结果
诱导成EMT的乳腺癌细胞中CSC数量增加
我们试图通过诱导肿瘤干细胞通过EMT来增加肿瘤干细胞在乳腺癌细胞群中的比例。为此，我们改良了实验转化的HMLER乳腺癌细胞(Elenbaas等人，2001年)通过shRNA介导的对人类的抑制CDH1型编码E-cadherin的基因。证实了先前的结果，shEcad载体触发了EMT并导致获得间充质表型(;Onder等人，2008年). 此外，对引入的人类shEcad构建物耐药的小鼠E-cadherin基因的表达导致EMT相关表型的逆转，这表明EMT诱导不是由于靶外shRNA效应().
间充质转分化的乳腺上皮细胞CSC数量增加，具有耐药性（a）表达E-cadherin、β-catenin和β-actin的HMLER细胞的蛋白质印迹GFP公司（shGFP）或人类ECAD公司基因（shEcad）。稳定引入小鼠ECAD公司基因（p.mEcad）而非GFP（p.GFP）导致E-cadherin蛋白的重新表达和EMT相关形态学的逆转。（b）带有CD24和CD44标记的FACS；CD44的百分比+/显示CD24亚群。（c）哺乳动物层形成分析和（d）HMLERshCntrl和HMLERsh Ecad乳腺癌细胞接种肿瘤。（e）培养中生长的HMLER shCntrl和HMLER shEcad细胞的增殖曲线。用台盼蓝染色法计数活细胞。（f）阿霉素或紫杉醇治疗的HMLERshEcad和HMLERsh对照乳腺癌细胞的剂量-反应曲线。（g）永生化、非肿瘤性乳腺上皮细胞（HMLE shCntrl）和通过EMT诱导的细胞（HMLEshEcad）的活性（h）紫杉醇治疗后GFP标记的HMLEshEcad细胞与对照细胞（HMLE）混合时的FACS比例。
接下来我们研究了通过EMT诱导的HMLER癌细胞群是否显示携带CD44的细胞比例增加高的/CD24型低的与人类乳腺CSC相关的标记谱。我们观察到CD44的百分比高的/CD24型低的HMLER中的细胞高约10倍shE码细胞比对照细胞（HMLERshC控制)（约90%对8%；). 通过Twist的表达，在HMLER细胞中观察到类似的增加，Twist是一种转录因子，其对EMT进行编程的能力已被充分证明(Mani等人，2008年;Yang等人，2004年).
接下来我们测试了HMLER的能力shE码悬浮培养时形成肿瘤球的细胞在体外CSC活动的度量。HMLER公司shE码相对于HMLER，细胞的肿瘤球形成能力增加了约100倍shC控制细胞（15个球体，而每100个细胞约0.15个球体；). 我们还直接分析了HMLER的能力shE码在小鼠体内植入肿瘤的细胞。1000 HMLER产生肿瘤shE码比HMLER肿瘤接种所需的细胞少100倍shC控制单元格(). 在显示CSC活动增加的同时，HMLERshE码细胞增殖速度比HMLER慢shC控制单元格(). 因此，使用所有已建立的CSC活性测量方法，接受EMT的HMLER乳腺癌细胞群中CSC的比例明显高于对照细胞群。
通过EMT诱导的正常和肿瘤细胞表现出更强的耐药性
癌症细胞群的药物治疗导致CSC的伴随富集(Levina等人，2008年)以及发生EMT的细胞(Eyler和Rich，2008年;汤姆森等人，2005年;Yang等人，2006年;Yauch等人，2005年). 因此，我们研究了实验诱导为EMT的乳腺癌细胞群是否也具有CSC生物学的这一方面，即对化疗药物的耐药性增加。我们发现HMLERshE码细胞比HMLER更具耐药性shC控制细胞被两种常用的化疗药物紫杉醇（IC50增加约20倍）和阿霉素（增加约5倍）(). 综上所述，这些发现表明，诱导EMT的乳腺癌细胞群与使用细胞表面标记物富集CSC的细胞群在操作上无法区分。
癌细胞通常携带无特征的基因改变，其中一些可能在重要方面导致EMT诱导后观察到的耐药性增加。因此，我们检测了未转化的上皮细胞在EMT诱导后是否也表现出耐药性增加。我们研究了HMLE细胞，它是永生化的乳腺上皮细胞，与HMLER细胞的不同之处在于它们缺乏一种HrasV12型致癌和非致癌。与转换后的HMLER类似shE码细胞中，当E-钙粘蛋白通过shRNA介导的抑制作用在这些细胞中下调时，产生的HMLEshE码细胞进行EMT，发现CD44的比例增加了约80倍高的/CD24型低的与HMLE相关的细胞shC控制控件(). 此外，如HMLERshE码细胞，非致癌HMLEshE码与未诱导进入EMT的对照细胞相比，细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性增加（10-20倍）(). 事实上，HMLEshE码细胞也比HMLE更具耐药性shC控制细胞与其他已建立的化疗药物，包括放线菌素D、喜树碱以及广谱激酶抑制剂staurosporine(). 这些结果表明，EMT诱导后观察到的耐药性增加不是肿瘤转化的结果。
接下来，我们研究了与诱导细胞通过EMT相关的耐药性增加是否会选择药物治疗后这些细胞的优先生长体外试验。因此，我们处理了绿色荧光蛋白（GFP）标记的HMLE的共培养shE码细胞和未标记、未分离的HMLEshC控制细胞（1:20比例）与紫杉醇培养。用紫杉醇（10nM）治疗4天，HMLE的比例增加了4倍shE码细胞与DMSO处理的共培养物的比较()表明紫杉醇治疗导致经历EMT的细胞选择性生长。
通过高通量筛选具有EMT特异毒性的化合物进行鉴定
上述结果表明：（1）接受EMT治疗的乳腺癌细胞中CSC增加了约100倍；（2）永生化非肿瘤原性上皮细胞（HMLE）对药物治疗的反应与其肿瘤转化的HMLER衍生物的药物治疗反应密切相关。还观察到HMLEshE码细胞对常用化疗药物的耐药性增加，我们推测，选择性靶向这些非转化细胞的药物也可能随后被发现对CSC表现出选择性毒性。
基于这一推理，我们设计了一个概念验证筛选，以识别选择性靶向间质转分化乳腺上皮细胞的药物。因此，我们筛选了测试化合物对HMLE的影响shE码和控制HMLEshC控制细胞。将每个细胞系的细胞接种在384孔板中，让其增殖一天，用测试化合物处理，三天后用发光分析法检测细胞活力；对每个细胞系的化合物进行两次筛选(; 方法）。我们筛选了约16000种化合物，其中包括几个不同的商业图书馆以及天然提取物；这些收集物中的许多化合物具有已知的生物活性（方法）。
选择性杀伤间质转分化永生化上皮细胞化合物的化学筛选（a）屏幕设计和协议的示意图。（b） （i）对照乳腺上皮细胞（HMLE）每种受试化合物活性的复制平均背景校正活性信号强度直方图（详见方法）shC控制). 低/高信号强度表示化合物降低/增加细胞活力。（ii）间质转分化乳腺上皮细胞（HMLE）每种受试化合物活性的标准化Z评分XY-散射图shE码; 红点表示DMSO处理；蓝色圆点表示测试化合物）。Z-scoreA和Z-score B表示屏幕的两个独立复制的标准化Z分数。（iii）数据如（i）所示，直方图中的红色阴影区域表示对照HMLE表现出中到强毒性（>1 S.D.低于平均标准化信号强度）的化合物shC控制上皮细胞。将（iii）中红色区域内的化合物从（ii）中的图中过滤出来，生成散点图（iv）该选择性过滤器的应用导致了选择性杀死间质转分化HMLE的化合物的鉴定shE码但不控制HMLEshC控制上皮细胞（黄色圆点）。
约10%的受试化合物降低了HMLE的活性shE码细胞，但这组化合物的绝大多数（98%）也降低了对照HMLE的活性shC控制细胞。只有32种化合物（约占总库的0.2%）对HMLE表现出选择性毒性shE码(). 在这个大型化合物库中包含的约100种常用化疗药物中，hits的比例并没有显著升高，只有三种表明对HMLE有选择性毒性shE码细胞。
根据它们的可用性，我们从这32种化合物中选择了8种进行进一步研究，并评估了它们在一系列剂量下的效果。重新测试后，这八种化合物中的四种显示出对HMLE的选择性毒性的一致证据shE码单元格(). 这四种化合物的化学特性通过高分辨率质谱法进行了确认（数据未显示）。其中三种化合物（足叶乙甙、盐霉素、阿维菌素）表现出中等到强的选择性（HMLE的IC50~10倍低shE码细胞比HMLEshC控制细胞）；第四种是尼日尔金，显示出更适度的选择性（约7倍）。选择性抑制永生化HMLE的四种化合物shE码由于Twist转录因子（HMLE）的强制表达，人类乳腺上皮细胞也优先杀死经历EMT的细胞扭曲;;补充图1). 因此，这四种化合物对HMLE的剂量反应曲线扭曲细胞与HMLE观察到的细胞基本相同shE码单元格(). 这些结果表明，这些化合物的选择性与诱导间充质转分化和相关干细胞特性获得的特定机制无关。
鉴定和验证对间质转分化上皮细胞具有选择性毒性的化合物（a）盐霉素、足叶乙甙、阿维菌素和尼葛霉素的化学结构，以及用所示化合物处理的对照HMLE-shCntrl细胞和HMLE-sh Ecad细胞的剂量-反应曲线。（b）HMLE-shCntrl和HMLE-Twist细胞活力的剂量-反应曲线。（c）用盐霉素、足叶乙甙、阿维菌素或尼葛霉素处理的对照HMLER和HMLER-shE致瘤乳腺上皮细胞的剂量-反应曲线。每个治疗组合至少重复6次。
虽然这四种化合物被鉴定为永生化人类乳腺上皮细胞（HMLE）的选择性抑制剂shE码)经过EMT后，尚不清楚它们是否也会对相应的致瘤细胞（HMLER）产生选择性作用shE码). 事实上，在一系列浓度下，盐霉素对HMLER具有选择性毒性shE码细胞（约8倍的选择性），而其余三种化合物（阿维菌素、足叶乙甙、尼日尔金）对HMLER仅表现出适度的选择性毒性（约2倍）shE码细胞，在所有情况下都与HMLER相关shC控制单元格().
盐霉素选择性杀死乳腺CSC
针对这些不同的观察结果，我们将进一步的研究重点放在盐霉素的特性上。我们观察到乳腺癌细胞系对盐霉素的敏感性与其CD44的相对丰度相关高的/CD24型低的CSC富集的亚群(补充图2). 因此，我们试图评估盐霉素对CSC的特异性影响，CSC是HMLER乳腺癌细胞中自然存在的一个亚群，而不是在实验诱导为EMT的人群中。对于这些以及随后的复合处理实验，我们对细胞进行了特定时间的处理，让细胞恢复4天，然后在没有额外处理的情况下进行后续的实验分析，因为该方案将确保在化学化合物持续存在的情况下，任何进一步的毒性都不会混淆用于测量CSC代表性的分析结果。
我们首先分析了治疗对CD44阳性乳腺癌细胞比例的影响高的/CD24型低的抗原表型(Al-Hajj等人，2003年). 盐霉素治疗降低CD44的比例高的/CD24型低的乳腺癌细胞是车辆治疗对照组的20倍；相比之下，紫杉醇治疗使这一比例增加了18倍。CD44的相对大小高的/CD24型低的因此，用盐霉素治疗后的分数是紫杉醇治疗后的360倍（HMLER_1，). 在对自然含有高比例CSC的HMLER乳腺癌细胞的独立群体进行的第二次实验中，我们观察到盐霉素治疗后CSC的比例比对照治疗（HMLER_2，). 我们观察到与SUM159人乳腺癌细胞株的比较结果(补充图3).
盐霉素和紫杉醇治疗对乳腺CSC数的影响（a）HMLER细胞按规定剂量用二甲基亚砜、紫杉醇或盐霉素处理4天，然后在没有处理的情况下恢复4天。CD44的百分比高的/CD24型低的在两个不同HMLER细胞群（HMLER_1，HMLER_2）的独立实验中进行复合处理后的细胞。CD44/CD24 FACS曲线显示了HMLER_2复合处理的一个子集，该处理具有绿色椭圆(
)表示CSC富集分数和蓝色椭圆(
)CSC贫化部分。（b）用（a）中处理的HMLER细胞量化肿瘤球形成。（c）HMLE和HMLER细胞（分别为HMLE_Mx和HMLER_Mx）的异质群体（对照/EMT混合物）经复合处理4天，在无复合物的情况下培养4天，CD44的百分比高的/CD24型低的细胞通过FACS定量。（d）HMLE_Mx和HMLER_Mx群体中乳房球形成的量化如（a）所述。显示了乳房球体的相位控制图像。（e）
体外如（a）所示的复合处理HMLER细胞的生长曲线。（f）在不含化合物的情况下，接种混合培养的MCF7Ras（4000个细胞/孔）和4T1细胞（1000个细胞/井），并在10天后评估肿瘤球的形成情况。（g）采用锥虫蓝排除法对亲本4T1株系和耐紫杉醇4T1系（4T1-TaxR）进行复合处理后的活细胞分数评估。
作为CSC频率的功能性测量，我们还检测了HMLER乳腺癌细胞在盐霉素、紫杉醇或DMSO对照治疗后形成肿瘤球的能力。与对照组相比，盐霉素治疗导致肿瘤球数量减少约10倍(). 相反，紫杉醇治疗并不影响形成的肿瘤球数量，反而导致肿瘤球大小显著增加。
我们推测，紫杉醇治疗无法增加相对瘤球数是因为本试验中使用的HMLER乳腺癌细胞系中CSC的比例已经很高。为了直接解决这个问题，我们通过重构CSC和非CSC的混合种群来控制CSC在测试种群中的比例；这是通过将被迫接受EMT的细胞与未经历EMT的对照细胞混合来实现的。这导致了对CSC的表示，允许在单个癌细胞群（称为HMLER_Mx）中分析对CSC数量的正负影响。
盐霉素治疗降低CD44的比例高的/CD24型低的相对于载体处理的对照，HMLER_Max细胞增加4倍；相反，紫杉醇治疗增加了CD44的比例高的/CD24型低的HMLER_Mx细胞4倍。CD44的相对比例高的/CD24型低的因此，盐霉素治疗后HMLER_Mx细胞比紫杉醇治疗后低16倍(). 同样，用盐霉素治疗永生化非肿瘤性HMLE_Mx细胞可降低CD44的比例高的/CD24型低的HMLE_Mx细胞4倍，而紫杉醇治疗增加了CD44的比例高的/CD24型低的HMLE_Mx细胞4倍().
我们还研究了药物治疗对乳腺癌（HMLER_Mx）或永生化乳腺上皮（HMLE_Mx）细胞在悬浮培养中形成集落的能力的影响。悬浮培养中的成球能力与癌细胞系中的CSC数量和未转化乳腺上皮细胞中的祖细胞活性相关(Dontu等人，2003年). 与对照组相比，盐霉素治疗导致HMLER_Mx肿瘤球数量减少13倍(). 相比之下，紫杉醇治疗导致HMLER_Mx肿瘤球数量比载体治疗增加2倍；和以前一样，紫杉醇也导致HMLER_Mx肿瘤大小显著增加().
盐霉素治疗也减少了非致瘤性HMLE_Mx群体的乳腺球形成（>10倍；). 相反，紫杉醇治疗不会影响HMLE_Mx乳腺球相对于车辆治疗对照的数量(). 相对于载体或紫杉醇治疗，盐霉素治疗不能抑制单层培养细胞的增殖()表明盐霉素对CSC活性的抑制不是一般抑制细胞增殖的结果。
接下来，我们研究了盐霉素、紫杉醇和二甲基亚砜治疗对另外两种乳腺癌细胞系的影响，这两种细胞系分别是小鼠乳腺癌细胞株（4T1）和人类乳腺癌细胞细胞株（MCF7Ras）。与对照二甲基亚砜（DMSO）处理相比，盐霉素处理使MCF7Ras细胞的肿瘤球形成潜能和4T1细胞的肿瘤细胞球形成潜能分别降低了约3倍和2倍(). 相比之下，与二甲基亚砜载体治疗相比，紫杉醇治疗使MCF7Ras细胞的瘤球形成潜能增加约3倍，4T1细胞增加约2倍(). 值得注意的是，对于4T1和MCF7Ras细胞，与DMSO处理的对照相比，盐霉素处理选择了具有与上皮分化增加相关的形态学特征的细胞(补充图4; 数据未显示）。相反，紫杉醇治疗选择表现出间充质和迁移表型的细胞(补充图4).
我们观察到，与之前未经紫杉醇治疗的亲代4T1细胞相比，紫杉醇处理4天，然后在无药物的情况下恢复4天的4T1-TaxR细胞（4T1-TasR细胞）对进一步紫杉醇疗法具有耐药性(). 相反，4T1-TaxR细胞虽然对紫杉醇耐药，但与亲代4T1细胞相比，对盐霉素治疗的敏感性增加了2倍(). 这些观察结果表明，紫杉醇治疗选择了对紫杉醇耐药增加但对盐霉素治疗敏感的间充质癌细胞。
盐霉素和紫杉醇对肿瘤种植、生长和转移的影响
我们还通过检测体内化学复合治疗后的肿瘤种植能力在体外对于这些实验，用化合物处理HMLER和4T1癌细胞在体外连续7天，在未经治疗的情况下，让其在培养基中恢复和膨胀至少14天，然后将系列限制稀释液注射到小鼠体内。我们观察到，相对于紫杉醇预处理，盐霉素预处理导致HMLER和4T1癌细胞株的肿瘤接种能力下降了100倍以上(). 这些发现表明，乳腺癌细胞群中的CSC对紫杉醇耐药，但对盐霉素治疗敏感。
盐霉素和紫杉醇治疗对肿瘤种植、生长和转移的影响体内（a）盐霉素、紫杉醇或二甲基亚砜处理的HMLER和4T1乳腺癌细胞的肿瘤交配能力。（b）SUM159复合处理小鼠肿瘤生长曲线。（c）量化从复合治疗小鼠分离的SUM159肿瘤中分离出的癌细胞的肿瘤球形成潜能（评估直径在20-50μm之间）。显示了肿瘤圈培养的图像。（d）盐霉素或车辆治疗小鼠肿瘤的组织学分析。显示H&E、caspase-3、人特异性波形蛋白和E-cadherin染色。（e）4T1癌细胞尾静脉注射，用紫杉醇、盐霉素或二甲基亚砜预处理。所示肺部图像是在放大1.5倍的条件下拍摄的。图像下方显示了各治疗组肺负荷的平均值和标准误差。（f）复合处理的4T1乳腺癌细胞肺结节的H&E、波形蛋白和E-cadherin染色。图中还显示了从肺结节中移植培养的4T1细胞的图像。
接下来，我们用紫杉醇（5mg/kg）、盐霉素（5mg/kg）或溶媒每天给小鼠原位注射SUM159人乳腺癌细胞。虽然载体治疗的小鼠在约1.5周内出现可触及的肿瘤，但紫杉醇和盐霉素治疗均将可触及的肿瘤形成延迟约2周。盐霉素治疗动物的后续肿瘤大小相对于车用治疗动物的肿瘤减小(). 虽然盐霉素和紫杉醇治疗小鼠的肿瘤缩小程度与车辆治疗对照组相当，但后者在以后的时间点显示肿瘤缩小(). 癌细胞注射4周后，使用在体外肿瘤球形成分析。与盐霉素或载体治疗组相比，紫杉醇治疗组的肿瘤球形成细胞增加了2倍().
与同等大小的车用小鼠肿瘤相比，盐霉素治疗小鼠的肿瘤坏死和凋亡增加(). 盐霉素治疗小鼠肿瘤中的活癌细胞大多局限于肿瘤的外围(). E-cadherin蛋白在SUM159系中正常不表达，在盐霉素治疗小鼠的肿瘤中特异性表达，而在对照载体治疗小鼠的瘤中不表达(). 表达E-钙粘蛋白的细胞表现出更分化的上皮形态，这表明盐霉素治疗诱导了SUM159癌细胞分化体内或选择用于扩展体内SUM159癌细胞亚群中上皮分化增加。
CSC被提议在转移性传播时负责次级器官部位的定植(Li等人，2007年;克罗克和艾伦，2008年). 因此，我们研究了盐霉素治疗后CSC数量的减少是否也伴随着转移性结节形成能力的降低。为了明确检测转移的最后一步，我们通过尾静脉注射将4T1癌细胞接种到同基因动物的肺部。4T1细胞预处理在体外在生长3周后，含盐霉素的肿瘤转移负担降低了4倍体内与车用电池相比(). 相反，与载体预处理的对照队列相比，用紫杉醇预处理的4T1人群的转移形成增加了2倍().
接下来，我们对4T1转移动物的肺部进行染色，以检测上皮分化标记物（E-cadherin）和EMT（vimentin）。与二甲基亚砜处理的4T1细胞形成的结节相比，由紫杉醇处理的4T1细胞生成的肺结节显示波形蛋白染色增强，E-钙粘蛋白染色降低(). 相反，与DMSO处理的4T1细胞形成的结节相比，盐霉素处理的4T1细胞形成肺结节，E-cadherin增加，波形蛋白表达降低(). 此外，从肺结节中移植和培养的4T1细胞表现出不同的形态；紫杉醇处理的4T1细胞表现为间充质形态，而盐霉素处理的4T1细胞表现出与上皮分化相关的形态(). 连同我们之前的观察结果(补充图4)这些结果表明，紫杉醇和盐霉素治疗对乳腺癌细胞的分化状态产生相反的影响，前者诱导间充质转分化增加，后者诱导上皮分化增加，与DMSO载体治疗相比。此外，分化状态中的这些变化是稳定的，在3周的生长期内保持不变体内.
盐霉素治疗后CSC相关基因表达减少
为了确定我们对培养的人类乳腺癌细胞的观察结果是否代表了乳腺癌中自然存在的乳腺CSC，我们对三个群体的HMLER乳腺癌细胞进行了比较性的全球基因表达分析，这些细胞分别与盐霉素或紫杉醇平行治疗(). 然后我们应用了基因集富集分析（GSEA）(Mootha等人，2003年;Subramanian等人，2005年)检测先前与乳腺CSC或正常乳腺上皮前体细胞相关的基因是否与盐霉素治疗HMLER乳腺癌细胞（相对于紫杉醇治疗）后下调的基因相关。
盐霉素和紫杉醇治疗影响与患者预后不良相关的CSC基因表达用盐霉素或紫杉醇一式三份处理HMLER细胞，然后进行微阵列基因表达分析。（a）显示差异表达的基因(|t吨-使用欧氏距离测量法在热图上绘制盐霉素（Sal）和紫杉醇（Tax）处理条件之间的统计|>5）。（b、c、d）盐霉素治疗降低临床相关乳腺CSC和祖细胞基因的表达。基因集富集分析用于确定之前报告的（b）CD44+CD24−IGS(Liu等人，2007年),（c）CD44+CD24−(Shipitsin等人，2007年)或（d）哺乳动物(Dontu等人，2003年)与紫杉醇治疗相比，盐霉素抑制了基因集。图中是基于差异表达的Kolmogorov-Smirnov富集分数与基因等级。显示了反映每个分析的统计显著性的P值。相对于盐霉素和紫杉醇治疗之间的差异表达，基因集中每个基因的等级以水平线显示在每个图形旁边的垂直条中。
通过比较CD44的表达谱，产生了第一个被测试的基因集，称为侵袭性基因特征高的CD24型低的正常乳腺上皮表达谱的致瘤乳腺癌细胞(Liu等人，2007年). 以前的一份报告表明，这一特征与四种不同类型肿瘤的无转移生存率和总生存率呈负相关(Liu等人，2007年). 该特征中上调的97个基因构成了CD44+CD24−IGS基因集。GSEA显示，与紫杉醇治疗相比，盐霉素治疗组的基因表达显著降低（p<6×10−3，CD44+CD24−IGS基因集，). 第二组基因称为CD44vs。CD24基因集是通过比较来自CD44的SAGE表达数据生成的高的或CD24高的直接从人类乳腺癌中纯化的细胞(Shipitsin等人，2007年). 这组由CD44中上调的41个基因组成高的对乳腺癌患者的临床预后也有预测价值的细胞。GSEA表明，与紫杉醇治疗相比，用盐霉素治疗培养的乳腺癌细胞后，这组基因的表达显著降低（p<2.9×10−2，CD44与。CD24，).
第三个基因集——哺乳动物基因集（31个基因）是通过比较在有利于乳腺上皮干细胞扩增的条件下培养的正常乳腺上皮细胞的表达谱与在有利于分化的条件下培育的细胞的表达图谱而获得的(Dontu等人，2003年). GSEA表明，与紫杉醇治疗相比，盐霉素治疗后乳腺球特异性基因的表达优先缺失（p<5×10−4，乳腺球，).
盐霉素处理细胞中这些基因集的缺失表明与正常CD44和肿瘤CD44相关的乳腺上皮细胞状态之间存在重叠高的CD24型低的细胞、哺乳动物球的接种和EMT的传代。为了确定在所有这三种细胞状态中一致调控的基因，我们比较了在（1）紫杉醇与盐霉素处理的HMLER细胞中表现出强烈差异表达的基因，（2）悬浮培养条件下生长的原代人类乳腺上皮细胞与贴壁培养条件下的原代乳腺上皮细胞(Dontu等人，2003年)和（3）CD44+与CD24+对正常和肿瘤原代人乳腺上皮细胞(Shipitsin等人，2007年)..
我们发现，在所有三个比较中，有25个基因的上调幅度都超过了3倍，而在所有三种比较中，14个基因的下调幅度都超过3倍(). 值得注意的是，几乎所有协同调节的基因都编码膜相关或分泌因子的蛋白质，后者包括细胞外基质的多种成分。这表明这些基因及其产物与正常和肿瘤干细胞状态的特定表型有关。
表1
基因在复合处理（紫杉醇vs.盐霉素）癌细胞和富含干细胞样细胞的正常和肿瘤性乳腺上皮细胞中差异表达显示了所有三个比较中差异表达>3倍的基因，以及每个数据集中差异表达的程度。数据来自（1）紫杉醇与盐霉素处理的HMLER细胞，（2）在悬浮集落或粘附条件下生长的原始人类乳腺上皮细胞(Dontu等人，2003年)（3）富含CD44+或CD24+细胞的正常和肿瘤人类乳腺上皮人群(Shipitsin等人，2007年). 报告的基因(Dontu等人，2003年)如仅在两个条件中的一个条件中表示，所比较的在表达上具有大于10倍的变化。
| 昂飞
问题ID | 紫杉醇
与。
盐霉素 | 球体
与。
粘附剂 | CD44细胞+
与。
CD24型+ | 基因
符号 | 基因
描述 |
|---|
|
乳腺CSC上调
| 202403_天 | 21.53 | 4.51 | 22.10 |
COL1A2公司
| 胶原蛋白，I型，α2 |
| 209392_安 | 16.99 | 4.88 | 18.65 |
ENPP2公司
| 外核苷酸焦磷酸酶 |
| 202465_天 | 12.80 | 22.67 | 5.22 |
PCOLCE公司
| 前胶原内肽酶增强子 |
| 207173_x_at | 11.21 | 14.93 | 20.15 |
CDH11型
| 钙粘蛋白11，2型，OB-cadherin |
| 209156秒 | 9.20 | 21.87 | 22.68 |
COL6A2系列
| 胶原蛋白，VI型，α2 |
| 202283_吨 | 9 | 12.06 | 24.62 |
SERPINF1系列
| 蛇毒肽酶抑制剂，F链 |
| 212667_安 | 8.59 | 4.24 | 24.27 |
SPARC公司
| 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白 |
| 202766年_月_日 | 8.19 | 5.13 | 21.64 |
FBN1型
| 原纤维蛋白1 |
| 218162_吨 | 7.39 | >10 | 15.33 |
OLFML3级
| 类嗅觉素3 |
| 202310天 | 6.40 | 17.31 | 19.37 |
COL1A1公司
| 胶原蛋白，I型，α1 |
| 212158_吨 | 6.27 | 4.99 | 5.97 |
SDC2系统
| 合成癸烷2 |
| 213869_x_at | 5.87 | >10 | 52.34 |
胸腺1
| Thy-1细胞表面抗原 |
| 212154_安 | 5.82 | 5.36 | 5.97 |
SDC2系统
| 合成癸烷2 |
| 2015年8月_日 | 4.76 | 8.5 | 8.78 |
IGFBP4型
| 胰岛素样生长因子BP4 |
| 212091_s_at（邮编：212091_s） | 4.69 | >10 | 15.86 |
COL6A1系列
| 胶原蛋白，VI型，α1 |
| 203186天 | 4.52 | 6.73 | 6.31 |
S100A4型
| S100钙结合蛋白A4 |
| 211981页 | 4.28 | >10 | 31.52 |
COL4A1系列
| 胶原蛋白，IV型，α1 |
| 210809秒 | 4.23 | 5.55 | 36.56 |
邮政
| 骨膜蛋白 |
| 212298_吨 | 4.10 | 5.11 | 8.95 |
尼泊尔卢比1
| 神经纤毛蛋白1 |
| 211966_安特 | 4.01 | >10 | 31.52 |
COL4A2系列
| 胶原蛋白，IV型，α2 |
| 211709秒 | 3.82 | 3.53 | 18.65 |
CLEC11A电缆
| C型凝集素结构域家族11 |
| 2015年_月 | 3.71 | >10 | 11.96 |
APOD公司
| 载脂蛋白D |
| 203729_天 | 3.62 | 6.12 | 5.21 |
电磁脉冲3
| 上皮膜蛋白3 |
| 210201_x天 | 3.38 | 3.07 | 17.14 |
垃圾桶1
| 桥接积分器1 |
| 209081_秒_秒 | 3.19 | 31.08 | 10.11 |
COL18A1系列
| 胶原蛋白，XVIII型，α1 |
|
乳腺CSC下调
| 209529_吨 | −3.48 | <−10 | −6.62 |
PPAP2C
| 磷脂酸磷酸酶2C |
| 219976_安特 | −3.64 | <−10 | −4.96 |
挂钩1
| 钩子同源物1（果蝇） |
| 202023_天 | −5.46 | <−10 | −5.54 |
EFNA1型
| 肾上腺素-A1 |
| 205286_天 | −5.76 | −3.62 | −8.27 |
TFAP2C型
| 转录因子AP-2γ |
| 201688年_月_日 | −5.90 | <−10 | −4.99 |
第52页
| 肿瘤蛋白D52 |
| 210715_秒_秒 | −7.47 | −3.28 | −9.34 |
旋转2
| 丝氨酸肽酶抑制剂 |
| 219850_秒 | −8.32 | −4.97 | −14.41 |
肠出血性（EHF）
| ets同源因子 |
| 208083秒 | −8.86 | <−10 | −15.89 |
ITGB6标准
| 整合素，β6 |
| 207291_安 | −9.56 | <−10 | −14.41 |
PRRG4项目
| 富含脯氨酸的G羧基谷氨酸4 |
| 203780_吨 | −9.86 | −7.23 | −17.74 |
疏散1
| 髓鞘蛋白零样2 |
| 204351_吨 | −19.86 | −4.01 | −12.57 |
S100P型
| S100钙结合蛋白P |
| 201839年_月_日 | −32.09 | −4.59 | −9.98 |
TACSTD1系统
| 肿瘤相关钙信号传感器1 |
| 202489年_月_日 | −36.28 | −3.28 | −10.64 |
FXYD3型
| FXYD域离子转运调节区3 |
| 209772_秒_秒 | −49.10 | −3.69 | −28.73 |
CD24型
| CD24分子 |
讨论
鉴于CSC耐药的治疗方法多种多样，CSC可能表现出对凋亡的普遍抵抗，这表明在实践中可能不可能找到专门针对CSC的治疗方法。在此，我们证明情况并非如此，事实上可以使用无偏见的筛选策略系统地识别专门针对乳腺CSC的化合物。这里描述的方法可以扩展到其他上皮癌类型，并使用与高通量筛选兼容的任何试剂集来实现，包括RNAi、抗体或cDNA过表达库。
如图所示，盐霉素优先靶向乳腺癌细胞群中CSC的活性。此外，盐霉素而非紫杉醇治疗会导致与预后较差的肿瘤相关的CSC相关基因的表达缺失。这一发现表明，培养中的乳腺CSC具有反映体内CSCs生物学，因为这里检测的预后较差的CSC相关基因集是根据两项独立的研究使用直接从患者身上分离的组织编译而成的。此外，CSC中协调表达的基因子集和盐霉素处理细胞中下调的基因子集()可能作为有用的生物标记物，用于识别对抗CSC治疗有反应的乳腺肿瘤。
这里报道的筛查是使用基因定义明确的不致瘤永生乳腺上皮细胞进行的。采用这种实验设计是为了尽量减少发现依赖于未定义基因改变的化合物的可能性，以便选择性地杀死经历EMT的细胞。通过非肿瘤细胞筛选鉴定的化合物也以CSC为靶点，这一观察为CSC状态与EMT之间的联系提供了进一步证据(Mani等人，2008年). 此外，这一观察为抗肿瘤治疗的发展提供了新的途径。到目前为止，合理的癌症疗法已经被设计成针对肿瘤中存在的特定基因改变。这里的研究结果表明，第二种方法也可能被证明是有用的，即寻找靶向特定癌细胞分化状态的药物。因此，未来的治疗方法可以通过考虑诊断时肿瘤细胞内的基因改变和分化状态，为个体化治疗提供更大的可能性。
钾离子载体盐霉素诱导乳腺CSC特异性毒性的机制尚不清楚。尼日利亚霉素是另一种与盐霉素结构相似的钾离子载体，对HMLE也表现出选择性毒性shE码我们的主屏幕和后续验证中的单元格。需要进一步研究，以确定钾膜电位与CSC生物学之间的联系。
未来一个重要的方向是将本文报道的结果推广到直接从患者体内移植的原代肿瘤细胞。然而，此类研究必须克服两个重大的技术挑战：（1）目前只有约20%的患者源性乳腺癌可以成功地直接植入免疫功能低下的小鼠宿主体内；（2）手术切除时患者肿瘤的遗传和组织病理学变异性将混淆不同异种移植动物药物治疗效果的任何比较体内因此，这样的实验设计将需要来自被诊断为患有相同亚型乳腺癌的患者的大量原发性肿瘤样本，并且将理想地对遗传背景进行分层。
靶向CSC的重要性源于多项观察结果，这些观察结果表明，CSC除了具有增加的肿瘤播散潜能外，还对多种化疗药物和放射治疗具有耐药性。如图所示(菲尔莫尔和库珀瓦瑟，2008年)紫杉醇治疗实际上为CSC的生存和扩张提供了强有力的选择。这表明，如果化疗或放射治疗无法彻底根除疾病，残留的癌细胞将高度富集，以供持续处于CSC/间充质状态的细胞使用。最近的临床观察表明，在常规化疗后，乳腺肿瘤中CD44阳性细胞的比例增加，这一观点得到了支持你好/CD24型洛标记谱与肿瘤球形成能力的增强(Li等人，2008年). 总之，这些考虑表明，为了长期有效，癌症治疗应该包括针对CSC的药物，以防止肿瘤细胞群的再生长。
可以想象，肿瘤中的非CSC可以以较低但显著的速率引起CSC。肿瘤内CSC的消除也可能不会导致其完全消退，因为非CSC虽然侵袭性较小，但仍可能能够在较长时间内维持已建立的肿瘤。这些可能性中的任何一种都会损害专门针对CSC的药物的治疗效用。解决这一问题的一个策略是寻找针对肿瘤内CSC和非CSC的药物。或者，最好开发组合疗法，将对CSC具有特定毒性的药物与针对肿瘤内非CSC人群的药物结合使用。
由于与化合物可用性相关的实际考虑，目前的研究主要集中于单一药剂盐霉素的抗CSC特性。然而，我们的实验表明，在重新测试时，约30%的主要屏幕点击显示EMT特异性毒性。因此，将当前筛选的广度和范围扩大到更大的图书馆收藏，很可能会发现更多具有治疗兴趣的试剂。
实验程序
细胞培养
表达对照shRNA（shCntrl）或靶向E-cadherin（shEcad）shRNA的HMLE和HMLER细胞在MEGM+5%FBS中生成并保持。表达GFP的HMLE细胞株和HMLE-shEcad细胞株是通过感染编码pWZL-GFP质粒的逆转录病毒而生成的。SUM159细胞（Asterand）在F12+5%FBS、胰岛素和氢化可的松中培养。4T1细胞（ATCC）维持在RPMI+10%FBS中。
如前所述进行哺乳动物层形成分析(Dontu等人，2003年)，但含有0.5%甲基纤维素（干细胞技术）。每孔1000个细胞被放置在低粘附96周的平板中，培养7-10天，然后进行计数和拍照。
抗体
用于免疫印迹的抗体有：E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白（BD转导）、波形蛋白V9（新标记物）、肌动蛋白（Abcam）、H-Ras（Santa Cruz）、细胞角蛋白8（Troma-1，爱荷华大学发育研究杂交瘤库）。如前所述进行蛋白质印迹(Onder等人2008). 用于免疫组织化学的抗体为：泛细胞角蛋白（克隆AE1/AE3和PCK26，Ventana Medical Systems）、Vimentin（3B4，Ventna和V9，Vector Labs）、caspase-3（Asp175，Cell Signaling）、E-cadherin（ECH-6，Ventan和Vector Labs）。如前所述进行免疫组织化学程序(Gupta等人，2005年).
荧光激活细胞分选（FACS）
APC结合抗CD44（克隆G44-26）抗体、PE结合抗CD24抗体（克隆ML5）和碘化丙啶（5μg/ml）从BD Biosciences获得，并根据制造商的协议用于FACS分析。
细胞毒性试剂抗性的表征
所有化合物均购自Sigma并溶解在DMSO中。将细胞（5000/孔）以100μl/孔的浓度镀于96 well板中。接种后一天（24小时），对每个细胞系以每个浓度重复5次的方式添加化合物。72小时后，使用CellTiter96非放射性水测定法（Promega）测量细胞活力。
对于细胞混合实验，将未标记和GFP标记的细胞混合并接种到6孔板中。在FACS之前，对微孔进行三次复合处理48小时。
化学筛选和分析
化学筛选在布罗德研究所的化学生物学平台进行。细胞接种在40μL每孔含有1000个细胞的培养基中，使用自动平板填充器（Bio-Tekμfiller；Winsooki，VT）将其接种到384孔白色乳白色平板（Nunc，Rochester，NY）中。24小时后，将100nL的化合物溶液从储备384孔板针转移到含有细胞的384孔分析板中，最终浓度约为10uM。对于大多数化合物。
HMLE公司shC控制和HMLEshE码每个品系分两个重复进行筛选。采用两种阴性对照孔进行归一化：在筛选的每个复合分析板上有多个仅含DMSO的对照孔（>10%的孔/板）；此外，每个细胞系至少一个分析板上的所有微孔均单独用二甲基亚砜处理。在添加化合物（20ul/孔）3天后添加CellTiter-Glo试剂（Promega）。使用自动平板读取器（Perkin-Elmer Envision 1）测量发光信号。
通过减去同一平板上所有对照孔的中值强度，对每个孔的原始强度数据进行背景校正。使用背景校正数据，通过减去所有平均值并除以所有重复标准偏差的两倍，计算所有ZScore。通过将标准化复制Z评分向量（ZscoreA，ZscoreB）投影到对应于完美再现性的假想向量上，计算每个化合物/细胞系组合的复合Z评分。
筛板的内部复合板编号为2158-2167、2099-2105、2290-2297、2403-2407、Biokin1-2。初步筛查数据已存入Chembank（屏幕ID:1108），这是一个可公开访问的数据库(http://chembank.broad.harvard.edu/).
初级筛选化合物的后续验证
所有用于随访的化合物均购自Sigma，并溶解于二甲基亚砜中，但尼日利亚霉素除外，其溶解于100%乙醇中。在初始筛选所述的相同细胞密度和培养条件下，通过生成HMLE-shCntrl、HMLE-sh Ecad和HMLE-Twist的剂量-反应曲线来量化化合物的活性。
动物实验
NOD/SCID和Balb/c小鼠购自Jackson实验室。所有小鼠程序均由麻省理工学院和塔夫茨大学医学院动物护理和使用委员会批准，并根据机构政策执行。
对于异种移植瘤接种研究，将指定数量的HMLER-shCntrl、HMLER-sh Ecad或药物治疗（DMSO载体对照；10nM紫杉醇；1uM盐霉素）HMLER细胞悬浮在100μl的DMEM中1:2稀释的Matrigel中，并皮下注射到NOD-SCID小鼠中。对于药物预处理实验，在体内注射前，亲代HMLER细胞被处理1周，并在无药物的情况下恢复2周。注射后60天监测肿瘤发生率。对于同基因肿瘤接种研究，4T1细胞用紫杉醇（10nM）、盐霉素（4uM）或二甲基亚砜预处理4天在体外将30ul 1:1 Matrigel:DMEM溶液中的细胞注射到胸部和腹股沟乳腺中。用于尾静脉注射，1×105将4T1细胞重新悬浮在100ul盐水中。通过触诊检测肿瘤形成。将肿瘤和组织固定在10%缓冲福尔马林中。使用Spot Software v4.1.3在捕获的图像上量化肺部肿瘤负担，以计算平均肿瘤表面积。
对于体内复合治疗研究，1×106将SUM159细胞重新悬浮在F12培养基中，并注入4第个NOD/SCID小鼠的腹股沟乳腺。注射24小时后开始复合治疗。每天通过腹腔注射给动物注射乙醇（载体）、盐霉素（5mg/kg）或紫杉醇（5mg/kg），持续5周。
肿瘤细胞分离和瘤球分析
将SUM159肿瘤组织切碎并消化3小时，在37°C下用胶原酶和透明质酸酶搅拌。将单细胞悬液（30000个细胞/孔）放置在6孔超低连接板（Corning）中，在F12+5%FBS、胰岛素和氢化可的松中。肿瘤球培养8天。使用Multisizer 3 Coulter计数器（尺寸范围为14-336μm）对从非粘附培养物中收集的肿瘤球进行定量。
在解剖显微镜下尸检时分离出4T1个肺结节。将肺结节切碎，分离4T1细胞，置于DMEM+10%FBS中7天。
