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单元格。作者手稿；PMC 2016年9月10日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2015年9月10日；162(6): 1229–1241.
2015年8月27日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2015.08.016
预防性维修识别码：项目经理4864363
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院715339
PMID：26321679

肿瘤微环境中的代谢竞争是癌症进展的驱动因素

张志浩,1,# 景秋,1,三，# 大卫·奥沙利文,1,三 迈克尔·D·巴克,1,三 野口隆,1 乔纳森·柯蒂斯,1,三 陈琼玉,1 玛丽尔·金丁,1 马修·古宾,1 Gerritje J.W.van der Windt公司,1,2 Elena Tonc公司,1 罗伯特·D·施赖伯,1 爱德华·皮尔斯,1和埃里卡·皮尔斯1,三，*
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摘要

T细胞对癌症的保护失败被认为是由于缺乏抗原识别、慢性激活和/或其他细胞的抑制所致。通过小鼠肉瘤模型，我们发现肿瘤对葡萄糖的消耗会限制T细胞的代谢，导致其mTOR活性、糖酵解能力和IFN-γ的产生减弱，从而导致肿瘤进展。我们表明，增强抗原“回归源”肿瘤中的糖酵解足以覆盖T细胞控制肿瘤生长的保护能力。我们还表明，临床上使用的针对CTLA-4、PD-1和PD-L1的检查点阻断抗体可以恢复肿瘤中的葡萄糖，从而允许T细胞糖酵解和IFN-γ的产生。此外，我们发现直接阻断肿瘤上的PD-L1通过抑制mTOR活性和降低糖酵解酶的表达来抑制糖酵化，这反映了PD-L1在肿瘤葡萄糖利用中的作用。我们的结果表明，肿瘤引起的代谢限制可以在癌症期间介导T细胞低反应性。

图形摘要

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简介

确定为什么某些癌症会进展而另一些则不会，这是免疫学长期面临的挑战。破坏强免疫原性肿瘤是抗肿瘤免疫反应的关键部分。然而，表达弱免疫原性抗原的癌症逃避杀伤，这可能是肿瘤进展的主要机制(Vesely和Schreiber，2013年). 众所周知，肿瘤通过T细胞功能障碍或低反应性逃避免疫。癌症患者的T细胞中都描述了无能、疲惫和衰老(Crespo等人，2013年;惠里，2011)T细胞功能障碍与慢性TCR刺激、缺乏协同刺激以及其他细胞的主动抑制有关。然而，是否存在其他机制，或者肿瘤中T细胞低反应性是如何建立的，尚不清楚。

细胞之间的营养竞争会影响细胞的生长、存活和功能。肿瘤微环境中的细胞之间可能存在激烈的竞争，因为对该生态位资源的需求很高。肿瘤和免疫细胞之间的代谢相互作用已经被证明。肿瘤细胞可以表达吲哚胺2,3-双加氧酶，这是一种消耗色氨酸并抑制T细胞增殖的酶(Munn和Mellor，2013年;Munn等人，1999年). 肿瘤衍生乳酸也可以通过阻断乳酸输出抑制T细胞功能(Fischer等人，2007年)破坏了它们维持有氧糖酵解的能力。有氧糖酵解是最佳T细胞效应器功能所必需的(Cham等人，2008年但不是为了激活、增殖或生存(Chang等人，2013年). 我们之前发现在体外，肿瘤细胞竞争T细胞获取葡萄糖，而葡萄糖的缺乏直接阻碍了细胞因子的产生，而细胞因子对肿瘤的清除至关重要。因为许多肿瘤的糖酵解率很高(Gatenby和Gillies，2004年;沃堡，1956年)，我们假设肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞（TIL）可能会由于肿瘤引起的葡萄糖限制而导致代谢改变而丧失功能。

我们试图确定肿瘤微环境中的葡萄糖竞争本身是否可以通过调节TIL的“营养补充”状态及其功能来决定癌症的进展。

结果

肿瘤葡萄糖限制T细胞，改变其代谢和功能

我们使用了一个已建立的肿瘤退化和进展的小鼠模型(Gubin等人，2014年;Matsushita等人，2012年). D42m1-T2（R肿瘤）是D42m1肉瘤的回归克隆，表达主要排斥抗原突变体spectrin-β2。移植到小鼠体内后，第12天发生肿瘤排斥反应的方式取决于TIL产生的IFN-γ(Matsushita等人，2012年). D42m1-T3（P肿瘤）是D42m1的一个进行性克隆，缺乏该排斥抗原，在移植后进行性生长(图1A). 我们用活化的C3 T细胞培养R或P肿瘤，这些T细胞识别突变的spectrin-β2(Matsushita等人，2012年)并测量IFN-γ的产生。我们预测，无论葡萄糖竞争如何，与R肿瘤细胞一起培养的C3 T细胞可能会产生更多IFN-γ，因为它们会受到R肿瘤细胞上抗原的刺激，而单独培养或与P肿瘤细胞一起培育的C3 T-细胞，由于没有额外的刺激，其产生的IFN-γ更少。然而，单独培养的C3 T细胞比与R肿瘤细胞培养时产生更多IFN-γ，与P肿瘤细胞培养的C3T细胞产生的IFN-γ最少(图1B). 当肿瘤与多克隆T细胞培养时，观察到IFN-γ产生的类似结果(数据未显示). 此外，IFN-γ的产生与共培养后培养基中残留的葡萄糖量相关(图1C). 我们向共培养物中添加葡萄糖，IFN-γ的产生显著增加(图1B)表明葡萄糖的利用，以及对这种糖的竞争，直接调节T细胞效应器的功能。我们确认细胞外酸化率（ECAR）(Nicholls等人，2010年)是有氧糖酵解的指示物，在有氧的情况下葡萄糖转化为乳酸的过程，在P肿瘤中高于R肿瘤(图1D，左），支持P肿瘤消耗更多葡萄糖(图1C). 尽管这些肿瘤的ECAR不同，但它们的增殖率在体外都很相似(图1D（右），证明糖酵解与这些细胞的增殖没有直接耦合。为了进一步探讨葡萄糖竞争，我们用雷帕霉素（mTOR）的机械靶点抑制剂破坏了R肿瘤糖酵解(Kim等人，2002年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年)或使用Akt激活剂4-羟基三苯氧胺（4-HT）促进糖酵解(Doughty等人，2006年;Kohn等人，1998年) (图S1A). 我们用活化的OT-I T细胞培养肿瘤细胞，OT-I细胞识别Ova肽，不能介导针对该肿瘤的抗原特异性反应，从而使我们能够独立于抗原特异性刺激评估细胞因子反应。在PMA/离子霉素刺激下，与雷帕霉素预处理的R肿瘤细胞培养的T细胞比未处理的肿瘤细胞产生更多IFN-γ(图S1B)而与4-HT预处理的R肿瘤细胞培养的T细胞产生的IFN-γ较少(图S1C). 添加葡萄糖以剂量依赖的方式增加IFN-γ的生成(图S1C)表明肿瘤和T细胞竞争葡萄糖。

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肿瘤介导的葡萄糖限制改变T细胞代谢并抑制其产生细胞因子的能力

(A类) 1×106将d42m1衍生的R或P肿瘤细胞皮下注射到129S6小鼠（n=5）中。肿瘤大小显示为两个独立实验的10只小鼠的两个垂直直径±SEM的平均值。(B类)C3 T细胞单独培养，或与1:5的P或R细胞培养24h，然后PMA/离子霉素刺激±20mM葡萄糖（Glc）5h，用FACS测定IFN-γ。%IFN-γ+T细胞（右上）和平均荧光强度（MFI）（垂直）；代表≥2个独立实验。(C类)培养物中的葡萄糖浓度(B类)刺激前；表示≥2个独立实验，以平均值±SEM表示**第页=0.0087, ***第页=0.0011. (D类)ECAR和R或P肿瘤增殖。在第0天和第3天测量CellTrace Violet（CTV）标记细胞的增殖情况，这代表了3个以上的独立实验***第页=0.001. (E类)将R或P肿瘤皮下注射到129S6小鼠体内，并于第12天分离TIL。(F类)通过FACS在TIL中表达CD44、CD62L、PD-1、T-bet、磷酸化4E-BP1（p4E-BPl）和S6K（pS6K），代表了≥3个独立实验。(G公司)ECAR和OCR/ECAR体外肿瘤细胞和TIL。光学字符识别（O2消耗率）是OXPHOS的指标。数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM**第页=0.003, ***第页=0.001. (H（H）)TIL的最大糖酵解能力。条形图显示为平均值±SEM，代表2个独立实验。(我)在PMA/离子霉素刺激5h后测量TIL中IFN-γ的产生。IFN-γ产生细胞的轮廓图（上图）和MFI（下图）。代表≥3个独立实验。(J型)肿瘤细胞外环境中的葡萄糖浓度***第页=0.0005. 5只小鼠的平均数据。(K（K）)将2-NBDG静脉注射到荷瘤小鼠体内，15分钟后收获肿瘤。直方图（上图）描述了TIL 2-NBDG摄取。条形图（如下）显示了3只小鼠的平均MFI±SEM**第页=0.0147. 另请参见图S1。

尽管R和P肿瘤的抗原性不同，但肿瘤特异性T细胞浸润这两种肿瘤(Gubin等人，2014年;Matsushita等人，2012年). R和P肿瘤中的TIL被激活并表达T-bet(图1E、F，顶部），表明来自任一肿瘤的TIL在转录水平上能够产生IFN-γ(Anichini等人，2010年;Parish和Kaech，2009年). 然而，如图所示(Gubin等人，2014年)，P肿瘤中的TIL为PD-1你好与低反应性一致(Ahmadzadeh等人，2009年;Baitsch等人，2011年). 大体上，R和P肿瘤的免疫细胞浸润相似，尽管T调节（Treg）细胞的相对频率以及M1和M2巨噬细胞的平衡不同(图S1D–F). 这些结果表明，当激活的TIL浸润这两种肿瘤时，P肿瘤中的TIL可能是低反应性的。

我们想知道P肿瘤中较高的糖酵解是否限制了微环境中的葡萄糖，并导致TIL低反应性。mTOR是一种环境传感器，当营养素受到限制时，mTOR通路信号减少(Gatenby和Gillies，2004年;Kim等人，2002年). 我们推断，mTOR活性将直接反映TIL营养状况。与R-TIL相比，P-TIL降低了4E-BP1和S6激酶磷酸化(图1F，底部）。这些数据支持这样的观点，即P肿瘤消耗更多的葡萄糖(图1C)并显示较高的ECAR(图1D，左），因此具有更高的糖酵解速率，对TIL施加比R肿瘤更严重的葡萄糖限制。

虽然肿瘤中存在许多抑制T细胞的信号(Francisco等人，2010年;Keir等人，2008年;Simpson等人，2013年)，我们关注的是肿瘤中的代谢竞争是否是导致免疫细胞功能障碍的基本力量。P-TIL的ECAR低于R-TIL(图1G，左），表明有氧糖酵解较少。与R-TILs不同，P-TILs在呼吸受阻时不会强烈增加糖酵解(图1H).离体P肿瘤细胞的ECAR也高于R肿瘤细胞(图1G，右），这与从该肿瘤中分离出的TIL的代谢成反比(图1G，左），表明肿瘤和TIL之间存在代谢相互作用。再刺激后，PTIL产生的IFN-γ少于R-TIL(图1I)P肿瘤环境中的葡萄糖浓度较低(图1J). 这些数据表明，P肿瘤的ECAR升高，而肿瘤微环境中的可用葡萄糖降低。为了直接确定PTIL是否受葡萄糖限制，我们注射了荧光葡萄糖类似物2-NBDG并跟踪TIL对其的摄取。与R-TIL相比，P-TIL获得的2-NBDG更少(图1K)，这与他们减少的ECAR一致(图1G，左）。综上所述，这些结果表明，TIL在P肿瘤中受葡萄糖限制，这是其糖酵解能力和效应器功能受损的原因。

肿瘤复合营养素限制可导致T细胞低反应性，即使肿瘤具有高抗原性

抗原特异性T细胞反应对肿瘤清除至关重要(Baitsch等人，2011年;Matsushita等人，2012年)R（而非P）肿瘤表达的突变血影蛋白-β2是肿瘤排斥反应的重要靶点(Matsushita等人，2012年). 鉴于R和P肿瘤的抗原性不同，我们设计了实验来研究营养竞争如何单独影响TIL活性。我们首先使用表达Ova（EL4-Ova）和OT-I T细胞的EL4肿瘤，以便研究营养限制对具有明确抗原特异性的T细胞的影响。我们通过增加肿瘤细胞数量来加强营养限制。我们注射了1×106或40×106EL4-Ova细胞经腹腔（i.p.）和静脉（i.v.）转移2×104将OT-I T细胞移植到小鼠体内(图2A). OT-I T细胞浸润了高或低肿瘤负荷小鼠的腹腔，但注射40×10的小鼠的mTOR活性较低6肿瘤细胞(图2B). 此外，这些细胞在重新刺激后产生较少的IFN-γ，这在作为抗肿瘤反应的一部分进入腹腔的内源性T细胞中也很明显(图2C). 试图暂时提高接受OT-I T细胞和40×10的小鼠的血糖水平6EL4-Ova细胞，我们在评估OT-I T细胞IFN-γ产生之前2.5和5小时注射一团葡萄糖或PBS。我们同时向这些小鼠注射BFA以捕获就地IFN-γ的产生。葡萄糖注射小鼠的T细胞产生更多IFN-γ(图2D). 这些数据表明，抗原特异性T细胞效应器功能可能受肿瘤细胞数量和葡萄糖浓度的影响体内这表明肿瘤对T细胞的营养限制可能导致低反应性。

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体内葡萄糖竞争调节抗原特异性T细胞中mTOR活性和细胞因子的产生

(A类) 1×106或40×106将EL4-Ova细胞腹腔注射到接受2×10剂量的C57BL/6小鼠体内4天真OT-I Thy1.1+在第7天评估腹腔内的T细胞。(B类)通过FACS和1×10移植小鼠的相对MFI评估OT-I T细胞的磷酸化4E-BP1（p4E-BPl）、S6K（pS6K）和S6（pS6）6EL4-Ova细胞（1）或40×106EL4-Ova细胞（40）归一化为注射1×10的小鼠T细胞的MFI6EL4-Ova细胞。条形图显示为4个独立实验的平均值±SEM**第页=0.0085, ***第页=0.001. (C类)供体OT-I T细胞和CD8产生IFN-γ+和CD4+PMA/离子霉素再刺激后5小时宿主T细胞；%IFN-γ+T细胞（左上）和IFN-γ的MFI+细胞（垂直），代表2个独立实验。(D类)供体OT-I T细胞体内干扰素-γ产生。小鼠腹腔注射EL4-Ova细胞和同源的原始OT-i T细胞。7天后，小鼠腹腔注射BFA和PBS或葡萄糖，2.5小时后再次注射。第一次注射后5h收集细胞并用FACS分析。点图显示IFN-γ的MFI+与PBS治疗小鼠相关的细胞。点代表单个小鼠；水平条表示两个独立实验的平均值±SEM。*第页=0.0142.

肿瘤和T细胞之间的营养竞争可以调节癌症的进展

中的实验图2显示尽管存在更多抗原，但T细胞仍出现低反应性，与已发表的数据不同，这些数据表明，增加无细胞抗原浓度可促进T细胞IFN-γ的产生(Constant等人，1995年). 我们推断，当抗原充足时，肿瘤可能通过营养摄入抑制免疫，使TIL处于代谢劣势。我们的目的是直接改变肿瘤代谢，以便我们可以在使用相同肿瘤、细胞数相等的组之间进行比较，从而消除不同抗原性的混淆因素。肿瘤细胞在低血糖中长时间培养可通过增加呼吸来适应(Birsoy等人，2014年)表明调节营养素可以改变新陈代谢。我们在高糖（50 mM）和低血清（1%FCS）中培养R肿瘤细胞数周，以选择糖酵解增强（R-1%）的R肿瘤细胞，同时在对照培养基中培养原始R肿瘤（11 mM葡萄糖，10%FCS）。当返回对照培养基时，与原始R肿瘤细胞相比，R-1%肿瘤细胞显示出增强的ECAR和葡萄糖摄取，尽管在P肿瘤细胞中没有观察到这种程度(图3A). 我们将R-1%的肿瘤移植到小鼠体内，14名受体中有10名发展为完全进展的肿瘤，或表现出延迟消退(图3B,S2A公司). 在第20天，所有13个原始R肿瘤均已消退，而14个R-1%肿瘤中只有4个完全消退(图3B,S2A公司). 进展中的R-1%肿瘤仍表达突变型spectrin-β2(图3C,S2B型)表明R-1%肿瘤中“进展”表型的增加并非由于TIL识别的优势表位的丢失。此外，R和R-1%肿瘤细胞以相同的速度生长在体外(图S2C)和RAG中的−/−缺乏B和T细胞的小鼠(图3D). 这些数据表明，R-1%肿瘤的进展并不是由于增殖增强或肿瘤固有的生存优势，而是由于肿瘤引起的适应性免疫反应受损。

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增强正常排斥的抗原肿瘤的糖酵解代谢促进肿瘤进展

(A类)R肿瘤在完全培养基（11 mM葡萄糖和10%FCS：R）或高糖/低FCS培养基（50 mM和1%FCS：R-1%）中培养3周以上，并测量ECAR（左）。通过FACS测量肿瘤细胞中的2-NBDG摄取量（右）。数据是3个独立实验的平均值，R和P组值也用于图5B.2-NBDG MFI归一化为R肿瘤MFI。ECAR数据代表3个独立实验***第页=0.001. (B类)129S6小鼠皮下注射1×106R或R-1%肿瘤细胞。肿瘤大小显示为两个垂直直径的平均值±SEM(C类)体外R-1%“进展”肿瘤和培养的R和P肿瘤细胞spectrin-β2表达。数据来自3个人体外R-1%肿瘤。(D类) 1×106将R或R-1%的肿瘤细胞皮下注射到Rag中−/−129S6小鼠和肿瘤生长监测。数据(B类和D类)来自2个独立实验。(E类)用空逆转录病毒载体（R-EV-Ctrl）或表达c-Myc（R-cMyc）、PDK1（R-PDK1）、Glut1（R-Glut1）或HK2（R-HK2）的载体转导R肿瘤细胞（R-No-Tdx），并测量ECAR；代表≥4个独立实验**第页=0.0012，R-EV控制vs.R-cMyc，第页=0.0091，R-EV控制vs.R-PDK1，第页=0.0026，R-EV控制vs.R-Glut1，以及第页=0.0196，R-EV控制vs.R-HK2***第页=0.001，对于R-No Tdx与R-EV控制。(F类) 2×106将转导的R肿瘤细胞皮下注射到129S6小鼠体内，并监测肿瘤生长21天，代表≥3个独立实验。(G公司)转导肿瘤的Spectrin-β2表达。(H（H）)携带转基因肿瘤的小鼠在第12天静脉注射2-NBDG，并通过TIL和FACS测量肿瘤细胞获取。数据显示为根据R-EV-Ctrl标准化的TIL与肿瘤的MFI比值。点代表单个小鼠；水平条表示3个独立实验的平均值±SEM**第页=0.009，R-EV控制vs R-cMyc，第页=0.0065，R-EV控制vs R-Glut1，以及第页=0.0066，R-EV控制vs R-HK2。另请参见图S2。

虽然在糖酵解以外的R-1%肿瘤中可能存在差异，但我们推断，它们的进展是由于葡萄糖摄取增加所致(图3A，右侧）。因此，我们预测直接操纵糖酵解途径也应将R肿瘤转变为进展性肿瘤。利用基因获得功能的方法，我们用逆转录病毒表达c-Myc（一种驱动糖酵解的转录因子）来转导R肿瘤(Gordan等人，2007年). c-Myc表达的R肿瘤（R-cMyc）显示增强的ECAR在体外(图3E)与表达空载体的R肿瘤（R-EV-Ctrl）相比。我们还观察到，R-EV-Ctrl肿瘤的ECAR高于非转导的R肿瘤细胞。这些数据表明，虽然与非转导R肿瘤和R-EV-Ctrl肿瘤相比，R-cMyc肿瘤的糖酵解增强应具有进展表型，但与非转染R肿瘤相比，可以想象R-EV-Ctrol肿瘤也会出现一些进展，因为其糖酵化增强。我们将R-cMyc肿瘤移植到小鼠体内，30只小鼠中有22只（73%）在第21天肿瘤≥5mm，而41只R-EV-Ctrl肿瘤小鼠中只有5只（12%）肿瘤大于此大小(图3F,S2D系列). 我们推测，与非转导的R肿瘤相比，R-EV-Ctrl肿瘤的ECAR升高会导致少数小鼠的进展或延迟消退，而非转导R肿瘤通常在第21天完全消退(图1A,​，3B）。3B公司). 因此，我们根据第21天的肿瘤大小对各组进行了比较。重要的是，c-Myc表达的R肿瘤保持了突变型spectrin-β2的表达(图3G,S2B型). 这些数据表明，尽管仍存在抗原，但表达c-Myc的肿瘤变得更加糖酵解，并获得“进展型”表型。

由于c-Myc可能会驱动糖酵解以外的程序，因此我们更直接地测试了葡萄糖竞争在抗原肿瘤进展中的作用。我们用表达丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）的逆转录病毒转导R肿瘤，PDK1是一种位于糖酵解和氧合磷之间关键分岔点的酶(Gerriets等人，2015年). 我们还用葡萄糖转运蛋白Glut1和糖酵解途径中的第一种酶己糖激酶II（HK2）转导R肿瘤细胞。与R-EV-Ctrl细胞相比，表达PDK1-、Glut1-和HK2-的R肿瘤（R-PDK1、R-Glut1和R-HK2）显示出更高的ECAR，这与糖酵解增强一致(图3E). 当将25个R-PDK1肿瘤中的16个（64%）、15个R-Glut1肿瘤中的6个（40%）和15个R-HK2肿瘤中的10个（67%）移植到小鼠体内时，第21天肿瘤≥5mm，而41个R-EV-Ctrl肿瘤中只有5个（12%）(图3F,S2D系列). 所有肿瘤均表达突变型spectrin-β2(图3G,S2B型). 此外，在营养丰富的条件下，活化的C3 T细胞可有效杀死R-1%和转导的R肿瘤在体外进一步证实这些肿瘤仍然具有完全的抗原性(图S2E、F). 此外，培养的转基因肿瘤在体外(图S2G)，或在RAG中−/−老鼠的生长速度相当相似(图S2H)表明表达糖酵解基因的肿瘤与EV-Ctrl的肿瘤之间的进展差异不仅是由于生长速度的差异。我们将2-NBDG注射到携带转基因肿瘤的小鼠体内。表达糖酵解基因的肿瘤中的TIL获得的葡萄糖少于表达EV-Ctrl的肿瘤中TIL的葡萄糖(图3H). 在共培养中，糖酵解基因转导的肿瘤细胞抑制OT-I细胞IFN-γ生成的程度高于EV-Ctrl转导的瘤细胞，并且葡萄糖的添加显著增加了IFN-γ的生成(图S2I). 总之，这些结果表明，肿瘤细胞代谢可以通过损害抗原特异性免疫反应来决定癌症的进展。

检查点阻断疗法纠正进展中肿瘤中T细胞的营养限制

检查点阻断疗法通过靶向抑制T细胞的蛋白质激活抗肿瘤免疫(Brahmer等人，2012年;Hamid等人，2013年;Hodi等人，2010年). 这种治疗会影响T细胞增殖(Spranger等人，2014年)，功能(Spranger等人，2014年;West等人，2013年)和葡萄糖摄取(Parry等人，2005年)但这些不同治疗方法的确切机制尚不清楚(Page等人，2014年). 我们推断，由于这些治疗在诱导P肿瘤消退方面是有效的(Gubin等人，2014年)如果我们提出的肿瘤代谢竞争模型是正确的，那么治疗后应该会对肿瘤/TIL代谢产生影响。我们在移植后第3天、第6天和第9天将P型肿瘤移植到小鼠体内，并用同型对照或CTLA-4、PD-1或PD-L1阻断抗体治疗，并在第12天评估代谢参数和TIL功能(图4A). 所有阻断抗体治疗导致P型肿瘤消退(图4B) (Gubin等人，2014年)同种型对P或R肿瘤生长的结果没有影响(图4B). 我们在第12天切除肿瘤，并测量细胞外环境中的葡萄糖浓度。阻断抗体治疗小鼠的肿瘤细胞外葡萄糖含量高于同种治疗小鼠（与R肿瘤相似）(图4C). 此外，与来自同型治疗小鼠的TIL相比，来自阻断抗体治疗小鼠的P-TIL增强了ECAR(图4D)，将肿瘤中的葡萄糖可用性与TIL中的糖酵解相关联。P-TIL中mTOR靶点的磷酸化被恢复到与R-TIL类似的水平(图4E). 最后，肿瘤中葡萄糖的增加和TIL中ECAR的增加与治疗后TIL产生IFN-γ的增加相关(图4F). 我们的数据表明，阻断治疗可以纠正肿瘤诱导的TIL葡萄糖限制，并恢复其糖酵解能力，从而恢复其效应器功能。

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进展性肿瘤中的T细胞在检查点阻断治疗后恢复糖酵解能力和效应器功能

(A类)129S6小鼠（n=6-8）在接种肿瘤后第3、6和9天，皮下注射R或P肿瘤细胞，并用抗CTLA-4（αCTLA-4）、抗PD-1（αPD-1）、抗-PD-L1（αPD-L1）或同种对照（Iso）抗体治疗。(B类)肿瘤大小显示为≥3个独立实验的两个垂直直径±SEM的平均值。(C–E类)第12天测量肿瘤细胞外环境中的葡萄糖浓度(C类). 将数据归一化为R-Iso肿瘤，并描述1-3个独立实验的平均值±SEM*第页=0.0208, **第页=0.0015（R vs.P-Iso）**第页=0.0024, ***第页=0.001. (D类)检查站封锁后的TIL ECAR。标准化为R-Iso肿瘤的数据，描绘了3个独立实验的平均值±SEM***第页<0.001. (E类)FACS测量TIL中4E-BP1、S6和S6K的磷酸化。条形图（左）显示为4个独立实验的平均值±SEM，直方图（右）代表4个独立试验。第4E-BP1页：*第页=0.0249**第页=0.0047（αCTLA-4）**第页=0.0050（αPD-1）。第S6K页：**第页=0.0024（αCTLA-4）**第页=0.0025（αPD-L1）。第6页：*第页=0.0145（αCTLA-4）*第页=0.015（αPD-1）*第页=0.0134（αPD-L1）。(F类)PMA/离子霉素再刺激5h后TIL产生IFN-γIFN-γ+细胞（左上角）和IFN-γ的MFI+单元格（垂直）；代表3个独立实验。（G） 检查站封锁后TIL的OCR与ECAR（均数±SEM）。来自3个独立实验的数据。另请参见图S3。

葡萄糖利用率的变化也可能反映在TIL OXPHOS的变化中。通过绘制OCR与ECAR，我们建立了R与P肿瘤TIL代谢适合性的基线；该测量结果强调，与P-TIL相比，R-TIL具有更高的OXPHOS和糖酵解(图4G). CTLA-4和PD-1抗体将P-TIL中的ECAR和OCR增加到与R-TIL中观察到的水平相等或更高的水平，表明这些治疗增强了TIL的整体代谢适应性。然而，PD-L1抗体主要促进TIL中的有氧糖酵解，而不是OCR(图4G).

除了增强TIL竞争葡萄糖的能力外，阻断抗体还可能增加TIL竞争其他底物的能力。我们评估了谷氨酸脱氢酶（Glud1）的蛋白表达，该酶催化谷氨酸氧化脱氨基生成α-酮戊二酸，这是T细胞能量平衡的一个重要过程(Wang等人，2011年). 经PD-L1抗体治疗的小鼠P-TIL中Glud1表达增加(图S3A). 这些数据表明，除葡萄糖外，肿瘤内还可能存在对氨基酸甚至其他未检测到的营养素和生长因子的竞争，并强调了检查点封锁广泛增加了TIL的代谢适应性，这可能是这些治疗在癌症治疗中的有益效果的核心。

我们推测，经过治疗的小鼠肿瘤中的葡萄糖升高是由于免疫介导的杀伤作用，导致肿瘤细胞数量减少，从而减少葡萄糖消耗。众所周知，阻断抑制性受体可以增强T细胞的活化(Francisco等人，2010年;Keir等人，2008年)这可能反映出这些治疗可以使T细胞更好地竞争葡萄糖等营养物质，从而使TIL参与更多的糖酵解。与此想法和发布的报告一致(Parry等人，2005年;Pedicord等人，2015;Staron等人，2014年)甚至治疗在体外已经高度糖酵解的活化T细胞与PD-1和CTLA-4抗体进一步轻微增加ECAR(图S3B、C).

PD-L1直接调节肿瘤代谢

T细胞IFN-γ诱导肿瘤PD-L1，PD-L1通过PD-1/PD-L1相互作用抑制T细胞功能，使肿瘤逃避免疫介导的攻击(Francisco等人，2010年;Keir等人，2008年). 而PD-L1在黑色素瘤上的表达与T细胞浸润之间存在相关性(Quezada和Peggs，2013年)，并非所有癌症都是如此。胶质母细胞瘤患者通常具有较高的PD-L1表达，但这与肿瘤中观察到的TIL水平无关(Berghoff等人，2014年). 此外，神经元上PD-L1的表达已被证明通过一种未知但免疫依赖的机制杀死胶质母细胞瘤细胞(刘等人，2013)，和PD-L1对癌细胞介导的T细胞杀伤的作用在体外独立于PD-1发生(Dong等人，2002年). 我们考虑了PD-L1除了通过PD-1向T细胞发出负信号外还有其他功能的可能性。我们测试了阻断肿瘤PD-L1是否直接改变了肿瘤代谢。术后P肿瘤细胞ECAR和葡萄糖摄取降低在体外PD-L1抗体治疗(图5A、B). R肿瘤细胞的ECAR低于P肿瘤细胞，治疗后ECAR降低较小(图5A). 抗另一种表面蛋白主要组织相容性复合物I的抗体不影响ECAR(图S4A). PD-L1阻断剂还不同程度地抑制了B16黑色素瘤、MC38结肠癌、L细胞和来源于d42m1母细胞肉瘤的进展克隆中的ECAR(图S4B)这表明肿瘤对这种治疗有不同的敏感性。

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PD-L1促进肿瘤细胞中mTOR活性和糖酵解代谢

用干扰素-γ预处理R或P肿瘤细胞，然后用PD-L1阻断（αPD-L1）或同型控制（Iso）抗体。(A类)ECAR后处理。来自≥5个独立实验的数据显示相对ECAR归一化为R-Iso肿瘤***第页=0.0001. (B类)通过FACS测量肿瘤细胞对2-NBDG的摄取。来自3个独立实验的数据标准化为R肿瘤MFI值***第页=0.001. (C类)western blot分析p4E-BP1、pS6K和pS6；代表3个独立实验；FACS评估的p4E-BP1和pS6K的代表性直方图。(D类)通过蛋白质印迹检测Akt、磷酸化Akt（pAkt）和糖酵解酶PGK1、TPI和LDHa；代表3个独立实验。(E类)表达高水平PD-L1的R肿瘤克隆用抗PD-L1抗体（αPD-L1）在冰上处理15分钟，然后在冰上保存（0分钟）或在37°C下孵育30分钟（30分钟），并在酸性溶液中洗涤，以将抗体从细胞表面分离（+酸洗）或不处理（无酸洗）。固定后，用抗鼠IgG A488（红色）培养细胞，检测细胞表面的αPD-L1。渗透后，用抗大鼠IgG A647（黄色）孵育细胞，检测表面表达和内化的αPD-L1和核染色（蓝色）。通过共焦显微镜对细胞成像。代表4个独立实验的数据。(F类)转导肿瘤细胞的ECARpdl1型shRNA（PD-L1 hp）或对照hp对抗荧光素酶（Ctrl-hp）。从2个独立的实验中，表现为相对ECAR归一化为R Ctrl hp细胞***第页<0.0001。(G公司)western blot检测p4E-BP1、pS6和pS6K；代表3个独立实验。(H（H）)Akt、pAkt，PGK1、LDHa和TPI的Western blot；代表3个独立实验。(我)干扰素-γ预处理的R或P肿瘤细胞（顶部）或经抗PD-L1治疗的PD-L1 hp或Ctrl-hp转导的肿瘤细胞（底部）上PD-L1的表达。(J型)用表达PD-L1的逆转录病毒转导后，表达高（Hi）和低（Lo）表面PD-L1水平的R肿瘤的ECAR，表示为2个独立实验的平均值±SEM。(K（K）)拉格牌手表−/−小鼠皮下注射2×106R-PD-L1表达肿瘤细胞，然后在移植后第2、5、8和11天用PD-L1抗体（αPD-L1）治疗。在第12天测量细胞外葡萄糖。点代表单个小鼠；水平条表示两个独立实验的平均值±SEM*第页=0.0319. 图5D，H（H）、和图S4D、G由于糖酵解酶的大小相似，需要进行单独的探测，因此包含来自相同负载车道的单独斑点。另请参阅图S4。

我们用抗PD-L1治疗P肿瘤细胞，并观察到mTOR靶蛋白磷酸化降低(图5C,S4C系列)与ECAR降低相关。鉴于mTOR直接调节mRNA翻译和核糖体生物生成(拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年)，我们分析了PD-L1阻断后几种糖酵解酶的蛋白表达。我们还评估了Akt磷酸化，因为生长因子通过Akt向mTOR发出信号。抗PD-L1治疗后糖酵解酶的表达和Akt磷酸化降低(图5D,S4D系列). 与mTOR通过调节翻译影响糖酵解的想法一致，抗PD-L1治疗后关键糖酵化基因的转录水平没有差异(图S4E). 这些数据表明，PD-L1调节Akt/mTOR通路，这导致糖酵解酶翻译减少，从而抑制糖酵化。

我们想确定PD-L1阻断是如何抑制我们在体外该系统缺乏T细胞表达的PD-1。我们推断PD-L1抗体可能导致PD-L1内化并导致下游事件停止。在37°C下用抗PD-L1药物治疗30分钟后，PD-L1从细胞表面移动到细胞内部，表明细胞内吞(图5E,S4F系列). 这些结果表明，表面表达的PD-L1对肿瘤中的Akt/mTOR信号传导很重要。

为了证实PD-L1调节糖酵解，我们用表达针对PD-L1（PD-L1 hp）的短发夹（hp）RNA的逆转录病毒转导P肿瘤细胞，以降低PD-L1的表达。与带有控制发夹（Ctrl-hp）的细胞相比，这些肿瘤细胞的ECAR、mTOR通路和Akt活性以及糖酵解酶表达降低(图5F–H,第4页). 此外，P肿瘤表达的PD-L1高于R肿瘤(图5I，上部），这与较高的ECAR相关(图1D、G)，葡萄糖摄取(图1B、J)和糖酵解。随着ECAR的降低，PD-L1 shRNA也降低了PD-L1的表达(图5I，更低），但不影响细胞增殖在体外(图S4H)移植到RAG中也不影响肿瘤生长−/−老鼠(图S4I)这表明PD-L1和糖酵解途径都不一定与肿瘤细胞增殖相关。为了进一步验证肿瘤上PD-L1的表达调节糖酵解，我们使用逆转录病毒转导产生表达不同PD-L1水平（高和低）的R肿瘤克隆。PD-L1高表达的R肿瘤比PD-L1低表达的肿瘤具有更大的ECAR(图5J). 我们的数据表明，肿瘤细胞上PD-L1的表达与其糖酵解速率直接相关。

我们的结果表明PD-L1具有免疫调节作用，不仅因为它通过PD-1向T细胞传递负信号(Keir等人，2008年;Spranger等人，2014年)也因为它能增强肿瘤细胞的糖酵解，从而耗尽肿瘤微环境中免疫细胞的葡萄糖。为了进一步支持PD-L1可以独立于适应性免疫系统调节肿瘤细胞代谢的观点，我们将表达PD-L1的肿瘤移植到RAG中−/−小鼠，并用PD-L1阻断或同种抗体治疗。与同种治疗小鼠相比，从接受抗PD-L1抗体的小鼠分离的切除肿瘤细胞外环境中的葡萄糖水平较高(图5K). 重要的是，抗PD-L1治疗RAG中PD-L1表达肿瘤−/−小鼠对缩小肿瘤大小的作用很小(数据未显示)，支持在免疫活性小鼠中，T细胞介导的肿瘤清除是至关重要的(Gubin等人，2014年;Matsushita等人，2012年). 我们的结果表明，肿瘤细胞表面PD-L1的表达维持了Akt/mTOR信号，这反过来支持糖酵解酶的翻译并促进这一代谢途径。我们的数据进一步表明，PD-L1阻断治疗抑制肿瘤中的糖酵解，在细胞外肿瘤环境中留下更多可用的葡萄糖。

讨论

T细胞的抗原识别对肿瘤清除至关重要，更强的抗原会导致更强的激活(Lanzavecchia和Sallusto，2002年;Rao等人，2010年)以及更大的营养竞争能力。T细胞必须获得足够的营养以参与支持其功能的新陈代谢。我们(Chang等人，2013年;O'Sullivan和Pearce，2015年;Pearce等人，2013年)、和其他(梅勒和穆恩，2008年;Mockler等人，2014年;Srivastava等人，2010年)，推测肿瘤微环境中的营养竞争体内影响T细胞功能。我们在这里表明，尽管存在T细胞识别的强健肿瘤抗原，但肿瘤可以通过竞争葡萄糖来抑制TIL功能，这表明代谢竞争作为一种独特的机制，可以导致T细胞低反应性。虽然我们在研究中只直接涉及葡萄糖，但这种资源竞争模型可能超出了葡萄糖。氨基酸、脂肪酸、其他代谢物的可用性，以及生长因子、其他细胞类型和协同刺激信号的存在，这些信号指示T细胞是否会表达适当的转运体以获得营养，都将影响肿瘤中T细胞的功能。我们关注TIL产生IFN-γ，然而，在许多免疫细胞类型中，多种效应器功能可能在葡萄糖缺乏的环境中受到抑制。

肿瘤中的营养竞争决定了免疫细胞在该环境中的表现能力，这是有道理的。T细胞在淋巴组织中启动，淋巴组织很可能是营养充足的，并向炎症部位流动，在那里它们必须与其他细胞竞争资源。在那里，他们可能会经历营养剥夺，这会损害他们的功能，但不一定会影响他们的生存，从而导致低反应性和癌症进展。研究表明，特定于P肿瘤抗原的TIL在检查点阻断前浸润P肉瘤，但这些细胞直到治疗后才产生IFN-γ(Gubin等人，2014年)这表明，即使抗原被识别，微环境中的条件也会抑制T细胞的功能。这种观点与T细胞激活和协同刺激重塑新陈代谢的观点一致，赋予细胞能够有效竞争营养物质的特征，例如谷氨酸1表达(Jacobs等人，2008年). CD28信号传导——防止T细胞无能的过程——起到增加葡萄糖摄取的作用，这并非巧合(Frauworth等人，2002年). Tregs和M2巨噬细胞都不需要有氧糖酵解，而是使用脂肪酸氧化(Huang等人，2014年;Michalek等人，2011年;Vats等人，2006年)，可能经常出现在进展中的肿瘤中，因为它们可能在低血糖环境中存活。这也与M1巨噬细胞和效应T细胞的观察结果一致，这两种细胞都利用糖酵解功能(Pearce等人，2013年)，出现在退化的肿瘤中，这可能是相对多糖的。

我们的数据表明，后生动物中稳定调节的葡萄糖可以限制肿瘤微环境中T细胞的生长。我们证明，肿瘤之间葡萄糖获取的差异并不一定与增殖差异有关。很有意思的是，肿瘤会选择增强葡萄糖获取，甚至糖原储存(Favaro等人，2012年)剥夺T细胞的葡萄糖，从而降低抗肿瘤反应的有效性。我们对包括基本营养素在内的资源竞争是如何在特定的生态位中动态调节的，以及这如何导致细胞功能变化的理解才刚刚开始。

T细胞需要有氧糖酵解才能达到完全效应状态，这是由双功能酶GAPDH调节的(Chang等人，2013年). 当葡萄糖存在时，GAPDH参与其酶功能；当细胞受到葡萄糖限制时，GAPDH可以结合IFN-γmRNA的3′UTR，阻止其有效翻译。当T细胞的葡萄糖限制时间较短时，细胞因子的产生可以通过重新引入葡萄糖来挽救，因为GAPDH将重新参与糖酵解。然而，我们的初步观察表明，如果T细胞经历长期的营养剥夺，受到抑制的细胞因子生成将变得相对不可逆转，从而导致更持久的功能障碍，而这种功能障碍无法通过简单的再暴露于营养物质来纠正。在已建立的肿瘤中升高葡萄糖的策略可能不一定能逆转TIL的低反应性。例如，如果TIL没有维持谷氨酸1的表达，则TIL可能无法对葡萄糖作出反应。此外，如果肿瘤和TIL之间的代谢平衡在葡萄糖暴露前不受影响，有利于T细胞，那么即使存在更多可用的葡萄糖，肿瘤也可能继续竞争T细胞(O'Sullivan和Pearce，2015年). 我们目前的研究旨在了解代谢限制体内可导致T细胞长期低反应性。

我们设想，癌症和感染中所描述的各种T细胞低反应性状态可能是由最初的代谢限制引起的。这可能表现为T细胞缺乏葡萄糖、任何信号或缺乏信号，从而丧失其获取葡萄糖的能力。如果这个模型是正确的，那么可能只有一个狭窄的时间窗口，在此期间肿瘤中已经存在的T细胞可以被靶向恢复功能。旨在耗尽肿瘤中促肿瘤免疫细胞的策略，再加上那些促进新浸润T细胞糖酵解的策略，可能是代谢重建肿瘤微环境的最有效方法。这可以解释为什么联合针对CTLA-4的检查点阻断疗法会耗尽肿瘤Treg细胞(Simpson等人，2013年)对于PD-1，尤其有效(Hamid等人，2013年;Wolchok等人，2013年).

我们的数据表明，影响葡萄糖代谢的检查点阻断抗体可能对糖酵解率较高的肿瘤最有效。很可能，更多依赖氧磷并使用不同底物作为燃料的肿瘤可能不会使葡萄糖微环境饥饿，因此受这些疗法的影响较小。这些结果可以解释为什么这些疗法对一些患者无效。我们正在研究肿瘤的糖酵解速率是否可以作为判断这些治疗疗效的预后工具。

我们发现PD-L1调节肿瘤代谢是偶然的。虽然PD-L1已知通过PD-1抑制T细胞，但尚不清楚它是否对肿瘤具有额外的生物学优势(Carlsson和Issazadeh-Navikas，2014年). 与我们发现的PD-L1具有T细胞非依赖性功能一致，研究表明神经元可以抑制星形细胞瘤细胞的增殖(Hatten和Shelanski，1988年)小鼠胶质母细胞瘤细胞的杀伤依赖于神经元PD-L1的表达和活性(Issazadeh-Navikas，2013年;金威尔，2013). 这些事件发生的确切机制尚不清楚，然而PD-L1可能赋予一种细胞类型（如神经元）更高的糖酵解，这使它们能够耗尽另一种细胞类型（如癌细胞）的葡萄糖，并随后导致另一种细胞类型（如癌细胞）的存活率下降。

PD-L1的30个氨基酸胞质尾部高度保守，这表明其具有功能意义(Francisco等人，2010年;Keir等人，2008年). 我们的数据表明，PD-L1 shRNA-介导的敲除现象与PD-L1阻断抗体复制了我们的结果，该抗体通过受体内化降低了表面PD-L1的表达。目前正在进行实验，以确定表面PD-L1如何向Akt和mTOR发出信号，以及哪些蛋白质可能参与这一过程。可以想象，PD-L1的细胞质尾部直接磷酸化，并与其他传递信息给mTOR的蛋白质相互作用。同样，PD-L1也可能位于促进其与其他信号蛋白关联的细胞膜域中。这不一定依赖于细胞质结构域固有的任何信号传递能力，而是辅助蛋白可以向mTOR发出信号。我们设想，如果PD-L1没有在表面表达，那么它与膜中其他蛋白质的结合就会不稳定，并且mTOR的信号传递也会减弱。需要更多的工作来准确确定PD-L1是如何发出信号的。

总之，我们已经证明肿瘤和T细胞之间的葡萄糖竞争可以直接影响癌症的进展，并发现PD-L1在调节肿瘤细胞代谢中具有意想不到的作用。针对癌症的新努力应该包含这样一个观点，即肿瘤中会发生代谢竞争，这会影响肿瘤的进展。未来的治疗可能会考虑将抑制肿瘤代谢的治疗与增强TIL营养素获取的治疗结合起来，以促进最佳抗肿瘤免疫。

实验程序

小鼠和肿瘤移植

所有实验均使用塔科尼农场的129S6小鼠和杰克逊实验室的C57BL/6小鼠。除非另有说明，否则为1–2×106将R或P肿瘤细胞皮下注射到小鼠右侧。移植后第12天（第10天至第13天）从小鼠身上切除肉瘤。分离的肿瘤在37°C下用IA型胶原酶和DNase I切割和消化。

体内检查点阻断治疗

在肿瘤移植后第3、6和9天，给荷瘤小鼠腹腔注射200μgαCTLA4（9H10）或αPD-1（RMP1-14）或αPD-L1（10F.9G2）或同种对照抗体。

代谢测定

OCR和ECAR在XF96细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）上进行分析。将细胞置于含有25 mM葡萄糖的非缓冲RPMI 1640培养基中。在基础条件下和添加1μM寡霉素（最大糖酵解能力）后进行测量。

转导

在含有8μg/ml Polybrene（Sigma）和20 mM HEPES（Hyclone）的培养基中，用表达抗荧光素酶shRNA（Ctrl-hp）或抗CD274 shRNA（PD-L1 hp）的GFP-reporting病毒转导肿瘤细胞5小时，然后用相同的病毒进行额外转导过夜。通过GFP表达对转导的肿瘤细胞进行分类。用表达c-Myc、PDK1、Glut1或HK2的逆转录病毒或空载体转导R肿瘤细胞。

葡萄糖测定

上清液中的葡萄糖浓度由葡萄糖检测试剂盒（Eton Bioscience）测量。对于体外对采集的肿瘤进行称重，并将其切成固定量的PBS。根据肿瘤重量和采集上清液的体积量化葡萄糖浓度，并根据R肿瘤中的葡萄糖浓度进行标准化。

统计分析

使用未配对的双尾Student’st吨-测试。两组以上的比较使用单向方差分析进行计算，然后进行Bonferroni的多重比较检验。

补充材料

1

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2

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三

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致谢

我们感谢A.Shaw、C.Hsieh、H.Christofk、J.Cyster、Y.Feng、B.Edelson J.Lin、J.Hu、H.Yu、M.Colonna、A.Fuchs、G.Randolph和L.Huang。C.C.、J.Q.、D.O.、M.D.B.、T.N.、G.J.W.W.、R.D.S.、E.J.P.和E.L.P.设计了这项研究。C.C.、J.Q.、D.O.、M.D.B.、T.N.、J.D.C.、M.G.、Q.C.、M.M.G.，E.T.和E.L.P.进行了实验并分析了数据。C.C.、J.Q.、D.O.、M.D.B.、R.D.S.、E.J.P.和E.L.P.准备了手稿。

这项工作得到了NIH（CA181125，AI091965，E.L.P.；CA43059，CA141541，R.D.S.；CA164062，AI032573，E.J.P.）、Burroughs Wellcome基金会传染病发病机制研究者（E.L.P.）、CRI、WWWW基金会和BMS（R.D.S）、Irvington Fellowship（M.M.G.）、，和NSF研究生奖学金DGE-1143954（M.D.B.）。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。在以最终可引用的形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。

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