基于转染的CRISPR/Cas9载体在小鼠体内的多重胰腺基因组工程和肿瘤诱导

复合CRISPR/Cas9诱导胰腺癌

开发基于电穿孔的CRISPR/Cas9载体传递方法的另一个主要动机是我们实现CRISPR/Cas9多路复用的目标。我们预计电泳转染可以使多个sgRNAs同时传递到单个细胞。这很难，或者（对于高级多路复用）甚至不可能通过使用病毒传递方法来实现。我们选择了两个中性遗传位点以及一组13个抑癌基因作为靶点，这些基因以前曾被报道参与胰腺肿瘤的发生，尽管频率不同(图3a和补充表1). sgRNAs被克隆到改良的pX330中（参考文献^15,29)载体，支持分别由鸡β-肌动蛋白（Cbh）和U6启动子表达Cas9和sgRNAs(图3b). 我们用各自的载体瞬时转染小鼠胰腺癌细胞系，检测每个基因座的多个sgRNAs。进一步选择与均匀高切割效率相关的sgRNAs体内实验。图3a显示了这些选定sgRNA的Surveyor分析。

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图3

基于CRISPR/Cas9的胰腺多重突变和肿瘤诱导Ptf1a公司^Cre公司/+;喀斯特^{LSL-G12D型/+}老鼠。

(一)体外检测核酸酶分析显示sgRNAs的切割效率体内实验。对照组转染中性sgRNAs，靶向罗莎26轨迹。(b条)pX330载体的改良版本用于瞬时Cas9和sgRNA表达。密码优化的表达产热链球菌Cas9（hSpCas9）和sgRNAs分别由Cbh和人类U6启动子驱动。(c（c）)生成实验（顶部）和控制（底部）队列的实验程序方案。EP，电穿孔。TSG，肿瘤抑制基因。(d日)使用MRI定期监测肿瘤形成，时间长达6个月。大PDAC 21周（w）PE（上图）和小PDAC 5周PE（下图）的T2加权MRI切片。箭头指示PDA。Co，结肠；Ki，肾脏；Vc，脊椎动物柱。(e（电子）)用15种sgRNAs混合物电穿孔的实验队列的肿瘤发病率(n个=13）和用两个中性sgRNAs电穿孔的对照动物(n个=8).P（P）=0.016; 对数秩检验。(如果——k个)中等分化PDAC（G2-G3；如果——小时)以及相应的肝转移（liv-met；克)以及分化不良的肉瘤样（G4）PDAC(我——k个)内有间变性巨细胞（箭头）我Tu5的IHC证实了CK19阳性导管结构中去分化肉瘤样细胞的起源(k个). 血红素和曙红（H&E）染色切片如所示如果——k个.比例尺，50μm。

超过90%的人类胰腺癌KRAS公司突变与胰腺特异性喀斯特^G12D系列中的表达式Ptf1a公司^Cre公司/+（参考。³²);喀斯特^{LSL-G12D型/+}（参考。³³; PK）小鼠诱导PDAC，尽管时间较长。我们观察到中位生存期为472天（范围为263至844天；n个=55). 为了探索在该模型中基于CRISPR/Cas9的肿瘤抑制基因靶向的可行性，我们进行了直接DNA注射和电穿孔，以共递送15个表达不同sgRNA的CRISPR/Cas9载体。对照小鼠用两个“中性”sgRNAs电穿孔，靶向罗莎26轨迹(图3c和补充表2). 通过磁共振成像（MRI；图3d). 我们观察到，在接受15-sgRNA混合物的PK小鼠中，肿瘤发生急剧加速，动物在4周PE后开始罹患胰腺癌。在该组中，13只小鼠中有7只（54%）在24周PE内发生肿瘤，而通过MRI转染中性sgRNA的PK鼠中未检测到肿瘤(n个=8;P（P）<0.016; 对数秩检验；图3e). 具有不同组织病理学特征的胰腺癌（良/中度分化为未分化或肉瘤样胰腺癌）和肝转移的例子见图3f–k为了排除肉瘤样肿瘤实际上是来自CRISPR/Cas9靶向成纤维细胞的肉瘤的可能性，我们对上皮标记物细胞角蛋白19（CK19）和E-cadherin进行了IHC染色。这些实验证实了CK19阳性胰腺导管结构中去分化肉瘤样细胞的起源(图3k). 此外，在喀斯特^{LSL-G12D型/+}等位基因（由胰腺特异性介导Ptf1a公司^Cre公司/+)在所有来源于这些肿瘤的原代细胞培养中都可以检测到。

用于组合基因打靶的多重CRISPR/Cas9

为了检测CRISPR/Cas9对突变的诱导作用，我们对原发性胰腺肿瘤和健康对照组织中的PCR-扩增靶点进行了NGS。由于带有大量缺失的测序读取结果显示与构建的参考基因组的重叠程度很低，因此在使用标准生物信息学工具进行绘图时，它们经常被过滤掉。因此，我们使用人工检测/绘制的毛细管测序数据，为PCR产品中基于NGS的高通量CRISPR/Cas9-indel检测开发优化算法（见“方法”部分）。我们在电穿孔小鼠胰腺癌周围非肿瘤胰腺组织中未发现sgRNA靶点突变（高于测序错误率）(图4a). 这是意料之中的，因为通过电穿孔传递CRISPR/Cas9的细胞数量较少。超深测序无法检测到这些细胞中诱导的突变，因为它们的频率远低于测序错误率。与正常胰腺组织相比，所有肿瘤在多个sgRNA靶点都有高频indels(图4a和补充数据1)，反映了CRISPR/Cas9诱导的驱动突变导致癌症的克隆扩张。我们使用NGS来确定目标位点的突变读取频率（MRF；定义为单个目标位点上突变序列读取/所有读取的分数）。在图4a，单个靶点的多个突变以简化的方式呈现为每个肿瘤中的累积MRF。单个靶点突变类型和频率的详细介绍见补充图2针对每种癌症。

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图4

CRISPR/Cas诱导的癌症中的靶点突变。

(一)电穿孔健康胰腺组织（PancTi）、PDAC细胞系（Tu1-6）和原发肿瘤组织（Tu7-Ti）中每个靶点的指数和等位基因状态。方框中的数字表示每个目标位点的突变读取频率（MRF；定义为单个目标位点上突变序列读取/所有读取的分数）。每个靶点的多个突变表现为一个组合MRF。单个靶点不同突变的更详细介绍见补充图2红色和蓝色框分别表示靶基因座的完全或部分失活。如果至少保留一条带有非突变野生型序列的染色体，则目标基因座被定义为仅部分失活。对于组织（棕色盒子），无法假设完全/部分失活。灰色方框表示目标位点缺乏突变。星号表示在Cdkn2a公司融合轨迹Cdkn2a-ex1β和Cdkn2a-ex2（另请参见图6). 白色方框（Tu3）表示无电穿孔罗莎26.1和罗莎26.2控制导轨。(b条)所有序列肿瘤中indel类型和大小的光谱和分布。删除，删除；Ins，插入。(c（c）)CRISPR/Cas9诱导的靶位点纯合子（homoz）突变的示例和序列背景。PCR也检测到大量缺失，显示出额外的缩短产物。PAM，原间隔邻近动机；外显子和Co，对照。(d日)肿瘤靶点的等位基因状态。纯合性是指在癌细胞培养中缺乏野生型序列读取。Het，杂合子。(e（电子）)二倍体（Tu1）和多/非整倍体癌症（Tu2）的突变光谱示例。对细胞株进行M-FISH和靶点测序。结果显示了三个具有代表性的靶基因。靶点突变的MRF分配给单个染色体。Tu2靶位点存在两个以上突变反映了瞬时CRISPR/Cas9表达期间的早期多倍体化。所有染色体的综合数据如所示补充图4.

缺失和插入的大小分别为1至363 bp和1至32 bp(图4b). Indel大小和频率呈负相关。大多数indels较小，位于Cas9诱导的双链断裂位置（PAM上游1–5 bp）。示例显示在中的相关序列上下文中图4c.凝胶电泳也可检测到大的吲哚(图4c). 由于非同源末端连接的修复，对缺失（90%）和插入（10%）有强烈的偏见(图4b).

每种癌症都在几个靶基因中显示indels，反映了多个sgRNAs对来源细胞的转染(图4a). 在15个靶基因中，有7到14个在单个癌症中同时发生突变，证明（i）多重CRISPR/Cas9载体向单个细胞共同传递的高效性，以及（ii）胰腺细胞中瞬时表达的CRISPR/Cas9的基因编辑高效性。这表明组合基因靶向胰腺的方法具有广泛的适用性，例如，探索癌症基因的协同相互作用。

我们最近开发了CRISPR/Cas9多路复用技术，用于小鼠肝脏的正向基因筛查²⁹为此，我们使用了尾静脉流体动力注射，它允许向数百万个细胞进行多重载体传递，每个细胞都可以获得少量或多个sgRNAs的随机组合。这会产生大量具有巨大遗传复杂性的细胞，从而支持通过正向选择进行正向遗传筛选。

胰腺中基于电泳的多重CRISPR/Cas9突变与肝脏中采用的方法在两个关键方面有所不同：第一，靶细胞数量极低（每个胰腺几百个），第二，多重载体传递到单个细胞的效率极高（每个细胞7-14个sgRNAs；包括“中性”sgRNAs；查看控制的高频罗莎26indel诱导）。因此，在这种情况下，突变的总复杂度很低，不适合大规模正向遗传学（因此，在这个小群体中无法建立基因型/表型相关性）。相反，该方法将极大地改变我们执行复杂假设驱动的反向遗传学的能力，这在其他模型系统中是不可行的。在散发性肿瘤发生的情况下研究复杂的抑癌基因相互作用不仅在高通量的方式上变得可行，而且在没有任何种系基因工程和多年的交叉的情况下也变得可行。此外，近交系成年小鼠的体细胞CRISPR/Cas9基因组工程克服了混合背景下不可预测的表型变异问题，这是转基因小鼠多等位基因杂交中的一个重要混杂因素。

多路CRISPR/Cas9体内阴性选择筛选

CRISPR/Cas9诱导的癌症中唯一没有突变的靶基因是Brca2型尽管事实上Brca2型sgRNAs具有功能性，并且被证明能够以与其他sgRNAs相似的效率调节吲哚的形成在体外(图3a). 这意味着负面选择Brca2型灭活。的确，纯合子Brca2型灭活被证明可以抑制Kras^G12D系列-依赖性PDAC形成，但在Trp53基因突变背景，当Trp53依赖的细胞周期检查点在小鼠中发生改变时^34,35此外，在人类胰腺癌中，体细胞癌Brca2型失活总是与第53页突变²。我们怀疑类似的假设也可能适用于布尔卡1仅在一个CRISPR/Cas9诱导的(Trp53基因-突变）癌症。这些数据表明，首次在小鼠胰腺中进行阴性选择筛查变得可行，为解决各种各样的生物学问题提供了独特的机会。例如，可以利用该方法系统地探索合成致命性和治疗脆弱性体内.

CRISPR/Cas9诱导突变的等位基因状态

从测序数据（MRF）推断CRISPR/Cas9诱导突变的纯合子或杂合子是复杂的，可能会被不同的因素混淆。首先，胰腺癌的高基质成分和基质反应的肿瘤间变异性使得很难将野生型序列读数分配给癌症和基质细胞。为了解决这个问题，我们从六种肿瘤中产生了原代细胞培养物（以下称为“细胞系”），并比较了它们的MRF。补充图3结果表明，单个靶点的累积MRF值明显区分了细胞系中的完整（非野生型序列）或杂合/部分靶基因失活，但不区分癌组织中的失活。

胰腺癌中多倍体和非整倍体的频繁发生导致了第二种复杂性。因此，我们还进行了多光谱核型分析（多色荧光就地杂交（M-FISH））并结合M-FISH/测序数据，以获得与每个靶位点相关的染色体数目和突变的准确图片。Tu1是一例具有稳定二倍体核型的癌症。因此，它显示每个目标站点最多有两个独立索引。带有同源、异源或无突变的染色体/靶点示例如所示图4e（完整的核型和突变谱如所示补充图4). 相比之下，Tu2的每个目标站点通常有两个以上的indel（最多五个；图4e和补充图4)这可以通过其多/非整倍体核型进行调和。例如，野生型和三种不同indel序列的频率罗莎26.2可以分配给6号染色体的7个拷贝(图4e; 看见补充图4更多示例）。该肿瘤的indel模式也表明，在瞬时CRISPR/Cas9表达时已经存在多倍体。总的来说，对癌细胞培养物中MRF的深入分析表明，在76%的病例中，CRISPR/Cas9突变诱导了完全的基因失活，而在24%的病例里，至少保留了一个野生型等位基因(图4d).

转移性疾病的系统发育追踪

标准胰腺癌模型的一个局限性（例如，广泛使用的喀斯特/Trp53基因双突变模型）是一种多灶癌症发展，它混淆/限制了转移扩散的进化研究或系统发育追踪。我们假设CRISPR/Cas9突变模式可以用于跟踪多个独立癌症小鼠的转移演变。为此，我们对一只动物的大肿瘤块（～1.5 cm）进行了广泛的地理取样，并从八个肿瘤区域进行了细胞培养(图5和补充图5). 原发癌组织和相应细胞培养物中靶点的NGS显示出两种独立的原发癌，定义为（i）受影响基因的不同组合和（ii）单个靶点的indel类型和位置的差异。我们发现肿瘤的最大部分（95%）来自Tu1(图5和补充图5). 八次活检中只有一次（活检1）显示indel模式，表明存在额外的肿瘤。我们从活检1的原代细胞培养中总共生成了14个单细胞克隆，这使得在遗传水平上明确定义Tu2成为可能(图5和补充图5).

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图5

CRISPR/Cas9诱导的PDAC转移的系统发育追踪。

对一个大的（～1.5 cm）CRISPR/Cas9诱导的PDAC进行地理取样，以从八个肿瘤区域生成癌细胞培养物（正方形）。这八种细胞培养物的测序（Seq.）表明存在两种独立的肿瘤：所有培养物中的Tu1（1-8）和培养物1中的Tu2。来自区域1（菱形）的14个单细胞克隆的进一步测序证实存在两种独立的原发癌：参见单细胞克隆1和8（Tu1）以及5和12（Tu2）的组合MRF。收集9例肝转移瘤（liv-met）进行癌细胞培养（圈）。突变模式显示，这两种肿瘤产生的转移程度相似。有关目标位点突变类型的详细信息，请参见补充图5.

我们还收集了9个转移性结节并进行了相应的细胞培养。CRISPR/Cas9-indel模式显示，这两种癌症对转移表型的贡献程度相似（50%的结节起源于Tu1，50%来自Tu2；图5和补充图5). 总之，这些结果表明，CRISPR/Cas9多路复用和indel分析是一种非常准确和廉价的方法（与CGH或exome-sequencing相比）来系统学追踪转移。

CRISPR/Cas9诱发癌症的非靶向效应

为了检查短暂的CRISPR/Cas9表达是否会导致脱靶切割，我们对每个sgRNA的前五个脱靶位点和至少三个外显子脱靶位点进行了测序(补充表3和4). 对648个位置（每个癌症108个潜在的非靶点；在6个细胞系中）基于amplicon的NGS数据的分析显示，在这些预测的非靶位点，只有野生型序列。因此，我们得出结论，在我们的瞬态CRISPR/Cas9表达实验设置中，意外的离靶效应可以忽略不计。

的克隆CRISPR-SB公司

为了传递CRISPR/Cas9组分，我们使用了一个改良的单载体系统pX330（Addgene#42230），该系统在sgRNA和Cas9表达盒（CRISPR-SB）两侧具有Sleeping Beauty反向末端重复序列²⁹当与转座酶共同递送时，转座重复序列允许CRISPR构建的稳定基因组整合，这是本研究不追求的选择。退火sgRNA寡核苷酸(补充表5)被克隆到BbsI公司-开放CRISPR-SB向量⁵².

SURVEYOR个体sgRNA切割效率测定

为了确定我们的CRISPR-SB载体系统中单个sgRNA的切割效率，我们使用了在所有靶点都包含完整位点的小鼠胰腺癌细胞系PPT-4072。细胞系在添加了10%胎牛血清（生物色素）和1×Pen Strep（青霉素50单位ml）的RPMI（Thermo Fisher Scientific Inc.）中培养⁻¹，链霉素50μg ml⁻¹; 赛默飞世尔科技公司）。转染前一天，共有50000个细胞接种在12孔板中。使用25μl Lipofectime 2000试剂（Life Technologies）隔夜共转染500 ng相应的CRISPR-SB载体和200 ng pLentiX1-Puro（Addgene#17297）载体。用4μg ml筛选细胞⁻¹嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific Inc.）约72小时，用DirectPCR裂解试剂盒（Qiagen）裂解并用TaKaRa扩增出厂Taq使用下列引物对的聚合酶（Clontech）补充表6.在总共12μl 1×TaKaRa反应缓冲液中调整每个PCR产物共250 ng。根据制造商的说明进行异源双链形成和SURVEYOR核酸酶分析（转基因）。Cas9-介导的indel频率是根据酶切DNA的分数计算的，由凝胶带的综合强度决定⁵³.

动物实验

本研究中使用的鼠标线包括Ptf1a公司^Cre公司/+（参考。³²),喀斯特^{LSL-G12D型/+}老鼠³³和罗莎26^{毫吨/毫克}老鼠³⁰（全部采用混合C57BL/6J；129S背景）。根据机构指南，动物被安置在特定的无病原体条件下并进行饲养。所有动物研究都是按照欧洲实验动物护理和使用指南进行的，并得到了慕尼黑理工大学动物护理与使用委员会（IACUC）、Regierung von Oberbayern和英国内政部的批准。

手术程序和体内电穿孔

原则上，体内基于电穿孔的转染广泛应用于许多器官，例如肌肉⁵⁴，肝脏⁵⁵，肺⁵⁶，大脑²⁶对于手术，8至15周龄的小鼠用美托咪定（0.5 mg kg）联合麻醉⁻¹)，咪唑安定（5.0 mg kg⁻¹)芬太尼（0.05 mg kg⁻¹，MMF）。左翼被仔细剃光，眼睛被软膏保护，腹部被消毒。麻醉完成后，在脾脏尾部做一个约1.5厘米的左侧切口，定位胰腺，然后小心地将其从腹部取出，以便进行实质内注射。使用27G套管在3-4 mm深度缓慢给药质粒混合物。每种CRISPR-SB载体输送4μg（15 sgRNA混合物为60μg，Rosa26 sgRNA对照混合物为8μg，总体积为50μl）。套管在此位置保持至少30秒，以避免气泡泄漏。对于体内电穿孔，Nepa21方形脉冲发生器连接到配备3 mm的forceps型电极²磁盘（CUY650P3，Nepa Gene Co.，Ltd.，Ichikawa，Chiba，Japan）被使用。对于电穿孔，注射部位被镊子型电极小心夹住。为了限制组织损伤，使用的最大电压为50 V。在穿孔脉冲期间焦耳热量测量值（Pp）小于0.15焦耳的情况下，我们应用第二系列脉冲来提高转染效率。Nepa21仪器能够产生精确的平方脉冲，促进DNA高效转移至细胞体内在电泳转染过程中，向器官施加两种不同类型的脉冲(图1b、c). 由于较高的电压，第一系列脉冲（Poring脉冲，Pp）将孔隙引入细胞的质膜中。第二个序列包含延伸的低振幅（转移脉冲；Tp），这有助于DNA颗粒转移到细胞质中。电穿孔后，将胰腺和脾脏小心地放回其解剖位置，并用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS；Life Technologies）覆盖，以避免器官粘连。腹膜用间断缝合（5-0埃塞俄比亚）封闭，皮肤用伤口夹封闭。将小鼠置于37°C的加热室中，直到它们醒来。

的效率体内小鼠胰腺电穿孔

将60μg GFP表达质粒pcDNA6.2（LifeTech）与内窥镜标记物（GI Supply）1:1混合注射到8至15周龄野生型小鼠（C57BL/6J）中，以检测转染效率。内窥镜标记物包含一种无菌、非致热原悬浮液，由高度纯化的碳颗粒组成，用于创建标记组织的永久标记。为了鉴定GFP表达细胞，在2天的PE中处死小鼠。为了进行解剖，通过内窥镜标记物定位注射区域。胰腺组织用福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切2μm切片。每隔一段进行取样，并根据GFP进行IHC(补充表7). 总的来说，24个样本中有12个样本计数为GFP阳性细胞。

长期存活的转染胰腺细胞

确定成功转染8至15周龄长期存活胰腺细胞的数量罗莎26^{毫吨/毫克}使用30μg PGK-Cre载体（Addgene#11543）或非载体对照对小鼠进行电穿孔，并在7天内去除胰腺。Cre介导的重组罗莎26^{毫吨/毫克}等位基因导致mT（膜靶向tdTomato）切除和mG（膜靶向GFP）表达。将组织在不含甲醇的4%多聚甲醛中固定1小时，随后在溶于PBS的15%和30%蔗糖中脱水，直到组织下沉。将脱水组织包埋在Tissue-Tek（樱花）中，并在液氮中快速冷冻以进行冷冻切片。为了分析胰腺电穿孔区域的重组事件，对标记注射区域进行完全取样：每隔10μm分析一次切片。因此，用DAPI（Thermo Fisher Scientific Inc.）对标本进行复染，并用荧光显微镜对重组GFP阳性细胞进行计数。

巢式PCR检测罗莎26 ^{毫吨/毫克} 等位基因

进行巢式PCR以验证Cre介导的罗莎26^mT/mG报告小鼠的等位基因。从胰腺电穿孔部位分离出DNA，并使用塔克聚合酶（VWR国际；40个周期；T型_一=62°C；补充表8). 1μl PCR产物或1μl 1:10⁵阳性对照稀释后，用套式引物集进行第二次扩增（30个周期；T型_一=62°C；补充表8). 将嵌套的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行尺寸分离或纯化（QIAquick PCR纯化试剂盒，Qiagen），以验证Cre介导的罗莎26^{毫吨/毫克}通过Sanger毛细管测序进行重组。

MRI筛查

MRI在3-Tesla临床MRI飞利浦医疗系统（Ingenia 3 T）上进行，使用人类八通道腕线圈（SENSE腕线圈8元件），遵循之前描述的适用于3 T扫描仪的协议。电穿孔后5至10周，每月对小鼠进行一次MRI筛查。为此，纵向T2加权（T2w）涡轮自旋回波成像（层厚=0.7 mm，平面分辨率=0.3×0.38 mm）²，TR/TE=4352 ms/101 ms，TF=21，NSA=9）用于肿瘤检测。当肿瘤直径超过2毫米时，小鼠被杀死⁵⁷.

组织学和免疫组织化学

按照上述方法制备福尔马林固定石蜡包埋组织以进行效率测试。根据标准方案对标本进行苏木精和曙红染色。IHC的预处理程序、主要抗体和稀释液列于补充表7为了进行可视化，使用辣根过氧化物酶标记的二级兔抗鼠抗体（1:1000，Jackson Immunor Research）或二级鼠抗兔抗体（1:300，Dako），并按照Bond Max染色机器人（徕卡）上的Bond Polymer精细检测试剂盒手册进行检测。

原代细胞系的建立

为了分离原代小鼠细胞系，原代肿瘤或肝转移的肿瘤组织在PBS中清洗，切成小块，转移到胶原酶消化介质（200 U ml）中⁻¹胶原酶II型（沃辛顿），10%FBS，1×Pen Strep（青霉素50单位ml⁻¹，链霉素50μg ml⁻¹)，1%真菌酮（2.5μg ml⁻¹)在RPMI 1640培养基（全部为赛默飞世尔科技公司）中，在37°C下消化过夜。第二天，将释放的细胞接种在六孔板中，并在含有10%FBS、1×PenStrep和1%Fungizone的RPMI 1640培养基中传代。

DNA分离和Sanger测序

使用DNeasy Blood and tissue kit（Qiagen）从组织样品（储存在−20°C的RNAlater（Sigma-Aldrich）中）或相应细胞系的冷冻细胞颗粒中分离DNA。使用Q5高纯度DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）扩增目标基因组区域。对于Sanger毛细管测序，对PCR产物进行纯化（QIAquick PCR纯化试剂盒，Qiagen），并使用相应的正向引物分别对每个PCR反应进行测序。选择引物扩增目标位点周围约400到500个碱基对的PCR产物(补充表6).

下一代扩增子测序

基因组靶点的DNA提取和扩增(补充表6)或非目标基因座(补充表3和4)按照Sanger测序所述进行。将所有扩增的目标位点（20μl反应体积）合并并纯化（QIAquick PCR纯化试剂盒，Qiagen）。使用NEBNext Ultra DNA文库Illumina制备试剂盒进行文库制备和定量，如前所述⁵⁸简单地说，在末端修复和A拖尾后，结扎Illumina成对末端适配器，并用12个PCR周期对单个样本池进行条形码（序列补充表6). 收集条形码样本，并用qPCR对最终文库进行量化，以对Illumina MiSeq（300 bp，配对端）进行测序。

生物信息分析

MiSeq Illumina配对的300个核苷酸读数用BBMAP短读比对器定位(网址：http://bbmap.sourceforge.net)在mm10组件上使用默认设置。与许多其他测试的对准器相比，只有这个特定的对准器能够正确绘制大于100 bp的大缺失。使用samtools对BAM文件进行排序和索引（v0.1.19；参考。⁵⁹). 映射后，仅基于位标记0×2提取成对读取（约3%未成对），导致BAM文件仅包含正确成对读取。带有选项（-i）的Samtools（v0.1.6）pileup命令用于显示包含indel的行，以获取pileup格式的数据，以及覆盖站点的读取次数。使用VarScan（v2.3.6）pileup2indel命令处理Pileup文件⁶⁰。检测到的indels只有在支持100多个突变读取时才被认为是正确的。用于突变分析的所有过滤索引列表如下所示补充数据.

染色体内和染色体间重排PCR

通过TaKaRa检测CRISPR-SB sgRNAs的每个可能的染色体内组合Ex Taq公司对所有肿瘤样本进行PCR。如M-FISH所示，检测染色体间重排（易位）。简而言之，50 ng基因组DNA用于30μl PCR反应体积，引物对显示在补充表6.所得PCR产物经凝胶纯化（凝胶纯化试剂盒，Qiagen）并通过Sanger毛细管测序进行测序。

我们感谢Olga Seelbach、Ruth Hillermann、Magdalena Zukowska和Iryna Skuratovska提供的出色技术援助。这项工作得到了德国癌症联合会联合资助计划、Helmholtz Gemeinschaft（PCCC联合会）和欧洲研究理事会（ERC CoG No.648521）的支持。