两种互补的人巨细胞病毒BECN1/Beclin 1结合蛋白抑制自噬作用的分析

IRS1和TRS1独立于EIF2AK2抑制自噬

为了研究这两种蛋白抑制自噬的机制，我们研究了双链RNA依赖性激酶EIF2AK2的作用。事实上，我们最近发现了一种由HSV-1编码的病毒蛋白，它通过与EIF2AK2的相互作用来阻止自噬。²⁰此外，TRS1和IRS1与dsRNA和EIF2AK2结合，防止蛋白质合成被阻断。^14-16为了探讨EIF2AK2与病毒蛋白之间的相互作用是否参与抑制自噬，我们对具有或缺乏EIF2AK1的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行了检测。我们暂时共同感染了Eif2ak2型^+/+和eif2ak2型^−/−带有GFP-LC3和IRS1或TRS1表达载体的MEF随后通过饥饿诱导自噬。与我们之前对TRS1的分析一致，我们观察到IRS1和TRS1都减少了自噬体的数量，与EIF2AK2的表达无关(图2A和B).⁸我们还通过免疫印迹试验监测了SQSTM1的积累Eif2ak2型^+/+和eif2ak2型^−/−正常条件下和饥饿后的MEFs(图2C). 我们观察到，TRS1或IRS1的表达可诱导两种细胞系中SQSTM1的积累。这些结果表明，IRS1和TRS1一样，独立于EIF2AK2阻断自噬。

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图2。

IRS1和TRS1独立于EIF2AK2抑制自噬。（A和B）eif2ak2型^−/−和Eif2ak2型^+/+MEF与GFP-LC3和IRS1或TRS1共转染，48h后在饥饿培养基中培养4h后固定。（A） GFP-LC3的代表性图像，带有显示TRS1或IRS1表达的插图（红色），以及（B）每个细胞的GFP-LC3dots量化。（C） 细胞裂解物中SQSTM1蛋白的免疫印迹分析eif2ak2型^−/−和Eif2ak2型^+/+转染IRS1或TRS1质粒的MEF。（D） 全长和截短IRS1表达质粒的示意图，显示dsRNA-结合域（氨基酸74至248）和EIF2AK2结合域（胺基酸669至692）的位置。（E） 转染所示IRS1构建物的GFP-LC3 HeLa细胞的代表性图像，然后饥饿4小时，（F）量化GFP-LC3dots。（G） 用所示IRS1构建物转染HeLa细胞中SQSTM1和LC3蛋白的免疫印迹分析。CM，完全培养基。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001（单向方差分析）。

IRS1包含一个位于C末端结构域的EIF2AK2结合结构域（其基本成分位于氨基酸669和692之间）。¹⁶我们瞬时转染HeLa细胞，稳定表达GFP-LC3，IRS1全长或C末端截短(图2D). 我们观察到IRS1的截断形式阻碍了LC3点的积累(图2E和F). 我们还通过免疫印迹观察到，在转染不同IRS1结构的HeLa细胞中，SQSTM1积累，LC3-II减少(图2G). 综上所述，我们的结果表明，所有C末端截短的IRS1蛋白都抑制饥饿诱导的自噬(图2E至G). 值得注意的是，IRS1在密码子655和692之间的区域对于EIF2AK2结合是必不可少的，对于自噬抑制是不需要的。我们用TRS1得到了类似的结果。⁸

IRS1和TRS1通过其N末端结构域与BECN1的相互作用抑制自噬

发现IRS1和TRS1的EIF2AK2结合域对其抑制作用是不必要的，我们测试了自噬机制蛋白BECN1是否参与，因为有几种病毒蛋白与之相互作用。BECN1是酵母Vps30/Atg6的哺乳动物同源基因，以及PIK3C3（酵母Vps34的哺乳动物同源蛋白），它是III类磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）的催化亚单位，与其他核心自噬蛋白形成几个复合物，这些复合物是启动自噬体形成和内吞运输所必需的。²¹BECN1的活性受到多种细胞刺激的调节，导致磷酸化和泛素化修饰或BECN1重定位或通过蛋白质相互作用。²¹例如，抗凋亡BCL2家族成员可以与BECN1相互作用并抑制自噬。²²我们用共焦显微镜分析了感染HCMV 24小时的MRC5细胞中2种病毒蛋白和BECN1的分布。IRS1和TRS1的染色模式在细胞质中广泛分布，BECN1在点状结构中被标记(图3A). 重要的是，TRS1和IRS1与BECN1有很大的重叠。

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图3。

IRS1与BECN1相互作用并通过其N末端区域抑制自噬。（A） 共焦显微镜观察感染HCMV 24 h pi的MRC5细胞中IRS1和TRS1与BECN1的共聚焦。（B） 不同IRS1 N末端删除片段和BECN1删除片段的示意图。（C） 转染EGFP-His、不同结构的His-IRS1或全长His-TRS1的HeLa细胞中BECN1的免疫沉淀分析。（D） 在转染全长His-IRS1和不同BECN1结构的HeLa细胞中进行FLAG-BECN1免疫沉淀分析。（E） 用指示的IRS1构建物转染48小时的GFP-LC3 HeLa细胞中的GFP-LC3点进行定量。（F） 免疫印迹分析转染有指示结构的HeLa细胞中SQSTM1水平，然后在细胞溶解前在饥饿培养基中生长4小时。结果是3个实验的平均值；每次分析100个细胞。**，P（P）<0.01（单向方差分析）。

为了研究IRS1是否与BECN1相互作用，我们用6×His标记的IRS1和BECN1质粒进行了联合免疫沉淀实验。我们发现IRS1与BECN1绑定(图3C). 为了描述IRS1与BECN1相互作用的结构域，我们分析了IRS1氨基末端的2个截断，IRS1（45到847）和IRS1(图3B). 免疫共沉淀实验表明IRS1的2个氨基末端突变体没有与BECN1结合(图3C). EGFP-His作为阴性对照，全长IRS1和TRS1作为阳性对照。这些结果表明，IRS1的N-末端结构域的缺失消除了与BECN1的相互作用。BECN1包含3个主要的蛋白质结合域，一个N末端BH3（BCL2同源3）域、一个中心线圈域（CCD）和C末端的进化保守域。²¹使用不同的FLAG-BECN1片段(图3B)，我们确定了与IRS1相互作用的BECN1域。IP分析表明，（141至450）和（141到265）BECN1片段免疫沉淀IRS1，表明IRS1与BECN1的CCD结构域相互作用(图3D). （1至255）BECN1片段没有与IRS1相互作用，可能是因为N末端对截断CCD折叠的影响。

然后我们评估了IRS1氨基末端截断突变体抑制饥饿诱导的自噬的能力。用全长IRS1、TRS1或2个IRS1 N末端缺失片段瞬时转染稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞，并用免疫荧光分析GFP-LC3dots。TRS1作为阳性对照。我们观察到IRS1突变体（45-847）和（93-847）不能像全长IRS1或TRS1那样有效地抑制自噬(图3E). 我们还观察到，与全长IRS1或TRS1转染细胞相比，转染2个IRS1突变体的细胞中SQSTM1的细胞水平仅部分增加(图3F). 因此，IRS1抑制自噬需要其N末端。这些结果表明，IRS1和TRS1通过这个N末端结构域与BECN1相互作用，从而抑制自噬。

IRS1和TRS1均参与感染期间自噬的控制

为了研究IRS1和TRS1在病毒感染背景下自噬阻断中的作用，我们分析了缺乏IRS1或TRS1基因或两者都缺乏的HCMV突变株感染细胞的自噬(图4A和B). 如前所述，在HCMV感染的细胞中，我们观察到，^8,23自噬体数量显著减少。相反，与模拟感染细胞和HCMV感染细胞相比，感染缺乏IRS1和TRS1的突变HCMV（HCMV[ΔI-ΔT]）后，自噬体的数量显著增加。此外IRS1系统和TRS1型单个突变病毒都抑制了与HCMV[ΔI-ΔT]相关的自噬体形成，但不如野生型（WT）病毒强。SQSTM1的积累证实，尽管HCMV[ΔI-ΔT]显著刺激自噬，但WT HCMV阻断自噬并且2个单一突变病毒具有中间表型(图4C). 在氯喹（CQ）存在和不存在的情况下，可以通过western blot推断LC3-II的周转来测量自噬通量。CQ中和溶酶体pH值，并通过抑制内源性蛋白质降解导致LC3-II在自噬体或自溶体中积累。²⁴本试验中的相关参数是在CQ存在和不存在的情况下LC3-II的量比，可用于检查LC3-II通过自噬途径的转运。当发生自噬通量时，CQ存在时LC3-II的量较高图4DHCMV感染导致LC3-II在有CQ和无CQ的情况下都有类似的积累，而没有任何突变病毒能够做到这一点。我们之前报道过LC3-II的积累与自噬体的数量无关。^8,23这一结果表明，这两种病毒蛋白是抑制自噬流量所必需的。为了支持这一假设，我们发现IRS1和TRS1在HeLa细胞中的共转染明显导致LC3-II的积累和自噬通量的完全阻断(图4E). 综上所述，这些结果表明IRS1和TRS1均以互补的方式参与HCMV的自噬调节。

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图4。

IRS1和TRS1参与HCMV感染后自噬的抑制。（A） MRC5细胞在MOI为1时模拟感染或感染HCMV、ΔIRS1-ΔTRS1、△IRS1和ΔTRS2突变病毒，转染GFP-LC3，然后在24 h后固定。固定细胞并对pp65或IEA病毒蛋白进行免疫染色，如图所示（比例尺：10µm）。（B） 在pp65或IEA阳性细胞中定量GFP-LC3点。结果是6个独立实验的平均值。每次分析计数25个细胞。**，P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001（单向方差分析）。（C和D）模拟感染MRC5细胞或感染WT HCMV或指示突变病毒24小时后SQSTM1和LC3蛋白的免疫印迹分析。（E） 在细胞裂解前，对转染所示构建物24小时并在饥饿培养基中生长4小时的细胞中的LC3蛋白进行免疫印迹分析。在裂解前4小时添加（D和E）氯喹，以监测自噬流量。

BECN1-结合缺陷型TRS1突变病毒无法控制自噬

接下来，我们研究了HCMV感染背景下TRS1和IRS1与BECN1相互作用的功能意义。基于先前描述的BAC衍生HCMV株AD169，该株同时缺乏TRS1和IRS1，¹⁴我们构建了突变体病毒，在该病毒中，TRS1基因的HA标记版本被重新导入，缺失了1到44个氨基酸（称为TRS1（45–795）-ΔIRS1 HCMV）或完整基因(图5A). TRS1（45–795）-ΔIRS1 HCMV和TRS1HA-ΔIR S1 HCCV表达预测分子量（分别为80 kDa和85 kDa）的蛋白质，该蛋白质与抗TRS1和抗IRS1抗体反应(图5B). 虽然TRS1在TRS1HA-ΔIRS1 HCMV感染细胞中与BECN1共免疫沉淀，但TRS1（45-795）与BECNl之间的相互作用大大减少(图5C). 我们评估了这种BECN1结合缺陷型TRS1突变病毒控制自噬的能力，测量GFP-LC3点和SQSTM1和LC3免疫印迹的积累。我们观察到，与模拟感染细胞相比，感染TRS1（45–795）-ΔIRS1 HCMV并没有减少自噬体的数量，而修复病毒TRS1HA-ΔIR S1 HCCV部分抑制了自噬(图5D). 此外，与TRS1HA-ΔIRS1感染细胞相比，TRS1（45–795）-ΔIR S1感染的细胞积累更少的SQSTM1蛋白和更多的LC3-II(图5E). 添加CQ表明，只有亲代BAC衍生的AD169阻断了自噬通量，这与我们之前的结果一致(图4). 总之，这些结果表明BECN1结合缺陷-TRS1突变病毒不能抑制自噬。

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图5。

BECN1-结合缺陷型TRS1突变病毒不抑制自噬。（A） HA标记的TRS1重组病毒的示意图。（B） 通过免疫印迹法检测TRS1和IRS1的表达，用所示病毒感染后的细胞裂解物中的抗TRS1抗体和IRS1抗体进行检测。（C） 用TRS1（45–795）-ΔIRS1和TRS1HA-ΔIR S1重组病毒感染MRC5细胞48小时。用山羊抗BECN1抗体免疫沉淀细胞，然后用抗HA抗体和抗BECN 1免疫印迹。（D） MRC5细胞被指示的病毒感染，转染GFP-LC3，然后固定24h。通过计算每个细胞中GFP-LC3点的数量来量化IEA阳性细胞中的自噬。结果是3个独立实验的平均值。每次分析计数20个细胞。***，P（P）<0.001（单向方差分析）。（E） 在MOI 1感染指示病毒的MRC5细胞中SQSTM1和LC3水平的免疫印迹分析。ACTB被用作加载控制。CQ，氯喹。

含有TRS1突变的HCMV重组病毒可消除与BECN1的结合，且无生长缺陷

我们试图确定TRS1与BECN1的相互作用以及阻断自噬的能力对病毒复制是否重要。我们假设，由于IRS1和TRS1的BBD全部缺失而无法控制自噬的病毒复制效率会降低。因此，我们分析了不同突变病毒在人类成纤维细胞中的生长动力学(图6). 在低感染多重性感染的细胞中检测野生型（AD169-BAC）和缺失突变病毒的多步生长动力学，并测定病毒滴度。TRS1（45–795）-ΔIRS1重组病毒的滴度与TRS1HA-ΔIR S1和AD169-BAC相当(图6A). 当MRC5细胞感染HCMV[ΔI-ΔT]时，检测期间（20天）未检测到子代病毒，这与之前的报告一致。²⁵对于单步生长分析，在感染后的指定时间研究细胞外病毒和细胞内病毒的产生。²⁶感染后不同时间产生的感染性病毒量（pi）通过免疫酶法测定，在2 d pi时测定立即早期抗原（IEA）阳性细胞的数量（见材料和方法）。与野生型（AD169-BAC）相比，TRS1（45–795）-ΔIRS1突变病毒在第4天和第6天产生了类似数量的感染性细胞内和细胞外病毒(图6B). 这组实验表明，缺乏对自噬的控制不会对突变病毒造成生长不利。

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图6。

HCMV重组病毒的特征，该病毒包含TRS1中的一个突变，可消除与BECN1的结合。（A） 多步骤增长分析。在0.02的MOI下，MRC5细胞被指示的病毒感染。在指定时间pi采集培养物，并通过TCID50测定病毒滴度。结果代表3个独立实验的平均值。（B） 进行一步生长分析以检查细胞外病毒和细胞内病毒的产生。MRC5细胞在MOI 0.5下感染AD169-BAC（WT）、TRS1（45-795）-ΔIRS1或TRS1HA-ΔIRS1重组病毒。在指定时间pi（无细胞）采集受感染的细胞培养液，通过冷冻和解冻细胞颗粒（细胞相关）分离细胞内病毒。通过用这些样本感染MRC5细胞并计算IEA阳性细胞的数量来确定每个样本中存在的病毒量。结果表示两个独立实验的平均值。（C） 在1、2和5 d pi制备HCMV感染细胞的裂解液，并使用IEA特异性抗体、pIRS1和pTRS1特异性αp999抗血清和pp28特异性抗体进行免疫印迹。（D） 用所指示的病毒感染MRC5细胞后的病毒DNA基因组，2至4dπ。

HCMV以时间方式转录其基因，分为3个阶段：早期、早期和晚期。我们使用免疫印迹分析来监测感染各种病毒1、2或5天的细胞中即刻早期（IE1和IE2）蛋白、TRS1和IRS1蛋白以及晚期（pp28）蛋白的表达(图6C). 在感染任何病毒的细胞中，IE1和IE2蛋白在任何时间都以相同的水平表达。我们还检测到晚期蛋白pp28 5 d pi的类似表达。然后，我们检测了病毒基因组在不同时间点相对于细胞基因拷贝的积累(图6D). TRS1（45–795）-ΔIRS1突变病毒的病毒DNA积累水平与WT病毒相似。总之，这些结果表明，IRS1和TRS1自噬调节活性在促进病毒蛋白表达、病毒DNA复制、病毒在人成纤维细胞中的产生或释放方面没有直接作用。

自噬的药理学调节剂

化合物3MA（M9281）、Spautin 1（SML0440）、雷帕霉素（R8781）和MβCD（C4555）购自Sigma，所用浓度分别为10 mM、10µM、5 nM和5 mM。如有必要，将药物应用于培养的感染细胞18小时后。氯喹（Sigma，C6628）在细胞溶解前4小时在50µM下使用，以阻止自噬降解。

质粒

GFP-LC3表达载体由Tamotsu Yoshimori（日本大阪大阪大学微生物疾病研究所）善意提供。⁵⁴FLAG-ICP34.5质粒是Bin He（美国芝加哥伊利诺伊大学）赠送的。⁵⁵FLAG标记的BECN1质粒是Beth Levine（UT Southwestern，Dallas，USA）赠送的礼物。pEQ1180构建物表达全长HCMV TRS1蛋白cDNA。⁵⁶pEQ1100构建物表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）（5）。pEQ1007构建物包含全长HCMV IRS1蛋白cDNA和pEQ100 2（1至656）、pEQ1010（1至668）和pEQ 1033（1至692）构建物，包含指示长度的IRS1，已在前面描述过。¹⁶分别用正向引物5′ACCATGGGTGCAAGTACTGGGTTCG-3′或5′-ACCATGGTGA-GCGGCAGGCGCTGTG-3′对pEQ1007进行PCR扩增，构建质粒pEQ1455（45～847）和pEQ1486（93～847。¹⁶将所得PCR产物克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO（Invitrogen）中。所有这些结构都有一个羧基末端6-His标签。如前所述，使用FuGENE HD转染试剂（Roche）进行转染。⁸通过在厄尔平衡盐溶液（EBSS，GIBCO）中培养细胞4小时，在固定前进行饥饿诱导的自噬。

抗体

为了检测HCMV感染的细胞，我们使用了针对病毒蛋白IE1和IE2的鼠单克隆抗体（克隆E13；Biomérieux，11-003）和针对表皮蛋白pp65的鼠单抗（Biomé）。抗晚期蛋白pp28的小鼠单克隆抗体（克隆CH19，sc-69749）购自圣克鲁斯。为了检测His和FLAG标记的结构，我们使用了针对6xHis（细胞信号技术，2365）的兔抗体或针对FLAG的鼠抗体（Sigma，F3165）。本研究中使用的其他主要抗体包括抗SQSTM1（Abnova克隆2C11，H00008878-M01）、抗BECN1（BD bioscience，612112）、抗ATG16L1（Clinisciences，PM040）和抗ACTB/β-actin（Merck Millipore MAB1501克隆C4）。对于BECN1的免疫沉淀，我们使用圣克鲁斯生物技术公司提供的山羊抗体（sc-16647）。次级荧光素异硫氰酸盐（FITC）、四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）共轭辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔次级抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories（115-035-003111-035-003）。先前已经描述过针对TRS1的74到248个氨基酸的IRS1-TRS1兔多克隆抗血清αp999。¹⁴

协同免疫沉淀分析

为了研究BECN1与IRS1或TRS1之间的相互作用，将HeLa细胞转染到共表达BECN1，以及各种分子伴侣（EGFP-His、His-IRS1、His-TRS1、IRS1（45至847）和IRS1蛋白（93至847的））。为了确定BECN1与IRS1的相互作用域，用不同结构的FLAG-BECN1和His-IRS1共同转染HeLa细胞。为了研究TRS1与内源性BECN1在感染过程中的相互作用，MRC5细胞被突变病毒TRS1（45–795）-ΔIRS1或修复病毒TRS1HA-ΔIRS1感染。转染或感染后48小时，用冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS；Gibco®，14200–067）清洗细胞，然后在4°C的裂解缓冲液（50 mM Tris HCl，50 mM NaCl，0.5%Triton X-100（Sigma，T-8787）0.5%脱氧胆酸（SigmaD-6750），0.2%牛血清白蛋白（Sigma-A1595），25 mM NaPPi，50 mM NAF，1 mM Na_三VO（旁白）₄)然后以274000倍超速离心克在4℃下放置30分钟以清除细胞碎片。在4℃用山羊多克隆抗BECN1抗体或小鼠抗FLAG抗体进行免疫沉淀过夜。在4°C下添加蛋白G-Sepharose珠1 h，并用裂解缓冲液洗涤3次，用洗涤缓冲液洗涤2次（20 mM Tris HCl，50 mM NaCl，0.2%牛血清白蛋白）。免疫复合物最终在负载缓冲液（62.5 mM Tris，pH 6.8，10%甘油，1.5%十二烷基硫酸钠，0.025%溴酚蓝，8%β-巯基乙醇）中煮沸5 min，然后用SDS-PAGE进行分析。

免疫印迹分析

将MRC5和HeLa细胞溶于65mM Tris，pH 6.8，4%SDS，1.5%β-巯基乙醇中，并在100°C下保持5分钟。在SDS-PAGE后，将蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯膜上。根据制造商的说明（Immobilon，Millipore），在封闭缓冲液中孵育后，用特定抗体隔夜探测斑点，然后用二级抗体孵育，然后进行化学发光检测。使用ImageJ软件监测定量扫描。

免疫荧光分析

细胞单层用PBS洗涤3次，然后用3.5%多聚甲醛在PBS或丙酮中固定。使用0.2%Triton X-100在PBS中渗透细胞，并在封闭缓冲液中培养1 h，然后使用适当的一级抗体培养1 h或过夜。将细胞清洗3次，然后用适当的二级抗体孵育。为了检测IRS1或TRS1的表达，用小鼠抗His单克隆抗体或兔抗IRS1-TRS1血清对细胞进行染色。盖玻片安装在Glycergel（Dako，C0563），并使用尼康Eclipse 80i荧光显微镜（尼康仪器，法国马恩河畔香槟）或LSM510蔡司共焦显微镜（德国伊纳卡尔蔡司显微镜）进行检查。存储数字化图像，并覆盖以评估双色实验。使用Adobe Photoshop软件调整照片的大小、组织和标记。

通过高通量显微镜优化GFP-LC3点的自动定量

用空载体IRS1或TRS1转染GFP-LC3-HeLa细胞，饥饿4h后固定。使用Thermo Cellomics ArrayScan VTI HCS阅读器（美国宾夕法尼亚州匹兹堡市Thermo Fisher）对GFP-LC3点进行量化。分析程序检测到DAPI标记的细胞核、细胞轮廓、GFP-LC3点和未转染的排斥细胞。每个细胞的GFP-LC3点数量、每个细胞的总GFP-LC2点强度、每个细胞GFP-LC4点覆盖的总面积和每个孔GFP-LC5点覆盖的平均面积均由ID view软件确定。

病毒产生

对于多步骤生长分析，在感染后的指定时间以0.02的MOI采集感染细胞的上清液部分，并用50%的组织培养感染剂量（TCID）测定病毒滴度三次₅₀)化验。对于单步生长分析，在不同时间点pi从无细胞上清液组分和感染细胞中收集病毒，并如前所述进行量化。²⁶在液氮浴中通过3轮冷冻和解冻分离出细胞相关病毒。将病毒样品的系列稀释液涂布在MRC5细胞上。感染细胞固定48 h pi，并在−20°C的丙酮/水中渗透20 min。使用抗IEA的初级小鼠抗体（克隆E13）和与辣根过氧化物酶结合的次级山羊抗鼠抗体标记IEA阳性细胞，并在适当稀释度下对阳性细胞进行定量。为了测定感染细胞中的病毒DNA水平，在蛋白酶K存在下采集细胞并进行裂解，并根据制造商的说明使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒（Qiagen，69506）纯化总DNA。使用Taqman探针和针对UL123标准病毒基因，以及行动委员会或CXCR4系列细胞基因，如前所述。⁵⁷

慢病毒传递shRNA

稳定ATG16L1型并使用Patrice Codogno（法国巴黎INEM）善意提供的MISSION shRNA慢病毒生成扰乱的shRNA细胞。在含有嘌呤霉素的培养基（5µg/ml；InvivoGen anti-pr-1）中培养稳定细胞。