接下来，我们评估了在亚型稳定下调的KM12SM细胞中GAC对迁移的个体贡献(图S6A)发现当GAC表达减少时，迁移的细胞减少60%(图5B). 然后，我们将KM12SM稳定克隆注射到裸鼠的尾静脉中，在注射后8周处死小鼠，并评估肺内宏观和微观转移。支持我们在体外结果，与shGAC组相比，注射对照细胞（shGFP）的小鼠肺转移的发生率高50%(图5C). 此外，当我们评估HCT116的增殖控制和CCAT2公司-用GLS抑制剂968处理过表达的细胞，我们发现细胞过表达CCAT2公司对GLS（本例中为GAC）抑制更敏感，这意味着CCAT2公司表达依赖于GAC生存(图5D) (Katt等人，2012年;Wang等人，2010a). 与对照细胞相比，使用GAC下调的KM12SM细胞获得了类似的结果在体外(图5E). 对更高依赖性的进一步确认CCAT2公司GAC上的G-等位基因由转染NIH3T3细胞的集落形成试验提供CCAT2公司-过度表达载体(图S6B和S6C).

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GLS推广体内转移和在体外细胞增殖和迁移

(A类)抑制剂968和DMSO处理的HCT116 OC1细胞（GG基因型）的迁移(左侧面板)以及siGLS和干扰siRNA(右侧面板). (B)KM12SM细胞（GT基因型）迁移，GAC稳定下调。KM12SM shGFP细胞代表对照细胞。(C类)IHC评估两组（shGFP-4小鼠和shGAC-4小鼠）的肺微转移数量(左侧面板). IHC图像显示三组小鼠的微转移，图像显示尾静脉注射KM12SM shGFP和shGAC细胞的小鼠是否存在肺转移(右侧面板). (D、 电子)用DMSO（对照）或GLS变构抑制剂968（10μM）处理的HCT116 OC1和对照细胞（GG基因型）的生长曲线(天)GAC稳定下调的KM12SM细胞（GT基因型）(E类). 接种HCT116后24小时培养基中相对于空井的谷氨酰胺和谷氨酸浓度CCAT2公司-用siRNA转染过表达细胞（OC1–GG基因型）NUDT21号机组和打乱了(F类)和ASO抑制CFIm25的结合位点(G公司). 结果以标准化平均值±SD表示。另请参见图S6和表4。

接下来，我们试图确定GLS亚型表达和CFIm25的改变是否与过度表达细胞中观察到的显著代谢变化有关CCAT2公司因此，我们使用ASO调节亚型的表达并下调NUDT21号机组HCT116中CCAT2公司-过表达细胞系（OC1），并测定细胞外乳酸浓度和谷氨酰胺代谢。我们观察到NUDT21号机组显著降低乳酸和谷氨酸分泌，以及谷氨酰胺消耗，其效果与CCAT2公司同一细胞系中的过度表达(图S6D和​和5F）。5楼). 然而，这些代谢变化似乎只是部分反映了CCAT2公司过度表达，表明存在独立于NUDT21号机组很可能通过bona-fide癌症代谢调节剂和CCAT2公司目标，MYC。另一方面，GLS亚型的转换反映在谷氨酸分泌减少，谷氨酰胺消耗保持相对恒定，但对细胞外乳酸水平的影响不大(图5G和S6E系列). 这些发现表明，GLS并不是导致CCAT2公司诱导代谢谱。我们假设其他代谢目标可能受CCAT2公司通过相同的机制，我们使用Affymetrix HTA 2.0阵列来比较HCT116中的整个转录组剪接模式CCAT2公司-过表达G-和T-等位基因的细胞。通路分析显示，与两条主要代谢途径“碳水化合物代谢”和“果糖和甘露糖代谢”相关的几个基因在CCAT2公司G和T等位基因(表S4). 此外，通过验证我们之前的结果，我们确定GLS公司连接第14外显子和第15外显子的排除连接的负剪接指数（SI=−1.19），表明T等位基因表达细胞中的排除连接信号较高。这意味着与G等位基因细胞相比，T等位基因中的GAC剪接更少，支持我们的研究结果(图S6F).

总的来说，这些数据表明GAC增加了CRC表型；然而，它并不是过度表达细胞中观察到的代谢表型的唯一原因CCAT2公司.

CRC肿瘤中的CCAT2–CFIm–GLS调节轴

我们继续评估CCAT2、GLS,NUDT21号机组和CPSF6系列通过分析可公开获得的结肠癌TCGA数据库(网址：http://cancergenes.nih.gov/). 我们首先将18个正常样本与193个肿瘤样本进行了比较，确定了通用汽车公司异构体，以及NUDT21号机组和CPSF6系列在肿瘤组织中，而KGA公司显示出相反的模式(图6A、6B、6C和6D). 我们进一步分析了CCAT2公司,NUDT21、CPSF6、GAC和KGA公司在结肠癌样本的TCGA数据集中(2012)并检测到CCAT2、CPSF6、NUDT21具有通用汽车公司(第页秒= 0.26,P=0.0006；第页秒=0.68，P<0.0001和第页秒= 0.72,P<0.0001，分别是，图S7A)和之间的反向相关性CCAT2、CPSF6、NUDT21和KGA公司(第页秒= −0.17,P=0.0271；第页秒= −0.47,P<0.0001和r秒= −0.60,P<0.0001， 图S7A)，以及KGA公司和通用汽车公司(第页秒= −0.590,P（P）<0.0001) (图S7A). 我们还获得了以下重要的直接关联CCAT2公司具有CPSF6系列和NUDT21号机组(第页秒= 0.20,P=0.0082和第页秒= 0.26,P=0.0007， 图S7A). 我们没有发现MYC公司和NUDT21号机组,通用汽车公司或KGA公司.自从我们在体外研究结果提出了以下概念：CCAT2公司G等位基因促进GAC的表达，我们比较了通用汽车公司和KGA公司GG、GT和TT基因型患者之间。我们观察到基因型与通用汽车公司在GG基因型患者中表达最高，但在KGA公司(图6E和S7B系列). 同样，我们没有发现任何与NUDT21号机组或MYC公司基因型(图S7C和S7D). 这些结果表明揭示了分子机制在体外在CRC患者中存在。此外，我们从TCGA数据集中分析了这两种亚型的表达与患者总体生存率之间的相关性，并观察到高水平的相关性通用汽车公司表达与低KGA公司总生存期较短的表达(图S7E). 这表明通用汽车公司亚型可能加速癌症的进展。此外，我们查询了TCGA结肠癌数据集中与lncRNA显著相关的基因，并进行了基因集富集分析（GSEA）和遗传路径分析（IPA-Qiagen），以确定CCAT2公司基因签名。发现各种代谢相关途径与CCAT2公司两种分析的表达式(图7A和7B). 我们进一步询问发现的基因是否与CCAT2公司表达也与rs6983267 SNP基因型相关。我们重复GSEA分析并筛选与任一基因型（FDR q-val<0.25和NominalP（P）-val<0.05）。我们确定了与某些基因型相关的各种代谢和RNA处理途径(图7C). 有趣的是，其中几个途径与Affymetrix HTA 2.0阵列确定的途径有关（图中以绿色突出显示图7C)，表明CCAT2公司可能通过代谢基因网络调节CRC患者的细胞代谢，代谢基因网络很可能通过相同的选择性剪接机制调节（参见表S4).

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CCAT2公司,NUDT21号机组（CFIm25），CPSF6系列（CFIm68）和GLS公司TCGA数据集和CRC患者样本中的（GAC和KGA）表达模式

(A、 B、C类和天)分析NUDT21、CPSF6、GAC和KGA公司TCGA RNA-Seq结肠癌样本组中的mRNA表达。(E类). GAC mRNA表达与CRC患者rs6983267 SNP基因型（GG、GT和TT）的相关性（TCGA RNA-Seq数据集）。(F类)配对CRC样本中CFIm25、GAC和KGA表达的Western Blot分析(患者队列#1）. (G公司)RT-qPCR分析CCAT2公司在相同的成对CRC样本中(患者队列#1）。结果以标准化平均值±SD表示。另请参见图S7.

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CCAT2公司结肠癌患者的基因特征（TCGA数据集）

与CCAT2公司通过基因集富集分析（GSEA）进行分析(A类)和创新路径分析（IPA-Qiagen）(B). 各分析的相关示例在面板中给出(A类)和(B). (C类)表中包含与CCAT2公司表达和rs6983267基因型（FDR q-val<0.25和Nom p-val<0.05）。正相关路径用红色标记，负相关路径用蓝色标记。绿色突出显示了GSEA分析和Affymetrix HTA 2.0路径分析之间发现的常见路径。另请参见图S7和表S4.

为了评估CFIm68、CFIm25、GAC和KGA的蛋白表达，我们对配对的正常粘膜和CRC样本进行了Western blot分析(患者队列#1)与正常粘膜相比，61.5%（8/13）的肿瘤组织中CFIm25和GAC的蛋白水平相同(图6F). 至于KGA亚型，肿瘤样本中的蛋白质水平大多较低，或与正常样本中的水平相当(图6F). CFIm复合体的68kDa亚单位在大约一半的成对样本（7/13）中非常低或没有表达，而在其余成对样本中，它在肿瘤中明显过度表达(图S7F). 我们还测量了CCAT2公司通过RT-qPCR在同一组样本中的表达，证实了CCAT2、，69.2%样品的CFIm25和GAC(图6F、6G,S7G和S7H). 此外CCAT2公司显示高GAC/KGA比率（GAC/KGA=2–5.7）(图S7I). 我们在第二组配对正常粘膜和CRC样本中重复了测量结果(患者队列#2)并获得了类似的结果(图S7J和S7K). CFIm25和GAC蛋白在60%（3/5）的肿瘤样品中均过表达。在所有样本中，CFIm25和GAC蛋白水平的升高与CCAT2。此外，我们对来自患者队列#1发现GG基因型与较高GAC和CFIm25蛋白表达（样本标记为红色）的相关性在75%的患者（3/4）中是一致的，而GT基因型仅在62.5%的患者（5/8）中存在相关性(图6G). 由于TT基因型在该队列中的代表性有限（一名患者），因此不能得出结论。总之，这种机制GLS公司大多数分析的CRC病例（61%，11/18）中检测到调节。

讨论

我们的研究表明，rs6983267单核苷酸多态性（G/T）诱导lncRNA二级结构的改变，CCAT2、，启动多米诺效应机制，导致细胞能量代谢的等位基因特异性重编程。等位基因特异性相互作用的结果CCAT2、，CFIm和GLS公司前mRNA似乎是poly（A）位点在GLS公司导致优先剪接到GAC亚型，两种GLS亚型的催化活性更强(Cassago等人，2012年). 尽管最近的一项研究描述了CFIm25通过3′UTR处理机制对胶质母细胞瘤中GLS的负调控(Masamha等人，2014年)，表明CFIm25具有抑瘤作用，在我们的模型中，GLS亚型均未发生3′UTR缩短（数据未显示）。根据这些调查结果，并考虑到CCAT2公司在胶质母细胞瘤中不表达（数据未显示），我们的研究结果揭示了lncRNA作用机制的一个有趣方面，即lncRNA改变伴侣RNA结合蛋白/复合物功能的能力。我们观察到HCT116细胞过度表达肿瘤中与TCA循环相关的代谢物的富集CCAT2公司Kaldma及其同事的研究结果支持G-等位基因，说明CRC肿瘤并非单纯糖酵解，而是依赖OXPHOS产生ATP(Kaldma等人，2014年).

异常表达GLS公司据报道，包括CRC在内的许多类型的癌症(Huang等人，2014年)此外，各种研究已将GAC描述为肺腺癌、头颈部鳞癌、肾肾透明细胞癌和AML中更丰富的亚型(Jacque等人，2015年;van den Heuvel等人，2012年;Xia等人，2014). 谷氨酰胺代谢也与基因组不稳定性有关(Jeong等人，2013年)通常在CRC中遇到，以前显示由CCAT2公司(Ling等人，2013b)并且似乎得到了G风险等位基因的支持。然而，必须说明CCAT2公司是通过MYC以一般方式调节能量代谢，并通过GLS和其他代谢酶和/或代谢物以等位基因特异的方式调节能量新陈代谢，其表达受到CCAT2公司与CFIm合作。尽管G-和T-等位基因之间的调节差异可能并不显著，但多种酶/代谢物表达的变化可能会对明确的表型变化产生加性效应。这份手稿中提出的复杂机制包括lncRNA、蛋白质复合物、致癌基因和转录因子，为靶向治疗打开了几个窗口。代谢酶GLS公司已经被认为是癌症的治疗靶点(Vander Heiden，2011年); 然而，我们的工作带来了特别针对癌症特异性GAC亚型的机会。

我们还揭示了非编码RNA的等位基因、蛋白质复合物的成分和代谢酶剪接亚型之间相互作用网络的复杂性和精细化，这些都有助于CRC的恶性转化和进展。

实验程序

实验程序的全部细节见补充实验程序部分.

葡萄糖摄取测定

在进行分析前16小时，将细胞置于96孔板（25000个细胞/孔）中。取出培养基，用PBS洗涤细胞两次。向含有空白的微孔中添加50μl PBS，而对于含有样品的微孔，添加50μl 2-NBDG（100μM）（Sigma），并在37°C和5%CO下培养10分钟2培养后，用冰镇PBS清洗细胞两次以停止反应，并向每个孔中添加200 ul PBS。使用PHERAstar在485/520 nm处进行荧光测量可行性研究（BMG Labtech）。

乳酸产量测定

为了测量乳酸生成，用新鲜培养基补充80%融合的细胞。使用Accutrend乳酸分析仪（Roche）在指定的时间点（24或48小时）取出等分培养基以测量乳酸。在每个时间点，还计算细胞数以使乳酸生成正常化。

细胞内谷氨酸测定

使用谷氨酸比色测定试剂盒（Biovision）并按照制造商的方案测量细胞裂解液中的谷氨酸浓度。简单地说，每个受试样品1×106个细胞在100μl分析缓冲液中均质并离心以去除不溶物。向上清液、标准品和背景对照样品中添加100μl反应混合物，并在37°C下培养30分钟后，使用SpectraMax Plus384 MicroPlate Reader（分子器件）在450 nm处测量吸光度。实验一式四份。

补充材料

补充文件

单击此处查看。（210万，pdf）

致谢

Calin博士是Alan M.Gewirtz白血病与淋巴瘤学会学者。Calin博士实验室的工作部分得到了NIH/NCI拨款1UH2TR00943-01和1 R01 CA182905-01、NCI的UT MD Anderson癌症中心黑色素瘤SPORE拨款（P50 CA093459）、针对黑色素瘤基金会和Miriam和Jim Mulva研究基金、脑SPORE（2P50CA127001），放射肿瘤学研究中心项目、癌症表观遗传学中心试点项目、2014年知识GAP MDACC拨款、CLL登月计划试点项目、UT MD安德森癌症中心邓肯癌症预防和风险评估家庭研究所、SINF结肠癌拨款、劳拉和约翰·阿诺德基金会、，RGK基金会和小C·G·约翰逊庄园，。Berindan-Neagoe博士由POSCCE资助（709/2010），题为蛋白质组和转录组分子剖析在三阴性乳腺癌新辅助治疗（BREASTIMPACT）中的临床和经济影响。Gomes Dias博士、Ambrosio博士和Adamoski博士分别获得圣保罗研究基金会FAPESP 2014/15968-3、2014/20673-2和2014/17820-3的资助。Lu博士的部分资助来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心Sheikh Ahmed Bin Zayed Al-Nahyan胰腺癌研究中心。Bankson博士得到了癌症中心支持拨款（P30 CA016672）的支持，小型动物设施（SAIF）的HP成像项目得到了德克萨斯州癌症预防和研究院拨款RP-101243P5的支持。梁博士得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所R01CA175486拨款、德克萨斯州癌症预防与研究所的RP140462拨款和珍妮·F·谢尔比奖学金基金的R·李·克拉克研究员奖的支持。我们要感谢Riccardo Fodde博士（伊拉斯谟医学中心）的科学支持和建议，Sylvie Doublie博士慷慨捐赠CFIm25和CFIm68质粒，Riccardo-Spizzo博士生成HCT116CCAT2公司稳定的克隆，以及Thomas A Cooper博士慷慨赠送的RG6质粒。我们还要感谢IM Bioscope II-UT核心设施和Ana Maria Zaske博士执行AFM成像。此外，我们感谢流式细胞术和细胞成像核心设施（白血病科）的成员和Jared Burks博士进行VECTRA成像和分析，以及杨柳青博士（MDACC）、周宜宾博士（IBT）、克利夫德·斯蒂芬博士（IBT）、肖恩·布拉顿博士（MDAC）、查尔斯·金斯利博士（MDAAC）、豪尔赫·德拉塞尔达博士（MDADC）、，Iva Maestri（费拉拉大学）和Linda Ulazzi（费拉腊大学）提供技术支持。我们还要感谢生物成像设施、蛋白质纯化和生物分析实验室（LNBio/CNPEM/巴西）对设备的访问。

脚注

作者贡献：

构思并设计了实验：RSR、LEV、WL、JFO、AFF、MSR、MI、GB、MFF、SH、WRW、ALBA、AMGS和GAC。

执行实验：RSR、LEV、WL、JFO、CRA、DA、BP、AT、YC、KVR、SC、MS、YA、LHC、GYH、PM、MSR、TCI、LV和HL。

分析数据：RSR、LEV、WL、JFO、CI、CRA、DA、AT、AFF、LV、GK、JAB、MR、ALBA、SMGD和GAC。

贡献的试剂/材料/分析工具：LH、SK、RG、GL、SYL、RCB、PH、MGR、IBN和GLB。

撰写手稿初稿：RSR、SMGD、ALBA和GAC。

参与撰写手稿：RSR、SMGD、ALBA和GAC。

同意手稿结果和结论：所有作者。

对重要知识内容的手稿进行批判性修改：所有作者。

统计分析：CI、LH、GK、MR和HL。

研究监督：SMGD和GAC。

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