SUN2过度表达改变细胞核形状并抑制HIV

病毒。

通过转染293T细胞产生以下病毒：HIV-1 NL4-3、NL4-3ΔEnv、BRU和SF2；HIV-1传播/创始病毒CH040、CH077、RHPA、THRO和WITO（来自NIH艾滋病研究和参考试剂项目）；和HIV-2 GL-AN(42)和Rod9-绿色荧光蛋白（GFP）(43). HIV-1主要分离物DH12(44)和BON(45)和HIV-2主要隔离物TOE(46)如前所述，在PHA刺激的PBMC或Hut-78细胞中扩增（Diane Descamps馈赠的礼物）(47). 通过定点突变将CA G89V或P207S突变引入pNL4-3。编码GFP的Moloney小鼠白血病病毒（MLV-GFP）和编码荧光素酶的基孔肯亚病毒（CHIKV-luc）分别是Pierre Charneau和Philippe Desprès的礼物。

慢病毒转导。

慢病毒载体pLOC-SUN2（OHS5897-2616804；Thermo Fisher）与pLOC-TurboRFP相同，但SUN2开放阅读框（GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“CU013024.1”，“term_id”：“109451187”，“term_text”：“CU013024.1“}}CU013024.1号)在attB1和attB2重组位点引入代替TurboRFP。pLOC-SUN2包括一个CMV-SUN2-IRES-GFP（nuc）-2a-塑性蛋白盒，其中核定位GFP和速溶蛋白（由自裂肽2a分离）从与SUN2相同的转录物的内部核糖体进入位点（IRES）翻译而来。我们将此构造称为SUN2-IRES-GFP。我们设计了该载体的SUN2版本，通过AscI和HpaI消化去除IRES-GFP-2a-Blasticidin，然后进行钝化和重排，我们通过SpeI和NheI消化去除SUN2，然后进行钝化和重排来制作该载体的GFP版本。我们还利用SpeI和NheI限制性位点，将pLOC-SUN2的SUN2开放阅读框替换为萤火虫荧光素酶的开放阅读框，构建了Luc-IRES-GFP。对于短发夹RNA（shRNA）介导的SUN2沉默，我们获得了四种不同嘌呤霉素编码的pGIPZ慢载体（编号1，V2LHS_58450；编号2，V3LHS_304024；编号3，V3LHS_400288；编号4，V3LFS_304026）（RHS4531-EG25777；Thermo-Fisher）和一种阴性对照pGIPZ载体。shRNA 1和2是沉默SUN2最有效的，我们在本研究中单独使用shRNA 2或同时使用shRNA 1或2。编码CMV-GFP或CMV-luc盒的基于HIV-1的慢载体，包括整合酶（IN）缺陷突变体（整合酶D64V；Pierre Charneau的一种礼物），基于NL4-3。使用上述慢病毒载体与水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）表达质粒和慢病毒包装质粒pR8-2或pR8-74共同转染293T细胞，产生类病毒颗粒（VLP）(48). 细胞系通过添加VLP转导3小时或过夜。所产生的转导细胞群是在含有急变菌素（GFP、Luc-IRES-GFP和SUN2-IRES-GFP慢载体为10μg/ml）或嘌呤霉素（shRNA慢载体为1μg/ml）的情况下生长的。生成转导的MDDC，CD14⁺单核细胞在分离后立即用Vpx VLPs（基于SIV3+包装质粒并含有Vpx[49]). 随后在MDDC分化过程中添加并维持SUN2过度表达的VLP。

siRNA转染。

为了通过短干扰RNA（siRNA）沉默CypA，CHME细胞使用Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher）和最终浓度为10 nM的siRNA悬浮转染（Silencer选择靶向CypA或阴性对照siRNA的siRNA；s57823；Ambion）。

感染。

通过在100μl/孔（MDDC）或200μl/井（其他细胞类型）中添加病毒（如图所示，以每孔p24[HIV-1]或p27[HIV-2]的毫微克计量），以96-well格式进行常规感染。HEPES（10 mM）和DEAE-右旋糖酐（2μg/ml）用于原发性病毒和HIV-2感染以及MDDC感染。除非另有说明，否则通过测量Gag的百分比来监测感染⁺对于复制能力强的病毒，在感染后第3天（p.i.）通过流式细胞术检测细胞，对于NL4-3ΔEnv、慢病毒颗粒或MLV-GFP的感染，在感染后第2天（p.i.）通过流式细胞术检测细胞。在16 h p.i.时检测CHIKV感染。如有指示，NVP在5μM时使用，RAL在1μM时用。

通行试验。

用GFP或SUN2转导的CHME细胞（每个T25烧瓶200000个细胞）感染20 ng NL4-3，体积为5 ml，持续4 h。然后去除病毒，清洗细胞三次，并添加新鲜培养基。每隔2～3天收集一次细胞和上清液，用流式细胞仪检测感染情况，进行Gag染色。在相同条件下，使用感染高峰的20纳克p24上清液重新感染新鲜细胞；这一共重复了四次。在第四代感染高峰时从感染细胞中提取基因组DNA，并用跨越病毒基因组的四对引物进行扩增。PCR产物被纯化并测序，以确定感染细胞群体中固定的突变。作为对照，我们对在GFP转导的CHME细胞中传代的病毒和用于病毒生产的pNL4-3质粒进行了测序。

流式细胞术。

我们使用了针对Gag（KC57-荧光素异硫氰酸盐[FITC]或KC57-Rd1；1/500稀释；Beckman Coulter）、SUN2（EPR6557；1/500稀；Abcam）、CypA（58144；1/1000稀；Abcam）或MxA（MN143；1/500稀释剂；由Otto Haller善意提供）的一级抗体。次级山羊抗鼠或山羊抗兔抗体来自Thermo Fisher。使用同种匹配抗体（或抗Gag染色的非感染细胞）作为对照。用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞5分钟或用2%PFA固定细胞15分钟，并用皂苷或Triton X-100渗透细胞（SUN2为0.9%，HIV-2感染Gag染色为0.5%，7分钟）。使用FACSCanto II（Becton Dickinson）采集样品，并使用Flow Jo软件进行分析。

qPCR。

用DNase I（50 U/ml；Roche）在10 mM MgCl存在下处理带有VSV-G的NL4-3-ΔEnv假型₂在感染前降解残留质粒DNA。使用38毫微克DNA酶处理的病毒p24感染160000个总体积为500μl的CHME细胞。3小时后，清除病毒并清洗细胞；感染细胞于第7或28小时采集。基因组DNA（用于病毒总DNA和整合病毒DNA的定量）使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）提取。按照HIV-1 2-LTR循环所述的低拷贝提取的推荐方案修改，使用QIAprep自旋微准备试剂盒（Qiagen）提取染色体外DNA（用于定量非整合病毒DNA，包括2长末端重复序列[LTR]循环）(50). 为了在p.i.7和28 h测量病毒DNA和非整合DNA，我们设计了引物intRT-F（5′-GGAAGCATGGTGAGAGAGAGTATTG-3′）、int-RT-R（5′-CTGCTATTGTTTC-3′）和intRT-probe（5′-6-羧基荧光素-AGCCACCTGATTCTGGGA-黑洞猝灭剂1[BHQ1]-3′波尔使用引物MH535和MH536以及探针MH603量化2-LTR循环(51). 对于整合的DNA，我们使用了嵌套Alu-gag PCR(52)如前所述进行了修改(53)，除了为了避免在定量PCR（qPCR）步骤中扩增慢病毒载体序列外，我们设计了以下引物和探针，用于扩增堵住：2nd-gag-F（5′-CAAGCCATGCAAATGTTAA-3′）、2nd-ag-R（5′-GCATCGGATCAATCTATCCA-3′）和2nd-ga-脯氨酸（5′-6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素（JOE）-AGACCATCAAGAGAGAGACGA-BHQ1-3′）。如前所述，将基因组DNA样本归一化为其β-珠蛋白含量(53). 所有qPCR均使用铂金qPCR超混-UDG（生命技术）进行，并在Eppendorf主循环器EP realplex 2热循环器上进行扩增。

共焦免疫荧光显微镜。

细胞在12mm玻璃盖玻片上生长，在4%PFA中固定5分钟，在0.5%Triton X-100中透化15分钟，然后用抗SUN2（EPR6557；1/100；Abcam）染色，然后用山羊抗拉比-Cy5（1/300；Invitrogen）加1μg/ml Hoechst 33342（Thermo Fisher）染色。使用63倍物镜对蔡司LSM700或徕卡SP5进行共焦显微镜分析。使用FIJI软件进行图像分析。为了计算细胞核的圆度值，我们使用FIJI根据Hoechst染色强度设置上下阈值来识别细胞核。然后我们使用“分析粒子”功能（大小为1−∞μm²)将圆度设置为0.00到1.00，以跟踪所有核的轮廓。对于每个图像，使用递减的圆度值0.80、0.60、0.40和0.20重复此操作。完美圆（最低周长与面积之比）的圆度值为1，而无限复杂的形状或直线（最高周长与面积之比）的圆度值为0。然后手动计算落在每组值之间的核数。作为单个轮廓追踪的多个核（即当两个核重叠时）被排除在分析之外。

统计分析。

使用GraphPad Prism 5.0进行所有统计分析（如图图例所示）。

SUN2过表达抑制细胞系和原代细胞中的HIV感染。

为了确定SUN2表达的增加是否调节HIV感染，我们使用慢病毒转导来创建稳定的SUN2过表达细胞群。在整个研究过程中使用的实验中，细胞被转导以表达SUN2（SUN2）或SUN2，然后表达GFP和从内部核糖体进入位点（SUN2-IRES-GFP）翻译的速效素。这两种载体都导致转导细胞中SUN2水平增加约10倍(图2A). 作为对照的模拟（非转导）、GFP-或Luc-IRES-GFP-转导细胞，所有这些细胞都同样容易感染HIV-1 NL4-3(图2A到​至C）。C类). 病毒传播的动力学分析表明，在低感染多重性（MOI）下，HIV-1的复制在SUN2过度表达的CHME小胶质细胞（一种代表HIV感染自然靶点之一的髓样细胞类型）中受到限制，Gag减少了95倍以上⁺单元格比控制单元格(图2B). 使用高得多的MOI也观察到了类似的结果，其中SUN2过表达导致感染细胞减少6倍(图2B). 在整个研究过程中进行的大量独立实验中，Gag的百分比⁺当SUN2过度表达时，感染后72小时（p.i.）细胞减少9倍(图2C). 当使用水疱性口炎病毒包膜糖蛋白（VSV-G）伪型、包膜（Env）缺失的HIV-1或基于HIV-1的慢病毒颗粒时，SUN2转导细胞的单轮感染受到3-4倍的抑制(图2D). 这些慢病毒颗粒不包装或编码Tat、Rev、Nef、Vif、Vpu或Vpr，并且包含CMV-荧光素酶（luc）报告盒。这表明，在SUN2过度表达的细胞中，病毒调节蛋白或辅助蛋白或病毒启动子都不是阻断感染的靶点或抵消感染的作用。SUN2过表达也抑制了293T细胞和MT4C5细胞的单次或多次感染，尽管程度较低(图2E).

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图2

SUN2过度表达抑制HIV感染。（A） 对照组SUN2水平直方图（模拟、GFP和Luc-IRES-GFP）-和SUN2（SUN2和SUN2-IRES-GFF）-转导CHME细胞。虚线表示SUN2同型控件。（B） 感染2 ng/ml p24（左）或72 ng/ml p24（右）HIV-1 NL4-3的转导CHME细胞中病毒传播的流式细胞仪分析。（C） 本研究中使用的SUN2转导细胞与对照转导细胞中感染水平的比较。每孔细胞感染14 ng NL4-3。（D） 转导CHME细胞与VSV-G假型Env-deleted NL4-3（左）或基于NL4-3的luc-encoding慢病毒颗粒（右）的单轮感染，在48 h p.i.RLU（相对光单位）进行分析。（E） 过度表达SUN2的MT4C5或293T细胞感染（或对照转导细胞）。MT4C5细胞感染0.33 ng/ml的NL4-3 p24（96周平板每孔67 pg p24），72小时后用流式细胞仪检测感染情况。用指示量的VSV-G假型Env-deleted NL4-3感染293T细胞，48 h后用流式细胞仪检测感染情况。ns，不显著。（F，顶部）用GFP或SUN2-IRES-GFP转导MDDC并感染NL4-3的代表性实验（图示为GFP表达；SUN2水平在直方图中[虚线表示同型对照]）。转导（GFP）的感染水平⁺)72h p.i.通过流式细胞术分析细胞Gag水平；根据NVP治疗的对照感染设置闸门（底部）。（G） 如面板E所述，来自四名捐赠者的MDDC感染。所有误差条代表SEM。数据来自三个独立实验，但面板C中显示的数据来自至少四个独立实验。C组和D组的统计数据来自单因素方差分析（ANOVA）（针对每个感染水平，如有指示），采用Dunnett的多重比较试验，以寻找与对照转导细胞感染相比的统计差异。

接下来我们询问SUN2过表达是否抑制了原代细胞的HIV感染。我们用SUN2-IRES-GFP或GFP对照载体转导单核细胞衍生的树突状细胞（MDDC），其中前者的表达比内源性SUN2高约5倍(图2F). 然后将转导的MDDC暴露于具有复制能力的HIV-1。在所描述的代表性供体中，19%的GFP-转导的MDDC被生产性感染（通过设置在NVP存在下与病毒孵育的MDDC的门来确定非生产性病毒捕获），而只有4%的SUN2转导MDDC被感染(图2F). 这一模式适用于所有四名受试者的MDDC，当SUN2过度表达时，我们观察到感染率在统计学上显著下降(图2G). 总之，这些数据证实了SUN2的假定ISG屏幕结果(13)并将这些发现扩展到额外的细胞系和原代细胞。

SUN2过表达以菌株特异性的方式抑制HIV-1和HIV-2。

然后我们询问其他HIV菌株是否对SUN2过度表达敏感。对照或SUN2转导的CHME细胞感染了一组HIV-1和HIV-2毒株，包括实验室适应的分子克隆、主要分离物和传播/创始病毒；这些菌株对SUN2表现出广泛的敏感性(图3). 典型SUN2敏感和SUN2耐药菌株的感染结果如所示图3A，所有病毒株的测试结果总结于图3B尽管对SUN2敏感的HIV-1 NL4-3菌株在过表达SUN2的细胞中被抑制8倍，但分子克隆BRU和SF2受到微弱的影响或根本没有受到影响。当SUN2过度表达时，两个主要HIV-1分离株（Bon和DH12）的感染减少了4-5倍。五株HIV-1传播/创始株VSV-G假型（感染事实上的由于CHME细胞中缺乏CCR5表达，单轮）对SUN2表现出轻度或无敏感性。两株HIV-2毒株（ROD9和主要分离物TOE）在SUN2过度表达细胞中限制为6-8倍，而第三株（GL-AN）受影响较小。SUN2抑制了携带Env或假型VSV-G的病毒株的复制，表明该阻断不限于单一进入途径。含有野生型（wt）或催化不活性（D64V）整合酶（IN）的NL4-3衍生慢病毒颗粒的单轮感染同样受到抑制（正如预期的那样，IN D64V导致基因表达总体水平降低8倍；比较年轴标度），表明整合前感染被阻断。伽马逆转录病毒（MLV）或甲病毒（基孔肯雅病毒[CHIKV）感染未受影响。因此，SUN2过度表达细胞中病毒复制的阻断依赖于特定慢病毒株的结构或酶成分，并且在整合前以独立于进入途径的方式发挥作用。

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图3

HIV菌株对SUN2的敏感性差异。对照组或SUN2转导的CHME细胞感染了许多不同的病毒株。（A） SUN2敏感和SUN2不敏感病毒株的代表性感染结果，包括HIV-1（NL4-3和SF-2）和基于HIV-1的慢病毒颗粒、HIV-2（Rod9GFP）和MLV。（B） 计算了所有使用的病毒株（包括面板A中显示的病毒株和其他病毒株）的过表达SUN2感染限制倍数。折叠限制被计算为对照细胞感染率与SUN2转导细胞感染率在多种感染水平上的比值（除了主要分离物Bon和DH12的感染；每孔14纳克）。在72 h p.i.时分析具有复制能力的HIV-1和HIV-2感染情况，在48小时p.i.分析单轮HIV-1感染、慢病毒颗粒感染和MLV感染情况，并在16小时p.i分析CHIVV感染情况。用流式细胞仪分析感染情况（CHIVV侵染除外，其荧光素酶活性测定）。CH077对NVP具有抗性，因此RAL被用作对照。MFI，几何平均荧光强度。RLU，相对灯光单位。所有误差条表示三个或四个独立实验（或CHIKV-luc的两个独立实验）的SEM。

SUN2过度表达诱导多叶花样核的形成。

接下来，我们希望确定转导细胞中的SUN2是否定位于核膜，如之前在内源性和外源性SUN2的其他细胞类型中所述(34,36). 令人惊讶的是，SUN2在CHME细胞中的过度表达对细胞核形状有着深刻的影响；虽然观察到了一系列的核形状，但多叶花样核经常出现(图4A). SUN2转导细胞的增殖率与对照细胞的增殖率相等(图4B)细胞可以在培养基中保持数周而SUN2水平没有下降，这表明SUN2过度表达或由此引起的核形状改变都不会对CHME细胞的生长或生存能力产生不利影响。在非转导和GFP转导的CHME细胞的核膜中都发现了内源性SUN2，而每个细胞中经常观察到单个细胞质点，可能位于中心体(36). 过度表达的SUN2主要聚集在核膜上，在一些细胞中，在花状核的内侧边缘也有SUN2的富集(图4D). 我们还在SUN2转导的HeLa和293T细胞中观察到花状细胞核；在后者中，花状核在培养1周后不再存在，同时表达水平降低（数据未显示）。

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图4

SUN2过度表达诱导花样细胞核。（A） 用Hoechst染色的对照和SUN2转导CHME细胞的共焦显微镜（白色条代表25μm）。（B） 通过计算培养4天后细胞数量的倍数膨胀来确定增殖率，从10开始⁵单元格位于吨= 0. （C） 如材料和方法中所述，测定六种独立对照（GFP或Luc-IRES-GFP）或SUN2（SUN2或SUN2-IRES-GFP）转导的核圆度；n个=215个控制核和208个SUN2核。（D） 用Hoechst（蓝色）和αSUN2（红色）染色的对照和SUN2转导CHME细胞的共焦显微镜（白色条代表10μm）。（E，左）对照组或SUN2转导的CHME细胞用DMSO或10μM诺卡唑（Nocod.）处理，并感染VSV-G假型Env-deleted NL4-3。（右）对照组与SUN2转基因细胞的相应感染率。共聚焦图像是至少三个独立实验的代表。误差条表示三个独立实验（B和E）或六个独立转导（C）的SEM。

为了定量描述SUN2在CHME细胞中过度表达引起的核形状变化，我们创建了一个核圆形指数。使用图像分析软件，我们将核分配给五个箱子中的一个，其中值1表示完美圆形的核，值0表示形状最复杂的核(图4C; 有关详细信息，请参见材料和方法）。尽管大多数对照细胞的细胞核相对圆（85%的细胞核的圆度值高于0.6），但只有34%的SUN2转基因细胞的细胞核在这个范围内。同样，29%的SUN2过度表达细胞的细胞核圆度值低于0.4，而对照细胞的数值小于1%。以前曾报道过类似的花样细胞核，都存在于成人T细胞白血病（ATL）患者的细胞中(55,56)或患有早衰(57)在FEZ1过表达的细胞系中(58)或Csk同源激酶（Chk）(59).

花样细胞核的形成和HIV复制的抑制不需要LINC复合物或SUN2的SUN结构域。

LINC复合物由SUN蛋白三聚体和KASH域蛋白三聚物组成，它们与部分核膜和细胞骨架相互作用。接下来，我们询问LINC复合体和细胞骨架之间的相互作用是否与抑制感染和改变SUN2过度表达时观察到的核形状有关。进入后，HIV利用微管网络向细胞核贩运(60,–64)和用于脱涂层(65,66). 由于LINC复合物通过驱动蛋白-1和动力蛋白运动蛋白与微管相互作用（参考文献综述37,38、和67)我们假设该网络可能参与SUN2过度表达细胞中HIV感染的阻断。首先，我们使用微管聚合抑制剂诺卡唑，并通过共焦免疫荧光显微镜证实它破坏了CHME细胞中的微管网络（数据未显示）。我们还观察到诺卡唑部分破坏了SUN2过度表达细胞的花状核形态（数据未显示）。接下来，我们用诺可达唑预处理细胞，并用单轮Env缺失的HIV感染它们。诺卡唑维持至18h p.i.，此时大多数病毒已进入细胞核（如之前基于qPCR的细胞系HIV感染动力学研究所确定的那样[53,68]). 由于长期治疗是有毒的，因此不可能在诺康唑的存在下长期感染具有复制能力的HIV。而诺康唑降低了Gag的百分比⁺细胞在单轮HIV感染对照细胞期间，它并没有缓解SUN2施加的阻碍(图4E). SUN2过表达在对照治疗（二甲基亚砜[DMSO]）或诺卡唑（单轮感染分别为3.3×和3.5×区块）的情况下同样抑制了单轮感染，这表明SUN2施加的区块感染不需要完整的微管。虽然我们观察到诺可唑对HIV感染的影响比通常报道的更大(66,69,70)，还描述了类似的2到3倍效应(69,71)，包括CHME单元(62)，这可能反映了细胞类型依赖性效应或实验性变异（例如，在感染期间诺卡唑是否被移除或保留）。

由于两种HIV病毒都传入(72,73)和LINC复合体(37,38,67)我们询问SUN2对HIV和核形状的影响是否需要LINC介导的与细胞骨架的任何相互作用。我们构建了两个单独的SUN2点突变体（S641E和Y707A），每个突变体都消除了SUN2与KASH结构域的相互作用(74,75). 我们还构建了一个缺失整个SUN结构域的缺失突变体（SUN2 1-539；请注意，该缺失删除了SUN2抗体识别的区域）(图5A). 因此，这三个SUN2突变体都不能通过LINC复合物与细胞骨架相互作用。我们观察到这三个突变体在过度表达时诱导了花状核(图5B和​和C）C类)并在与全长蛋白相同的程度上抑制HIV感染(图5D). 出乎意料的是，我们无法通过共焦显微镜在过度表达SUN2 1-539的细胞中检测到内源性SUN2。我们推测，SUN2这种截短变异体的过度表达降低了内源性蛋白的水平，尽管这一点尚不清楚。

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图5

SUN2核质结构域是诱导类花细胞核和抑制HIV感染所必需的。（A） SUN2及其突变体示意图；星号代表点突变。（B和C）用所示SUN2突变体转导的CHME细胞的共焦显微镜，仅用Hoechst染色（B）（白色条表示25μm）或用Hoechost（蓝色）和αSUN2（红色）（C）染色（白色条代表10μm）。（D） 用GFP稳定转导的细胞或指示的SUN2突变体感染NL4-3每孔2、6或14 ng p24，并用流式细胞术分析72 h p.i。（E） 瞬时转导细胞（转导后2至3天）感染NL4-3每孔2、6或14 ng p24，并通过流式细胞术分析72 h p.i。误差条代表三个独立实验的SEM。共聚焦图像是至少三个独立实验的代表。

SUN2的核质结构域是诱导类花细胞核和抑制HIV复制所必需的。

鉴于C末端SUN结构域对HIV抑制或核形状改变不是必需的，我们接下来研究了SUN2的N末端结构域与核膜相互作用的作用。我们构建了一个SUN2突变体，该突变体缺少核质结构域，但保留了内核跨膜结构域（SUN2Δ1-158）(图5A). SUN2Δ1-158转染CHME细胞显示典型的圆形细胞核(图5B)SUN2主要积聚在细胞质中(图5C)在可以代表高尔基体的隔间中，如前面所述的SUN2的N末端缺失(34,76). SUN2Δ1-158也以较低的水平存在于核膜上。我们还注意到，与全长SUN2或上述其他突变体相比，用SUN2Δ1-158转导的细胞长期存活率较低。因此，尽管感染表现为图5D使用稳定的转基因群体图5E在转染后2至3天感染HIV。值得注意的是，表达SUN2Δ1-158的细胞不能抑制HIV感染(图5E). 因此，SUN2的核层相互作用核质结构域是其诱导核形状改变和抑制HIV感染的能力所必需的，这可能是由于其对亚细胞定位的影响或该结构域本身的存在。

在SUN2过度表达的细胞中，HIV在逆转录后、核导入时或之前被阻断。

为了了解SUN2过度表达细胞中哪一个复制步骤被阻断，我们使用定量PCR（qPCR）来测量单轮感染期间合成的各种病毒DNA种类的数量。病毒DNA在p.i.第7和28小时的水平没有改变(图6A)这表明逆转录不受SUN2的影响。接下来，我们从感染细胞中分离出染色体外（低分子量）DNA，发现病毒DNA的总水平（包括所有形式的未整合病毒DNA，无论是细胞质还是核）在28小时后增加(图6B). 相比之下，2-LTR环的水平被认为是病毒PIC进入细胞核的标志(77)，在相同的样本中减少。当在整合酶抑制剂RAL存在下进行感染时，SUN2过度表达也降低了2-LTR循环水平，进一步表明在整合前感染受到抑制(图6C). 此外，整合DNA和Gag蛋白表达水平均降低(图6D和​和E）。E类).图6F显示了SUN2过度表达细胞与对照细胞中病毒DNA水平的比率，该比率是根据图6A到​到E，E类从中我们得出结论，SUN2过表达在逆转录完成后的一个步骤中抑制HIV感染，但在核导入时或之前。

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图6

SUN2在逆转录和核进入之间抑制HIV感染，并被CA突变所克服。（A至D）用VSV-G假型Env-deleted NL4-3感染转导的CHME细胞后28 h（或第一张图中的7 h），用qPCR测定病毒DNA的指示形式。（E） 在48 h p.i.通过流式细胞仪测量相同感染细胞中的基因表达。（F）根据面板A至E中显示的数据计算SUN2转基因细胞与对照细胞中的病毒DNA比率。（G）对照或SUN2转导CHME细胞感染4 ng/ml p24 NL4-3。用流式细胞仪检测感染情况，并用感染高峰时每种细胞类型中等量的病毒（基于p24含量）感染新鲜细胞。在第四轮传播中，根据感染高峰对病毒进行了测序。（H） 用三种不同剂量的病毒感染wt（NL4-3）或CA P207S病毒感染对照或SUN2转导的CHME细胞；显示了SUN2与对照细胞的感染率。误差条代表SEM，除面板G中显示的数据外，所有数据均来自三个独立的实验。未配对双尾吨测试用于测试面板A到E的统计显著性。

鉴定一种CA逃逸突变，该突变绕过SUN2过度表达细胞施加的阻断。

接下来，我们希望确定SUN2的病毒靶点。为了解决这个问题，我们执行了在体外进化实验选择可能在SUN2过度表达的情况下复制的病毒。在第一轮感染中，与对照细胞相比，SUN2过度表达的HIV-1 NL4-3复制高峰延迟了1周(图6G). 从每种细胞类型的感染高峰收集的病毒上清液用于感染新鲜细胞；在四轮感染后，我们获得了以类似动力学复制的病毒，而不管SUN2状态如何。对整个病毒基因组进行测序，发现了CA 207位的突变（P207S），以及逆转录酶（RT）中的突变V276I和Vif中的突变V142I。在对照细胞中传播的病毒群体中没有固定的突变。

我们选择CA P207S突变进行进一步研究，因为CA在脱膜和核导入过程中与细胞蛋白相互作用，并且是已知限制因子的靶点(19). 当引入NL4-3（wt-CA）主干时，与亲本wt病毒相比，CA P207S在对照细胞中的适应度略有降低。此外，当wt病毒被SUN2过度表达阻断8倍时，P207S病毒被阻断<2倍(图6H). 由于CA中的单氨基酸变化可以导致逃避SUN2施加的阻滞，这强烈表明CA本身或CA与之相互作用的宿主因子是SUN2的靶点。将RT V276I或Vif V142I添加到CA P207S病毒中并没有改变病毒对过度表达SUN2的敏感性（数据未显示）。有趣的是，CA P207S先前在Mx2过表达细胞中被选择，在那里它对人类Mx2产生了部分抗性，并改变了某些猿猴物种对Mx2的病毒敏感性(24).

我们感谢蒂莫斯·布鲁尔和亚历克斯·康普顿对原稿的批判性阅读，感谢病毒与免疫组所有成员的有益讨论。我们还感谢巴斯德图像研究所设施的成员提供技术支持。我们感谢Mojgan Naghavi、Diane Descamps、Pierre Charneau、Philippe Desprès、EFS和NIH艾滋病研究和参考试剂项目慷慨提供试剂。