c-kit酪氨酸激酶抑制剂导致NK细胞依赖性抗肿瘤作用的新作用模式

Gleevec对体外Gleevec耐药肿瘤的体内疗效。

因此，我们在体外鉴定了几种对Gleevec的抗增殖作用具有耐药性的小鼠肿瘤模型（图​（图1A）1A） 但体内对Gleevec敏感。虽然体外微量Gleevec不能抑制B16F10黑色素瘤细胞的增殖，但口服Gleevec可显著抑制C57BL/6小鼠B16肺转移的形成（图​（图1B）。1B） ●●●●。Gleevec还诱导了对AK7间皮瘤和MCA102纤维肉瘤模型的显著抗肿瘤作用（数据未显示）。Gleevec介导的抗肿瘤作用可以通过添加FL来增强，FL是一种具有免疫刺激能力的造血生长因子(10). 事实上，短时间服用Gleevec（4天）和FL（FL+Gleevec）可促进协同抗肿瘤作用，对抗已建立的AK7间皮瘤，其中使用FL+Glee的无瘤小鼠高达45%，而单独使用FL的小鼠为14%，或单独使用Gleevec0%（图​（图1C）。1C） ●●●●。类似地，FL和Gleevec的联合阻止了100%的小鼠产生与抗原处理缺陷（TAP缺陷）RMA-S淋巴瘤相关的转运体，而FL和Gleevec都不能单独阻止这种淋巴瘤（图​（图2A）。2A） ●●●●。值得注意的是，无瘤小鼠对自体肿瘤细胞没有免疫力，因为再激发在大多数情况下是致命的（数据未显示）。因此，在体外对Gleevec耐药的肿瘤模型中，单独或与FL联合使用Gleevec可显著抑制肿瘤进展，这表明存在非细胞自主作用模式。

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图1

在体外对Gleevec抗增殖作用耐药的肿瘤模型中，Gleevec可阻止体内肿瘤进展。(A类)体外抗Gleevec小鼠肿瘤模型。将AK7、B16F10（B16）、RMA-S、MCA 102或BAF3p210细胞（携带BCR/ABL易位）与指定剂量的Gleevec孵育24小时，通过台盼蓝排斥试验测定存活细胞的绝对数量。显示了扩散指数。采用Wilcoxon双样本秩和检验比较增殖指数(*P（P）< 0.05). (B类)Gleevec可防止B16F10肺转移。我们注射了5×10⁵第0天尾静脉中的B16F10肿瘤细胞。口服Gleevec（150 mg/kg bid）或H₂在第5-11天给药O（200μl），并在第11天处死小鼠以计数肺转移。将来自3个独立实验的数据汇集在一起，每个实验包括每组5-7只小鼠。Wilcoxon双样本秩和检验用于比较肺转移瘤的数量(**P（P）<0.05，Gleevec与H₂O） ●●●●。(C类)FL和Gleevec协同根除AK7。我们接种了3×10⁶第0天C57BL/6小鼠腹侧AK7肿瘤细胞。当AK7肿瘤直径达到20±20 mm时，在第11天开始FL².FL持续10天，在FL被捕前一天与Gleevec合用，并连续8天（剂量与B类). 每个实验包括5-7只小鼠/组，重复两次，结果相似。Kruskal-Wallis多重比较试验用于统计分析，显著影响用三个星号表示。

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图2

Gleevec促进NK细胞依赖性抗肿瘤作用。(A类和B类)FL和Gleevec协同预防RMA-S肿瘤的形成。在C57BL/6小鼠的一侧腹部注射TAP缺乏的RMA-S细胞(A类)而将TAP充足的RMA细胞注射到相同小鼠的另一侧(B类). 注射相同数量的每种类型的细胞（10⁶单元格）。从注射前6天（第6天）到第3天，腹腔注射FL（10μg/天）或PBS（200μl）。从第1天到第4天，Gleevec（150 mg/kg bid）或H₂口服O（200μl）。括号中显示了实验结束时无肿瘤小鼠的数量。每个实验包括每组5只小鼠，重复两次，结果相似。(C类)Gleevec对B16F10肺转移瘤的抗肿瘤作用由NK细胞介导。在C57BL/6小鼠的第-4天、第-2天、第0天和第4天腹腔注射中和抗NK1.1单克隆抗体（300μg PK136单克隆抗体/小鼠）或正常小鼠血清（NMS）。第0天，5×10⁵将B16F10肿瘤细胞接种于尾静脉。口服Gleevec（150 mg/kg bid）或H₂在第5-11天给药O（200μl），并在第11天处死小鼠以计数肺转移。显示了一个代表性实验（共2个）的结果，包括每组5-7只小鼠。Kruskal-Wallis多重比较试验用于比较肺转移瘤的数量(*P（P）Gleevec和H之间<0.05₂NMS组中为O**P（P）Gleevec组NMS与抗NK1.1单克隆抗体之间的差异<0.01；H之间没有显著差异₂抗NK1.1单克隆抗体组中的O和Gleevec）。

格列卫促进NK细胞依赖性抗肿瘤作用。

FL和Gleevec的联合不能保护小鼠免受TAP充足的RMA肿瘤的发展（图​（图2B）。2B） ●●●●。由于已知TAP缺乏的肿瘤细胞是选择性NK细胞靶点(11)，由于对AK7和B16的免疫监测涉及NK细胞(10,12)，我们假设NK细胞可能是Gleevec介导的抗肿瘤作用的关键效应器。事实上，NK1.1的中和作用⁺接种B16F10黑色素瘤细胞的C57BL/6小鼠的细胞消除了Gleevec介导的抗转移作用（图​（图2C）。2C） ●●●●。在RMA-S肿瘤模型中也获得了类似的结果，其中抗NK1.1单克隆抗体显著抑制了FL和Gleevec联合诱导的抗肿瘤作用（数据未显示）。

为了证实长期暴露于格列卫或短期服用格列卫联合FL促进NK细胞活化，我们检测了各种小鼠品系（即无胸腺瑞士小鼠）NK细胞上活化标记CD69的上调^{数值/数值}免疫活性C57BL/6小鼠）。长期（15–21天）口服Gleevec诱导的脾脏T细胞丢失（图​（图3A）三A） 但选择性地允许NK细胞存活和/或扩增和激活（图​（图3，三、B和C）。相反，较短时间（4天）接触Gleevec并没有促进NK细胞活化。然而，FL与低剂量Gleevec（FL+Gleevec4天）联合使用可激活NK细胞，支持观察到的抗肿瘤作用（图​（图1）。1). 事实上，CD3的数量^–/DX5型⁺/CD69型⁺脾脏中的NK细胞（图​（图3D）三D） 以及瑞士人的肝脏（参见补充图1，A和B）^{数值/数值}与单独服用两种药物的同窝鼠相比，服用FL+Gleevec的小鼠数量增加，达到与注射重组白细胞介素-2后的水平相当的水平。此外，只有从FL+Gleevec治疗或IL-2治疗的小鼠获得的NK细胞在体外刺激后分泌IFN-γ（数据未显示）。FL+Gleevec的协同作用在C57BL/6基因背景下触发NK细胞激活（图​（图3E）。三E） ●●●●。因此，我们得出结论，NK细胞是参与Gleevec非肿瘤细胞自主作用模式的关键效应器。

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图3

Gleevec单独或与FL联合体内诱导NK细胞活化。(A类)长期暴露于C57BL/6小鼠的Gleevec可导致脾脏T淋巴细胞计数减少，但选择性地维持NK细胞亚群。在去除红细胞并进行粘附步骤后，在口服Gleevec（150 mg/kg bid）或H后15-21天，对脾细胞进行计数₂O（200μl），并使用抗CD3和抗NK1.1单克隆抗体通过流式细胞术进行分析。CD3的绝对数⁺/第1.1节^–T细胞和CD3^–/NK1.1标准⁺NK细胞是根据两个独立实验中获得的百分比推导出来的，并在方框中标明(B类). 在Gleevec口服期间，T淋巴细胞未被激活。在CD3中⁺/NK1.1标准^–显示了CD69的表达。(C类)在Gleevec治疗期间，NK淋巴细胞被激活。在CD3中^–/NK1.1标准⁺NK细胞门，CD69表达如图所示。瑞士的^{数值/数值}老鼠(D类)和C57BL/6窝友(E类)每天腹腔注射10μg FL或100μl PBS，持续10天。从第7天到第10天，小鼠接受Gleevec（150 mg/kg bid）或H₂O（200μl）。第11天，处死所有小鼠，分析NK1.1上NK激活标记CD69的表达⁺或DX5⁺/CD3（CD3）^–脾细胞。阳性对照组包括用rhuIL-2（1×10）治疗的小鼠⁵腹腔注射IU，持续4天）。采用非参数Kruskall-Wallis检验，通过方差分析（ANOVA）对各组进行比较*P（P）与PBS相比<0.05。^#P（P）与Gleevec相比<0.05。P（P）与FL相比<0.05。

Gleevec作用于宿主DC以促进NK细胞活化。

由于成熟NK细胞亚群表达KIT，并且表现出比KIT更高的细胞毒活性^–NK细胞亚群(13)，我们研究了Gleevec对NK细胞的直接作用。FL+Gleevec体内治疗不会增加KIT的频率⁺NK细胞（FL+Gleevec中占NK细胞总数的7%±2%，而对照组为7.2%±2.6%）。此外，Gleevec不能直接促进体外NK细胞产生IFN-γ（图​（图4A）。4A） ●●●●。由于已知FL会放大DC(14)由于成熟树突状细胞具有促进NK细胞效应器功能的独特能力，包括体内IFN-γ分泌和抗肿瘤作用(10,15)，我们假设Gleevec可以赋予NK细胞对宿主DC的刺激能力。Gleevec增强了NK细胞产生IFN-γ的能力，但仅当NK细胞与小鼠骨髓衍生DC（BM-DC）共同培养时（图​（图4A）4A） 或用10nM至1μM的格列卫刺激20小时的脾脏来源的DC（数据未显示）。在未经治疗的对照组中，一个BM-DC仅触发2个NK细胞，而一个Gleevec预处理的BM-DC（BM-DC^STI公司)有效触发10个NK细胞（图​（图4B）。4B） ●●●●。酪蛋白AG957，一种非选择性酪氨酸激酶抑制剂(16)，不促进DC介导的NK细胞激活（图​（图4B）。4B） ●●●●。采用转让BM-DC^STI公司变成瑞士人^{数值/数值}小鼠导致NK细胞活化，如脾脏DX5上CD69的上调所示⁺/CD3（CD3）^–NK细胞（数据未显示）。无论是否用Gleevec刺激，在单独培养或与NK细胞共培养的BM-DC上清液中均未检测到IL-2、IL-12和IL-18。由于Gleevec介导的NK细胞活化也在IL-12 p35中观察到^–/–BM DC，我们排除了IL-12的作用（图​（图4C）。4C） ●●●●。无论是单独培养还是与NK细胞共培养，BM-DC和Gleevec治疗的BM-DC中胸腺和活化调节趋化因子（TARC）、巨噬细胞衍生趋化因子和fractalkine的水平相似（数据未显示）。我们证实，NK细胞刺激活性不包含在Gleevec刺激的BM-DC的上清液中，而是与DC膜相关，因为Gleevec-预处理的BM-DCs从NK细胞中分离出来显著阻碍了DC对NK细胞的激活（图​（图44D） ●●●●。

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图4

Gleevec赋予DC NK细胞刺激能力。(A类)经Gleevec预处理的小鼠DC在体外表现出增强的NK细胞刺激能力。监测BM-DC+NK共培养上清的IFN-γ分泌。在缺乏BM-DCs的情况下，单独使用Gleevec或FL+Gleevec不会触发NK细胞的细胞毒性或IFN-γ的产生。(B类)Gleevec而非酪氨酸酶（AG957）增强DC的NK刺激活性。在Gleevec或酪朊蛋白存在的情况下，以不同的DC/NK比率（1:2，1:10）进行了三次实验。(C类)IL-12不参与Gleevec介导的NK细胞活化。中的约定A类但使用IL-12p35功能丧失的BM-DC代替WT BM-DC。(D类)STI介导的NK细胞激活依赖于细胞间的接触。BM-DC和NK细胞共培养物通过跨膜（BM-DC//NK）分离或不分离。(E类)长期接触Gleevec增强了宿主CD11c⁺激活NK细胞的DC容量。细胞分类CD11c⁺B220型^–用H处理的C57BL/6小鼠的脾细胞₂O或Gleevec与NK细胞孵育15–21天，如A类测量IFN-γ释放。显示了一个具有代表性的实验（共2个）。(F类)人CD34⁺-用格列卫刺激的衍生DC也促进NK细胞活化。CD34共培养后⁺-用纯化的人NK细胞衍生DC，观察NK细胞对K562的杀伤活性。表示了三个重复井的平均值（标准误差始终小于平均值的10%）。描述了一个具有代表性的实验（共5个）。使用非参数Kruskall-Wallis检验通过方差分析对各组进行比较(*P（P）< 0.05).

为了证实DCs是Gleevec体内的药理靶点之一，我们纯化了脾脏CD11c⁺来自格列卫的DC处理小鼠并将其与NK细胞一起培养。长期服用Gleevec可显著增强脾脏CD11c的NK细胞刺激能力⁺DC（图​（图4E）。4E） ●●●●。我们还研究了Gleevec在CD11c分化和活化中的作用⁺用FL治疗的裸鼠DC。FL每天给药10天，从第7天到第10天口服Gleevec。在第13天采集脾脏，以计数CD11c⁺/CD11b细胞^–和CD11c⁺/CD11b细胞⁺流式细胞术中的DC亚群。如表所示​表1，1在接受FL和Gleevec联合治疗的小鼠中，DC明显多于仅接受FL治疗的同胎鼠。两个DC子集-CD11c⁺/CD11b型-^–和CD11c⁺/CD11b细胞⁺-在FL联合Gleevec治疗后增加。然而，两组中MHC II类和共刺激分子的水平具有可比性，这表明Gleevec没有促进体内DC成熟，并且体内观察到的NK细胞激活不是由CD11c成熟触发的⁺小鼠DC。Gleevec还触发了人类系统中DC介导的NK细胞激活，这是通过CD56增强K562细胞的溶解来测量的⁺/CD3（CD3）^–外周血NK细胞与CD34来源的人DC共培养⁺前体并用Gleevec预处理（图​（图4F）。4F） ●●●●。重要的是，根据FACS分析和混合T淋巴细胞反应评估，Gleevec并没有在体外引发DC成熟（补充图2）。因此，Gleevec选择性地促进DC刺激NK细胞的能力，而不是T细胞。。因此，Gleevec单独或与FL联合促进体内NK细胞活化，导致NK细胞依赖性抗肿瘤作用。宿主树突状细胞是Gleevec的药理靶点，在体内外获得了NK细胞的刺激能力。

表1

FL和Gleevec联合增强CD11c+DC在体内的分化或存活

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DC中的KIT信号抑制NK细胞激活。

接下来，我们讨论了KIT依赖性转导途径在Gleevec促进的DC介导的NK细胞激活中的参与。事实上，KIT在GM-CSF和IL-4体外培养的第4天到第6天的BM-DC以及CD11c上表达⁺体内DC（补充图3，A和B）。因此，我们比较了KIT缺陷（WBB6F1 KIT）的NK细胞功能^W公司/工具包^W-v型; W/Wv）野生型WBB6F1小鼠^+/+（WT）在体外用BM-DC或体内用FL+Gleevec刺激后对小鼠进行对照。W-v突变受体在c-kit序列的660位表现出点突变(17,18)从而将其激酶活性降低到野生型水平的大约10%。W/Wv小鼠的BM-DC表现出完全分化BM-DC的典型表型特征（补充图4），但在激活异基因NK细胞方面比WT BM-DC更有效，而在触发YAC-1 NK细胞裂解的能力方面，T细胞（未显示）则不是（图4）​（图5A）5A） 和IFN-γ产生（图​（图5B）。5B） ●●●●。重要的是，Gleevec未能进一步增强W/Wv BM-DC促进NK细胞活化的能力（图​（图5），5)这与Gleevec的药理靶点已被抑制的事实相符。单独体内给予FL（不含格列卫）能够触发W/Wv NK细胞上CD69的上调（以及IL-2体外刺激的脾细胞中IFN-γ的分泌；未显示），而在WT对照小鼠中，FL和格列卫的组合需要激活NK细胞（图​（图5C）。5C） ●●●●。这进一步支持了Gleevec必须作用于KIT以诱导DC介导的NK细胞激活的观点。换句话说，Gleevec治疗提供了W/Wv突变的现象学。值得注意的是，服用FL后在W/Wv小鼠中观察到的NK细胞活性增强不能用NK细胞的绝对数量或突变本身来解释。事实上，FL并没有增加W/Wv小鼠NK细胞的绝对数量（6.8±0.4×10⁶重量比为5.6±1.3×10⁶W/Wv）与之前报告中的预期一致(13). 此外，c-kit的NK细胞活性^–/–NK缺乏小鼠的NK细胞（RAG2/γc^–/–)用W/Wv小鼠胎肝造血干细胞重建的细胞溶解性较差(13). 所有这些数据表明，Gleevec通过直接作用于DC中表达的KIT来刺激DC介导的NK细胞活性。

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图5

c-kit功能丧失突变W/Wv在DC介导的NK细胞活化方面表现出与Gleevec治疗相似的表型。(A类)KIT信号缺失增强了DC刺激NK细胞体外细胞毒活性的能力。实验设置与图中所示的相同​图4A，4A、 除了来源于WT WBB6F1小鼠（WT）或c-kit缺乏的WBB6F1小鼠（W/Wv）的BM-DC与WT NK细胞共培养，并在YAC-1细胞上评估NK细胞毒性(12). (B类)KIT信号不足刺激了体外NK细胞诱导DC分泌IFN-γ的能力。而不是像A类，评估培养上清液中IFN-γ的积累。(C类)W/Wv突变允许FL介导的NK细胞在体内激活。WT和^-W/Wv突变小鼠在体内用FL处理（与图中相同的剂量、时间表和统计方法​图3）。三). 所有实验进行了3次，结果相似。^#P（P）<0.05，与PBS治疗动物（W/Wv和WT动物）显著不同*P（P）<0.05，与FL处理的动物显著不同。

老鼠

内螺纹C57BL/6（H-2^b条)野生型或Rag2^–/–小鼠和雌性BALB/c SCID（H-2^d日)小鼠取自Elevage Janvier中心（法国Le Genest St.Isle）和Elevage Iffa Credo中心（法国L'Arbresle），并根据该机构动物实验伦理委员会的指导原则在Gustave Roussy研究所动物设施中饲养。瑞士的^{数值/数值}小鼠被饲养在IGR动物设施中。肥大细胞缺乏（WBB6F1^{W/WV（宽/宽）})（W/Wv）和控制同类肥大细胞–足够（WBB6F1^+/+)（WT）小鼠在巴斯德研究所动物设施（法国巴黎）饲养。亲本菌株（即WB-W/+和C57BL/6-W）的原始库存^v（v）/+)从杰克逊实验室（美国缅因州巴尔港）获得。来源于W/Wv小鼠的BM肥大细胞，由于c-kit序列660位的点突变而缺乏组织肥大细胞(17,18)经干细胞因子（SCF）刺激后，KIT分子磷酸化显著降低。所有雌性小鼠在6--25周龄时使用。

树突状细胞的体外生成

NK细胞的制备

DC/NK细胞共培养物的制备

之前已经描述过程序(12,19). 图图例中描述了主要原理。

NK细胞效应器功能评估

体内NK细胞功能评估

C57BL/6小鼠或瑞士^{数值/数值}在过去4天中，对表型进行了腹腔注射FL（10μg/只/天，持续10天）（由美国华盛顿州西雅图的Immunex Corp.善意提供）以及口服PBS或Gleevec（150 mg/kg bid）。阴性对照小鼠仅腹腔和口服PBS，阳性对照小鼠于10时腹腔注射rhIL-2（法国罗曼维尔罗塞尔·乌克拉夫）⁵IU/老鼠，竞标4天。第11天处死小鼠，检测DX5上CD69的表达水平⁺/CD3（CD3）^–（非BL6背景）或NK1.1⁺/CD3（CD3）⁻脾细胞上的NK细胞。在用三色mAb（抗CD3-FITC、抗DX5-PE或抗NK1.1-PE和抗CD69CyC）进行免疫染色之前，使用台盼蓝排除法计数细胞。

肿瘤模型

RMA是一种来源于B6的Rauscher’s病毒诱导的淋巴瘤细胞系，RMA-s是RMA的TAP缺陷型变体。将每种肿瘤细胞系的100万个细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的每侧，每两周监测一次治疗组的肿瘤生长。AK7是一种石棉诱导的C57BL/6小鼠间皮瘤，如前所述(12)MCA102是甲基胆蒽诱导的肉瘤，B16F10是黑色素瘤；两者均具有C57BL/6背景（由美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学M.T.Lotze善意提供）。YAC-1是一种Moloney白血病病毒诱导的a/Sn（H-2a）小鼠淋巴瘤细胞系。

泰尔梅先生获得了法国癌症控制协会的奖学金。C.博格得到里昂公民收容所和控制癌症协会（ARC）的支持。我们感谢诺华制药公司授权IGR在II期试验中评估患者的NK细胞效应功能。这项工作还得到了INSERM、ARC和LIGUE Labellisée Française Contre le Cancer以及欧洲共同体合同503319 Allostem拨款的支持。我们非常感谢阿兰·德鲁森特（Alain Deroussent），质谱分析的核心设施，54弗雷德拉蒂夫·德雷切研究所（Institute Fédératif de Recherche 54），以及参与其中的患者。我们感谢米歇琳·哈贾德（Micheline Hadjard）在采集和收集患者标本方面的非凡奉献。我们仍然感谢IGR动物设施工作人员的技术帮助。