核膜（NE）由内外核膜、核孔复合体和核纤层组成，在核内部和细胞质之间提供了一个物理屏障，保护基因组免受细胞质成分的影响，并为DNA和RNA的合成和加工建立了一个单独的隔间(1). NE完整性和核孔选择性的丧失与正常衰老过程和多种人类疾病（包括癌症）有关(2). 在癌症进展过程中，肿瘤细胞侵袭的关键步骤取决于细胞核在三维组织中的可用空间的变形(三–6). 虽然迁移细胞的细胞质甚至可以穿透亚微米大小的孔隙，但大而相对坚硬的细胞核的变形成为通过小于25µm的孔隙迁移的速率限制因素2横截面(4,6–10). 我们假设，通过这种狭小空间的迁移对原子核的完整性构成了实质性的机械挑战。因此，我们研究了细胞通过限制空间的迁移是否诱导NE断裂并损害DNA完整性，以及细胞如何在间期修复这种NE断裂。
为了通过精确控制细胞限制来模拟癌细胞侵袭，我们设计了一种微流体设备，该设备包含模仿间隙孔径的固定高度和不同宽度的收缩(图S1A–B)(11). 我们使用先前建立的荧光报告物检测NE破裂，该荧光报告物由绿色或红色荧光蛋白组成，与核定位序列（分别为NLS-GFP和NLS-RFP）融合，当NE完整性丧失时，这些荧光蛋白迅速逃逸到细胞质中(12–14). 乳腺癌、纤维肉瘤和人类皮肤成纤维细胞表现出短暂的NE完整性丧失，与细胞核通过收缩相一致(,S1C–L；电影S1). NE破裂与荧光标记的细胞质蛋白瞬间流入细胞核有关(图S2)也可以通过荧光标记的DNA-结合蛋白屏障-自动整合因子（BAF）的积累来检测(15)和环GMP-AMP合成酶（cGAS）(16)NE断裂位置(图S3).
通过封闭环境迁移期间的核破裂(A类)MDA-MB-231乳腺癌细胞在移动2×5µm时出现多处NE破裂的图像序列2收缩。另请参见电影S1。在这里和所有其他图中，框下面的红色箭头和线条表示东北向断裂的开始和持续时间。比例尺：20µm(B类)（A）中细胞核和细胞质NLS-GFP的荧光强度，显示NE破裂时核信号丢失，细胞质荧光随之增加，随后NLS-GFP逐渐重新导入细胞核。R1–3表示NE破裂事件。(C类)在HT1080纤维肉瘤细胞中NE破裂，该细胞共表达NLS-GFP和荧光标记组蛋白（H2B-RFP），在胶原基质（2.5 mg/mL）中迁移，MMP抑制剂GM6001。另请参见电影S2插图：核泡形成特写（红色箭头）。白色箭头表示最小核直径。比例尺：10µm；2µm（插图）。(D类)（C）中细胞的最小核直径和核质NLS-GFP荧光强度。(E类)破裂和非破裂HT1080电池的最小核直径。***，第页< 0.001;n个分别为159和62个单元。(F类)NE破裂的发生率是胶原基质收缩大小的函数（斜率=–1.224；R（右）2=0.999）和微流控设备在≈12小时内（斜率=–1.219；R（右）2= 0.974). 基于HT1080和MDA-MB-231细胞的回归分析；n个=每个条件55–445个单元格。(G、 H（H）)HT1080纤维肉瘤细胞植入小鼠真皮5天后的多光子图像。虚线框表示NE破裂和核泡（箭头）的细胞，如（H）所示。二次谐波法检测胶原纤维；AlexaFluor-750显示的血管，标记为70 kDa-dextran。比例尺：20µm。(我)同一视野中破裂（红/黑）和非破裂（灰）细胞中细胞质（红）和总（黑/灰）NLS-GFP信号的荧光强度。(J)NE破裂的发生率作为迁移模式的函数。**，第页<0.01 vs.细股和粗股；n个=22–211个单元。误差线：平均值±标准误差。
然后，我们测试了NE断裂是否也发生在生物环境中的癌细胞迁移过程中。纤维肉瘤细胞和皮肤成纤维细胞在纤维胶原基质中迁移时出现NE断裂(,S4；电影S2)与收缩通道中记录的动力学相似(图S1M). NE破裂通常发生在最小核直径时，这与细胞遇到的孔径非常匹配(6)，降至3µm()从而将NE破裂与细胞通过狭窄空间的运动联系起来。因此，在玻璃上、低密度胶原基质中或通过15×5µm2-宽通道，与先前报道的癌细胞系中自发NE破裂率一致(13). 然而，当基质孔径减小到5–20µm以下时2通过增加胶原蛋白浓度和/或通过添加基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂阻断细胞分裂胶原蛋白纤维和扩孔的能力，NE破裂的发生率增加了10倍甚至更多(S5A-B系列). 同样，将微流体通道的孔径减小到20µm以下2东北方向断裂增加10倍以上(S5C–D系列). 不考虑实验模型，NE破裂的发生率随着孔径的减小呈指数增加()当核高度限制在3µm时达到90%以上(图S5E). 原位植入后，HT1080纤维肉瘤细胞侵入活体肿瘤中富含胶原蛋白的小鼠真皮的成像证实，迁移诱导的NE断裂也发生在体内，特别是在单独传播的细胞中(,S6系列；电影S3). NE断裂在作为多细胞集合链运动的细胞中不太常见(,S6系列)通常遵循阻力最小的线性轨道，核变形不太明显(三,7).
体外和体内NE破裂通常伴随着染色质通过核膜突起(,S7A-I；电影S4–5). 这种“染色质突出”的发生率随着孔径的减小而显著增加(,S7H系列). 在严重的病例中，当细胞通过狭窄的收缩时，小片细胞核从原核中被掐断(;电影S6)导致细胞核碎裂的细胞比例升高且持续存在(,S7J公司). 此外，经过微流体收缩的细胞有更多的核碎片对γ-H2AX呈阳性反应，γ-H2AX是DNA双链断裂的标志(17)比尚未进入收缩区的细胞()与最近的报告一致，微核中NE完整性的丧失可能导致DNA损伤(14)和显色菌(18). 染色质突起处也可见强烈的γ-H2AX染色(图S8A). 为了证实DNA损伤是由迁移诱导的核变形和NE断裂引起的，我们对同时表达NLS-GFP和荧光标记53BP1（RFP-53BP1）的细胞进行了活细胞成像，53BP1是另一种DNA损伤标记物(19,20). NE破裂，甚至仅仅是严重的核变形，都导致了新的RFP-53BP1病灶的快速形成，因为细胞被挤压过收缩(,S8B–G型)与先前报道的压缩诱发染色质疝和NE断裂后DNA损伤反应基因激活增加一致(21).
限制性迁移导致染色质突起、核碎裂和DNA损伤(A类)共表达GFP-lamin-C和H2B-RFP的MDA-MB-231细胞在通过微流体收缩迁移过程中出现染色质突起（箭头）的典型图像。比例尺：5µm。(B类)胶原基质中的HT1080细胞（2.5 mg/mL+GM6001），核膜上有染色质突起（箭头），染色层蛋白a/C（绿色）、DNA（红色）和F-actin（绿松石色）。比例尺：10µm，2µm（底部插图）。(C类)染色质突起的细胞百分比与胶原基质孔径的关系。2D，玻璃载玻片上的无限制迁移。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.0001;n个=每种情况50–146个细胞。(D类)共表达NLS-GFP（绿色）和H2B-RFP（红色）的MDA-MB-231乳腺癌细胞在连续2×5µm迁移过程中形成染色质填充的核膜泡（白色箭头）和随后的核碎裂的代表性图像序列2收缩。插图用虚线表示。另请参见电影S6. (E类)进入收缩通道前、通道内和退出后细胞核破碎的细胞百分比。***，第页< 0.001;n个分别为9775、1376和3072。(F类)完整的核（左上）、带有小碎片（箭头）的核（中左）和带有γ-H2AX阳性碎片的核（右下）的示例。比例尺：10µm。在通过收缩通道迁移之前、内部和之后，具有γ-H2AX阳性核片段的细胞的百分比（右）。***，第页< 0.001;n个=每个条件下1376–3072个细胞。(G公司)HT1080细胞迁移通过2×5µm的百分比2或1×5µm2收缩形成53BP1-RFP病灶，作为核破裂的功能。**，第页<0.01n个=总共35个单元格。(H（H）)迁移至2×5µm期间，在共表达NLS-GFP和53BP1-RFP的U2OS细胞中形成53BP1病灶（箭头）的典型示例2收缩和NE破裂。比例尺：10µm。图中误差线：平均值±标准偏差。
为了进一步了解NE破裂背后的生物物理过程，我们分析了NE破裂的时间和位置，包括核变形、局部膜曲率、NE成分和细胞骨架力。NE破裂主要发生在细胞核前缘（≈76%）()几乎总是（89.9±2.14%，n个=198个细胞）在细胞核通过收缩运动时，先于或同时形成核膜突起（“束”）(,;第9部分). 典型的核膜泡（96.1±1.38%，n个=178个气泡）形成于核层信号，特别是层粘连B1网络较弱或缺失的部位(,S10A–B级). 这些发现表明，当核膜片断从核膜上脱落并隆起进入细胞质时，就会形成水泡。层粘蛋白A/C和层粘蛋白B2的耗尽显著增加了NE破裂的可能性(,S10C型)，与之前的研究一起(4,12,13,21–23)表明层粘连蛋白对稳定NE很重要。
核破裂的分子序列(A类)NE破裂时，核膜泡形成（箭头）并塌陷。比例尺：10微米（顶行和底行），5微米（插入）。(B类)NE破裂点沿核周缘的分布。区域基于迁移方向（黑色箭头），并在动画中表示。n个=352个单元格；*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001; 所有比较均相对于假设的33%的均匀分布。(C类)随后NE破裂期间核泡形成（箭头）和塌陷的Kymograph，对应于. (D类)核膜泡形成于低GFP-层粘连蛋白B1强度的部位，并且没有GFP-蛋白B1（箭头）。沿蓝线的强度在图E中定量。观察到178个细胞中的代表性细胞。(E类)GFP层粘连蛋白B1荧光强度谱。灰色区域表示核泡形成的区域。***，第页< 0.0001; 比较灰色区域内外的值。(F类)含有可检测到的层粘连蛋白A、B1、B2的核泡百分比。***，第页< 0.001; 与原核100%的预期值相比；n个=每种条件178–199个细胞。(G公司)针对层粘蛋白A/C、层粘蛋白B2或非靶向（NT）对照进行siRNA治疗后NE破裂的发生率。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001;n个=384、150和163个细胞，收缩≤2×5µm2;n个=166、68和49（对于15×5µm）2收缩。(H（H）)Blebbistatin治疗可降低收缩通道迁移过程中NE破裂的发生率，但在15×5µm2控制通道。*，第页< 0.05;n个=286和194，收缩≤2×5µm2;n个=122，对于15×5µm的电池为542收缩。(我)GFP-层粘连蛋白A在NE破裂部位积聚，形成“层粘连疤痕”（箭头）。图像下方的灰色条对应于（J）中不同时间的线条轮廓。比例尺：10µm。(J)GFP-lamin沿着核边缘一段区域的信号强度（面板I中的蓝线）。(K（K）)GFP-层粘连蛋白A的积累随着NE破裂的严重程度而增加。第页< 0.0001;n个=46个单元格（斜率=1.345，R（右）2= 0.3945). 图中误差线：平均值±标准偏差。
与之前的观察结果一致(13,21,22,24,25)，扩张的核泡缺乏GFP层粘连蛋白B1()和核孔(图S10D)最初几乎不含GFP-层蛋白A和B2(图S10A-B). NE破裂后，气泡收缩并塌陷(,,S9、S10E–H)这表明静水压力是从充满液体的气泡中释放出来的。尽管NE含有孔隙，但最近的研究表明，NE可以提供有效的屏障来支持细胞内压力梯度(26,27). 细胞核加压可能是由细胞核后部的肌动蛋白收缩引起的，肌动蛋白收缩是使细胞核穿过狭窄空间所必需的(5,6)，有效模拟细胞压缩实验(21,22). 支持这一观点的是，用低浓度的布利司他丁（一种肌球蛋白II抑制剂）治疗，显著降低了核破裂的发生率()不抑制细胞通过更大通道迁移的能力(图S10I)
NE破裂的短暂性表明，细胞可以在间期有效地恢复核膜的完整性。我们观察到GFP-层粘连蛋白A在破裂部位快速（<2分钟）积聚，这与核破裂的严重程度相关，并且通常持续数小时(,第11节). 同一细胞内随后的破裂发生在不同的部位(图S11A)意味着这些“层粘连疤痕”可以起到局部保护作用。最近的两份报告证实，ESCRT家族成员在后期参与了核膜的重新密封(28,29). 为了评估ESCRT蛋白在NE间期修复中是否具有类似功能，我们构建了ESCRT-III亚单位CHMP4B的GFP融合结构，该亚单位参与招募其他ESCRT-IIII蛋白并促进膜断裂，以及ESCRT-III-相关AAA-ATPase VPS4B，这是ESCRT-III蛋白分解和再循环所必需的(30). 受限迁移或激光烧蚀导致NE破裂后，CHMP4B-GFP和VPS4B-GFP在核膜损伤部位迅速（≤2 min）形成短暂病灶(,S12、S13A–C；电影S7). 超分辨显微镜证实内源性ESCRT-III蛋白向NE断裂部位募集，形成大小≤160 nm的复合物(,S13D–高). ESCRT-III机械的招募独立于微管(图S14). 耗尽ESCRT-III亚单位CHMP2A、CHMP7，或显性阴性VPS4B突变体（GFP-VPS4B）的异位表达第235页)阻止ESCRT-III亚单位再循环，显著增加了核-细胞质重组所需的时间(,S13I–编号)表明ESCRT-III蛋白在恢复核膜完整性中起着关键作用。为了评估NE修复的功能相关性，我们量化了NE破裂后的细胞存活率。在正常情况下，绝大多数（>90%）的细胞存活下来，即使是重复的NE破裂(,S4A系列). 仅抑制ESCRT-III介导的去甲肾上腺素修复或DNA损伤修复途径并不会降低细胞活力，但抑制去甲肾上腺素和DNA修复都会显著增加去甲肾上腺素破裂后的细胞死亡().
ESCRT-III介导核膜修复(A类)CHMP4B-GFP被短暂招募到核膜损伤部位（箭头）。另请参见电影S7虚线框表示用于（B）中测量的区域。总共12个HT1080细胞的代表性序列。比例尺：10µm。(B类)破裂部位CHMP4B-GFP荧光强度（黑色）归一化为破裂前强度，NE破裂后增加，表现为细胞质RFP-NLS信号增加（灰色）。红色箭头表示NE破裂的时间。(C类)VPS4B-GFP在MDA-MB-231细胞NE破裂部位（箭头）的募集。虚线框表示（D）中用于测量的区域。共有18个单元格的代表性示例。比例尺：10µm。(D类)NE断裂后细胞质（黑色）中的VPS4B-GFP荧光强度迅速增加，通过细胞质RFP-NLS信号（灰色）的增加检测到。红色箭头表示NE破裂的时间。(E类)NE破裂部位内源性CHMP4B积聚的代表性超分辨率图像（共12个细胞）。拉明A/C堆积证实了破裂部位（红色箭头）。蓝色箭头表示气泡底部的层粘连B强度降低。比例尺：5µm和1µm（插入）。(F类)与非靶向（NT）对照组相比，siRNA介导的HT1080细胞中ESCRT-III蛋白CHMP7和CHMP2A的缺失导致迁移诱导NE破裂后细胞质中NLS-GFP的持续时间增加，第页< 0.001;n个分别为137和107。(G公司)显性阴性突变体VPS4B的表达E235Q系列-GFP在迁移诱导HT1080细胞NE破裂后增加了NLS-GFP在细胞质中的持续时间，表明核膜修复受损。**，第页< 0.005;n个分别为17和10。(H（H）)在显性负性VPS4B不抑制或存在ESCRT-III的情况下，迁移诱导NE破裂后HT1080细胞死亡的百分比E235Q系列-使用ATM抑制剂KU-55933（ATMi）修复GFP和/或DNA。**，第页< 0.01;n个分别为20、32、38、30，与使用ATMi的WT和不使用ATMi的E235Q相比。图中误差线：平均值±标准误差。
总之，我们的研究表明，在癌细胞侵袭过程中经常遇到的细胞通过受限空间迁移会挑战NE和DNA含量的完整性，这可能会促进DNA损伤、非整倍体和基因组重排，并且在缺乏有效修复细胞死亡的情况下。我们提出了一个生物物理模型，在该模型中，细胞骨架产生的核压力导致核膜泡的形成和最终破裂，核膜泡位于高曲率和下伏核膜薄弱的部位(图S15). 这些事件在层粘连蛋白水平降低的细胞中尤为显著，层粘连素在许多癌症中的表达被解除，并且通常与阴性结果相关(31,32). 虽然去甲肾上腺素断裂以及由此导致的基因组不稳定可能会促进癌症进展，但它也可能代表转移癌细胞的一个特殊弱点，并可能通过特异性靶向这些细胞开发新的抗转移药物，例如通过阻断去甲肾上腺素修复和抑制DNA损伤修复。
