跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
公共科学图书馆一号。2016; 11（2）：e0149113。
2016年2月11日在线发布。 数字对象标识：10.1371/新闻稿.0149113
预防性维修识别码：项目经理4751086
PMID：26866605

ESCRT-0亚单位STAM2核心区复合体中HD-PTP Bro1结构域的结构研究

Juhyeon Lee公司,1,2 Kyoung-Jin哦,三 达索姆·李,三 Bo Yeon Kim先生,4 Joon Sig Choi先生,2 Bonsu Ku公司,1,*和金升军（Seung Jun Kim）1,*
尤金·A·珀尔米亚科夫，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

EGFR在细胞增殖和生存信号传递中起着关键作用，其分选为MVB以最终溶酶体降解是由内胚层膜上多个ESCRT复合物的协调控制的。HD-PTP是一种细胞溶质蛋白酪氨酸磷酸酶，通过其N末端Bro1结构域与ESCRT-0蛋白STAM2和ESCRT-III蛋白CHMP4B相互作用，与EGFR贩运相关。有趣的是，另外两种人类Bro1结构域蛋白Alix和Brox的同源结构域结合CHMP4B，但不结合STAM2，尽管它们的结构非常相似。为了阐明这种结合特异性，我们确定了与STAM2核心区域结合的HD-PTP Bro1结构域的复杂结构。STAM2与HD-PTP Bro1结构域的疏水凹面口袋结合，就像CHMP4B与Alix、Brox或HD-PTP口袋结合一样，但方向相反。至关重要的是，HD-PTP的Thr145，对应于Alix的Lys151和Brox的Arg145，被揭示为使该蛋白能够结合STAM2的决定簇残基，因为该残基的Alix或Brox模拟突变阻断了分子间相互作用。因此，这项工作为HD-PTP如何识别ESCRT-0组件以控制EGFR排序提供了结构基础。

介绍

表皮生长因子受体（EGFR）是一种著名的细胞表面受体酪氨酸激酶，是细胞生存和生长的关键调节因子之一。其异常表达或不受控制的活性直接与多种肿瘤有关[1]. 表皮生长因子和转化生长因子α等配体与表皮生长因子受体胞外结构域的结合触发胞内结构域的同二聚体化和自磷酸化。许多下游信号转导级联随后启动，最终导致细胞增殖和分化，并阻断凋亡[2,三]. EGFR活性由依赖于氯氰菊酯的内吞作用控制，在这种内吞作用中，内化的EGFR被再循环回质膜，或被泛素化并并入多泡体（MVB）的管腔内小泡（ILV）中，以转运至溶酶体进行降解[4,5]. 泛素化货物对MVB的分选主要由运输机械（ESCRT）所需的内胚体分选复合体介导，该复合体由五种多蛋白复合体（ESCRT-0、-I、-II、-II和Vps4-Vta1）以及辅助成分组成[6,7]. 此外，据报道，多种蛋白质与ESCRT蛋白相互作用以调节EGFR的分类，例如Alix[8]、严重急性呼吸系统综合征和RNF11[9]，UBE4E[10]和His结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（HD-PTP；也称为PTPN23）[11].

HD-PTP是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），包含五个结构域（Bro1、V、中心富含脯氨酸、PTP和第二富含脯氨酸结构域）。据报道，该蛋白对内皮细胞运动具有负调节作用[12,13]并起到假定的抑癌作用[14,15]. 大量证据也表明HD-PTP和近视，HD-PTP的同源物黑腹果蝇，参与MVB的形态发生和包括整合素在内的货物蛋白的内体分选[16]、无翼和无翼[17]和EGFR[11,18]Bro1域是这些进程所必需的。然而，PTP酶活性、肿瘤抑制能力和HD-PTP的运输调节作用之间的确切关系仍有待阐明。

迄今为止，已发现两种ESCRT成分与HD-PTP的Bro1结构域相互作用：ESCRT-0蛋白信号转导适配器分子2（STAM2）[11]和携带ESCRT-III蛋白的多泡体蛋白4B（CHMP4B）[19,20]. STAM2结合肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）形成ESCRT-0异二聚体，启动MVB通路，其多个泛素结合域在内胚层膜聚集泛素化EGFR[7,21]. CHMP4B是环状ESCRT-III丝的核心亚单位之一，通过芽生和剪断进行膜重塑，这对成熟ILV的形成至关重要[21,22]. 最近的一份报告表明，HD-PTP是EGFR分类的中央调节器，其作用是协调EGFR从含STAM2的ESCRT-0向含CHMP4B的ESCRT-III的转移[11]. 在此，我们确定了STAM2的350–370残基对于直接结合HD-PTP的Bro1结构域是必要的和足够的，并确定了配合物的结构，分辨率为2.0º。结构比对和基于结构的突变体研究共同发现了一个关键的决定簇残基，HD-PTP中的Thr145对应于Alix中的Lys151和Brox中的Arg145，它定义了STAM2结合选择性，有利于HD-PTP的Bro1结构域而不是Alix和Brox的Bro1结构域。

结果

STAM2中HD-PTP Bro1域结合区的说明

此前，据报道，HD-PTP的Bro1结构域与STAM2的核心区域相互作用，影响残基260-416，酵母双杂交和共免疫沉淀试验证明了这一点[11]. 为了验证这两种蛋白质之间的直接结合，我们制备了含有残基1–361的重组HD-PTP Bro1结构域（称为HD-PTP（1–36l））和含有残基260–370的STAM2核心区域（称为STAM2（260–370））(图1A). 我们排除了STAM2的371-416残基，因为这些残基被预测不会形成二级结构(S1图)因此推测与HD-PTP（1-361）的结合作用无关。尺寸排除色谱（SEC）分析表明，这两种蛋白质确实直接相互作用(图1B，顶部面板）。为了阐明精确的结合区域，我们将STAM2（260-370）分为两个片段，STAM2和STAM2(图1A). 随后的色谱分析确定HD-PTP与STAM2（311-370）结合，但不与STAM2（260-310）结合(图1B、中间和底部面板）。接下来，我们使用等温滴定量热法（ITC）检测并量化了HD-PTP（1-361）与三种STAM2肽的相互作用，这三种肽分别含有STAM2的310-330、330-350和350-370残基(图1C). STAM2的350–370个残基被称为STAM2（350–370），被鉴定为结合HD-PTP（1–361）的必要和充分的残基，其结果是K（K）D类6.06μM的值(图1C，第三个面板）。我们还使用ITC证实STAM2肽妥协残基371-416不能结合HD-PTP（1-361）(图1C，第四个面板）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0149113.g001.jpg
HD-PTP（1-361）与STAM2核心区域的相互作用。

（A） 测试STAM2结构是否与HD-PTP结合（1–361）。残基数旁边表示的是每个构建体是否与HD-PTP（1-361）（B）使用Superose 6 10/300 GL凝胶过滤柱的SEC分析结果相互作用。标准蛋白尺寸标记物蓝色葡聚糖（空隙体积，V0)和卵白蛋白（75 kDa）用箭头表示。在每次分析中测试的蛋白质都表示出来(赖特). 通过SDS-PAGE和考马斯染色对HD-PTP和STAM2混合物洗脱液的峰分进行分析和可视化(左侧). S、 尺寸标记；一、 输入。（C） ITC分析。将每个0.5 mM STAM2肽滴定为50μM HD-PTP（1–361）。这个K（K）D类该值由每摩尔添加配体的积分热的曲线拟合得出。

与STAM2片段结合的HD-PTP Bro1结构域的结构测定

基于这一结果，我们随后尝试确定与STAM2（350–370）肽结合的HD-PTP（1–361）的复杂结构。我们的初步试验没有成功，因为即使蛋白质和肽在结晶前以1:5的摩尔比混合和孵育，得到的晶体（空间组P（P）1） 在不对称单元中包含四个HD-PTP（1–361）分子，但不包含STAM2（350–370），这是在结构测定后发现的(S2A和S2B图; PDB代码5CRU）。所有四个HD-PTP（1–361）单体与之前确定的HD-PTP Bro1结构域（PDB代码3RAU）的晶体结构非常匹配[20]根-平方偏差（RMSD）值在0.48–0.77º范围内。先前的研究表明，HD-PTP Bro1结构域与STAM2的结合可以通过天冬氨酸取代Leu202和Ile206而受到破坏，这意味着这些残基在结合相互作用中发挥作用[11]. 我们注意到，在我们的HD-PTP（1–361）结构中，这些残基（连同相邻残基Arg205、Ala336和Leu338）与相邻HD-PTP单体的Asn33和Tyr34形成亲水和疏水接触(S2C图)表明HD-PTP分子之间的晶体堆积相互作用将阻止STAM2（350–370）被容纳在HD-PTP（1–361）中。因此，为了改变晶体堆积并促进STAM2结合形式的结晶，我们制备了一种突变的HD-PTP（1-361）蛋白，其中Asn33和Tyr34被丙氨酸取代（称为HD-PTP，1-361；NAYA）。这种突变蛋白与野生型蛋白一样有效地结合STAM2（350–370）；这是通过ITC确认的(S3A图). 在HD-PTP（1–361；NAYA）和STAM2（350–370）肽之间以1:5的摩尔比孵育过夜后，我们使蛋白质样品结晶并获得具有空间基团的新晶体P（P）21在不对称单元中包含两个HD-PTP分子。利用这些晶体，我们最终确定了HD-PTP（1–361；NAYA）在STAM2（350–370）到2.0º(图2和S4图; PDB代码5CRV）。我们注意到，STAM2肽的相互作用以及N33A和Y34A突变的插入都不会诱导HD-PTP Bro1结构域的显著构象变化，因为我们的HD-PTP（1-361）和HD-PTP（1-361；NAYA）结构在355个排列的残基上以0.61Å的RMSD值叠加时，彼此非常重叠。然而，伴随着α1-α2环的轻微构象变化(S5A图)HD-PTP分子的排列在两种晶体形式中表现出显著的差异(S5B图)，这使得STAM2（350–370）可以容纳在HD-PTP（1–361；NAYA）中，并且可以确定复杂的结构。结晶数据统计汇总于表1。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0149113.g002.jpg
HD-PTP和STAM2相互作用的结构分析。

（A） HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）络合物的晶体结构。(左侧)这两种蛋白质以带状图的形式呈现，并根据它们在一级序列中的出现顺序标记二级结构。(赖特)复杂结构中显示的STAM2碎片的α-螺旋轮表示。在4℃范围内与HD-PTP接触的STAM2残留物被灰色半圆覆盖。（B-C）分子间疏水相互作用(B类)和水介导的氢键(C类). 棒中显示的是所有STAM2残基以及参与复合物形成步骤的HD-PTP残基。由三个水分子介导的氢键（如红色球体所示）用虚线表示。标记的是参与分子间相互作用的两个蛋白质残基。

表1

数据收集和结构优化统计。
数据收集HD-PTP（1-361）HD-PTP（1–361；NAYA）–STAM2（350–370）
“空间”组P（P）1P（P）21
单元单元尺寸
 a、 b，c（奥数）64.99, 66.87, 82.4281.65, 37.22, 140.02
 α, β, γ (°)89.9, 89.9, 89.890, 103.4, 90
波长（Ω）0.97950.9795
分辨率（Ω）50.0–2.4 (2.44–2.40)50.0–2.0 (2.03–2.00)
对sym（对称）(%)9.4 (60.2)6.4 (26.3)
我/σ(我)24.6 (3.3)30.4 (4.6)
完整性（%）98.3（97.9）97.3 (95.5)
冗余3.84.8
精炼
分辨率（Ω）50.0–2.450.0–2.0
反射次数5094854756
对工作/对自由的(%)22.0/25.9年21.3 / 24.1
风险管理与可持续发展部
 粘结长度（Ω）0.0050.003
 粘结角度（°）1.0120.701
平均B值（Ω2)46.534.3
Ramachandran图（%）
 最受欢迎98.496.9
 另外允许1.63.1

括号中的数字是外壳中分辨率最高的统计信息。

HD-PTP与STAM2的相互作用分析

Alix、Brox和HD-PTP是三种含有Bro1结构域的人类蛋白质，其结合ESCRT-III组分CHMP4B[20,23,24]. 与Alix或Brox类似，HD-PTP的Bro1域采用了一个回旋镖状折叠，其中包含一个凹形装订袋，CHMP4的C端尾部可以容纳在这里[20]. 在HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）复合物结构中，STAM2肽形成与HD-PTP结合的两亲性α-螺旋，主要通过疏水相互作用(图2A和2B和S6图). 具体而言，分子间疏水相互作用涉及STAM2的Val354、Leu358、Tyr361、Leu364和Val365，以及HD-PTP的Leu189、Leu202、Ile206、Ala336、Leu338和Lys141、Lys192和Arg198的烃类部分。具体而言，STAM2的Tyr361位于疏水簇的中心(图2B和S6图)表明该残基在络合物的形成中起着关键作用。经ITC测量证实，该残基的丙氨酸取代完全消除了两种蛋白质之间的结合作用(S3B图). HD-PTP的Leu202和Ile206参与疏水性相互作用，这与之前的突变研究结果一致，该研究表明这些残基的天冬氨酸取代（L/I-D/D突变）破坏了复合物的形成[11]. 除了疏水相互作用外，我们注意到由三个水分子介导的氢键也加强了HD-PTP和STAM2之间的分子间结合(图2C).

Thr145是HD-PTP结合STAM2的关键决定因素

乍一看，CHMP4B（207–224）和STAM2（350–370）主要通过其疏水残基以类似的方式结合到Bro1结构域的凹口袋。因此，我们将HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）复合物结构叠加到与CHMP4B肽结合的Alix的Bro1结构域的结构上（残基207–224；称为CHMP4B（207–244））。事实上，STAM2（350–370）和CHMP4B（207–224）在与Bro1结构域结合时重叠，参与分子间相互作用的两种蛋白质的疏水残基可以一一匹配(图3A). 因此，如前所述，ESCRT-III组件CHMP4B应与ESCRT-0组件STAM2竞争，并将其从HD-PTP的Bro1域中取代[11]. STAM2（350–370）和CHMP4B（207–224）之间的一个显著区别是它们以相反的方向与Bro1域关联(图3A，底部）。此外，虽然STAM2的残基354–367能够对应CHMP4B的残基211–224，但STAM2之前的残基35–353不对应，因为CHMP4B多肽终止于与STAM2 Val354匹配的Met224(图3A).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0149113.g003.jpg
三个Bro1结构域结合选择性的结构分析。

（A） HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）和Alix（1–359）−CHMP4B（207–224）（PDB代码3C3Q）复合体之间的结构比较。分子间疏水相互作用中的关键残基以棒状显示并标记。STAM2和CHMP4B残基在下面反向排列，垂直线与标记的残基匹配。（B） Alix的Bro1域和Brox都不能绑定STAM2（350–370）。ITC测量是通过将0.5 mM STAM2（350–370）肽滴定到50μM Alix（1–359）和Brox（1–374）蛋白中进行的。（C） Thr145是HD-PTP与STAM2结合的关键残基。HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）结构叠加在Alix（1–359）−CHMP4B（207–224）上(左侧)和Brox（1–377）−CHMP4B（207–224）（PDB代码3UM3）(中间)复合物。Alix的Lys151和Brox的Arg145对STAM2产生空间位阻，但HD-PTP的Thr145没有。(赖特)三个Bro1结构域残基均未对CHMP4B产生空间位阻。（D） Thr145的突变阻止HD-PTP（1-361）与STAM2（350-370）结合。通过将0.5 mM STAM2（350–370）肽滴定为50μM HD-PTP蛋白来进行ITC测量。显示STAM2（350–370）和HD-PTP（1–361）之间相互作用的左图与图1C，包括在此图中进行比较。（E） CHMP4B（207–224）与HD-PTP（1–361）相互作用，与Thr145残基突变无关。将0.5 mM CHMP4B（207–224）肽滴定为50μM HD-PTP蛋白K（K）D类推导了数值。

尽管Bro1域之间的总体结构相似，Ali最近的一份报告等表明Alix的Bro1结构域与STAM2没有共沉淀，这与HD-PTP的不同[11]. 因此，我们使用ITC验证了Bro1域和STAM2核心区域之间的交互。事实上，与HD-PTP（1–361）不同，Alix的Bro1结构域（残基1–359）和Brox（残基1-374）都不与STAM2（350–370）相互作用(图3B)，尽管HD-PTP与STAM2结合的关键残基在Alix和Brox中大多是保守的(S7图). 因此，我们研究了叠加的复杂结构。有趣的是，我们发现STAM2残基351-353在决定蛋白质的结合伙伴方面起着关键作用；在叠加模型中，该区域与Alix的Lys151和Brox的Arg145侧链产生空间位阻，但与HD-PTP的相应残基Thr145的侧链没有空间位阻(图3C; 左侧和中间面板）。在HD-PTP与STAM2形成络合物的分子间相互作用中，苏氨酸残基起初并不是关键残基。事实上，HD-PTP（1–361）Thr145的丙氨酸取代并没有消除其与STAM2（350–370）的结合(S3C图). 然而，结构叠加分析表明，HD-PTP中该位置的苏氨酸，而不是Alix中的赖氨酸和Brox中的精氨酸，有可能通过“避免”或“不制造”STAM2螺旋的空间位阻来促进复合物的形成。为了证实这一假设，我们制备了两种突变的HD-PTP（1–361）蛋白：Alix-模拟HD-PTP的蛋白（1–3651；T145K）和Brox-模拟的蛋白（1-361；T145 R）。在ITC实验中，HD-PTP（1–361；T145K）和HD-PTP(图3D)证明了我们在STAM2和Bro1结构域之间的相互作用中发现的空间位阻的重要性。否则，CHMP4B不包含对应于STAM2残基351–353的残基，导致空间位阻(图3C; 右侧面板）。因此，我们预测Thr145的突变不会影响HD-PTP和CHMP4B之间的相互作用。这也通过ITC得到了证实；CHMP4B（207–224）与野生型和HD-PTP突变蛋白结合良好(K（K）D类值小于8μM；图3E和S3D图)如预期。总的来说，这些结果表明Thr145是HD-PTP的一个独特的功能决定簇残基，它可以使蛋白质在没有空间位阻的情况下结合到STAM2的核心区域。

接下来，通过下拉分析确认人类细胞中STAM2、CHMP4B和HD-PTP的Bro1结构域之间的相互作用。为了专注于Bro1结构域介导的分子间结合，并排除STAM2的SH3结构域与HD-PTP的中心富含脯氨酸结构域之间的额外结合的影响[11]在人类胚胎肾293（HEK293）细胞中瞬时表达标记HD-PTP（1–712）变体以及HA标记CHMP4B和STAM2蛋白，并进行免疫沉淀分析。由于全长STAM2的低表达水平(图4A)对STAM2（1-370）和STAM2进行免疫沉淀。结果表明，STAM2确实与HD-PTP（1–712）相互作用，但仅与HD-PTP1（1–71 2；T145K）反应很弱(图4B; 第三和第四列），证明HD-PTP的残基Thr145在与STAM2结合中的重要性。相比之下，CHMP4B与HD-PTP（1–712；T145K）以及HD-PTP(图4C)，这与我们的结构分析和约束测量一致。我们还证实，STAM2与HD-PTP的结合被STAM2的Tyr361的丙氨酸取代而消除(图4B; 第三和第六列），这两种蛋白质分子间疏水相互作用的关键残基（参见图2B和S6图).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0149113.g004.jpg
HD-PTP与STAM2或CHMP4B之间的协同免疫沉淀分析。

用指示的构建物瞬时转染HEK293细胞，STAM2蛋白的表达水平(A类)或HD-PTP与STAM2的分子间相互作用(B类)或使用CHMP4B(C类)用免疫沉淀法和免疫印迹法检测。

讨论

正如先前的研究所表明的，HD-PTP的回旋镖形Bro1结构域与Alix或Brox的结构域具有相当大的序列和结构相似性(S7图，下表）。加上它们的结构相似性，已知所有三种Bro1结构域蛋白都通过其凹袋与ESCRT-III组分CHMP4B相互作用。虽然Brox在蛋白质分类中的作用尚未明确，但HD-PTP和Alix均被确定参与EGFR到MVB的分类[8,11]. 尽管如此，尽管有这些相似之处，Alix、Brox和HD-PTP也有其独特的结构特征，使这三种蛋白质具有不同的功能和特异性。例如，在人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的释放过程中，只有Alix的Bro1结构域起作用，尽管这三个结构域都能与HIV-1 Gag蛋白的核衣壳结构域相互作用[25,26]. 结构研究表明，这是由于一个独特的Phe105环仅存在于Alix的Bro1域中，这对HIV-1的释放至关重要[20,27]. 另一方面，CHMP5的C末端尾部与Brox的Bro1结构域结合，但不与Alix或HD-PTP的Bro1区域结合，其中Brox的非融合Tyr348在构成CHMP5β发夹结构的独特结合囊中起着关键的结构作用[24]. 同样，我们的结构和生物化学研究对STAM2与HD-PTP的Bro1结构域的结合选择性提供了合理的解释，而不是Alix或Brox；由于存在苏氨酸残基而不是赖氨酸或精氨酸，避免了空间位阻，这是HD-PTP Bro1结构域的关键特征，使该蛋白质能够在其结合囊中容纳STAM2。

在HD-PTP和Alix中，但在Brox中，Bro1域后面是V域（HD-PTP的残基362-699）。这两个V结构域具有17%的序列一致性和45%的相似性，并且据报道两者都与Lys63连接的多泛素链相互作用[28–30]. Alix的V域也为YPX提供了绑定模块三蛋白酶激活受体1的L基序[31]、YPXn个HIV和其他病毒的Gag蛋白p6结构域的L晚域基序，需要它来进行病毒出芽[32,33]. Alix的V结构域中与这些基序相关的残基在HD-PTP中也大多保守，包括关键的苯丙氨酸残基（Alix的Phe676；HD-PTP的Phe668）[34]. 有趣的是，Stefani的一项研究等解决了泛素相关蛋白1（UBAP1），一种参与EGFR分选到MVB的ESCRT-I成分，结合HD-PTP的V结构域，但不结合Alix的相应结构域[35]，提供了另一种通过Alix选择性结合HD-PTP的ESCRT蛋白。HD-PTP的Phe678的天冬氨酸取代消除了其与UBAP1的相互作用，表明UBAP1结合区可能与推测的YPX重叠n个HD-PTP中的L基序结合区。因此，我们认为，与HD-PTP Bro1结构域和ESCRT-0组分STAM2一样，有必要对HD-PTP的V结构域进行结构研究，以阐明其与UBAP1选择性结合的基础，这也可能有助于理解HD-PTP在EGFR排序中的确切作用和功能

在这项工作中，我们发现STAM2的残基350–370构成HD-PTP结合区域，并在与STAM2核心片段的复合物中呈现HD-PTP的Bro1结构域的晶体结构。我们进一步描述了HD-PTP的Bro1结构域的结构特征，将其与Alix或Brox的结构特征区分开来，并通过结构分析、ITC结合测量和共免疫沉淀分析进行了验证。我们相信，这些结构信息将成为未来调查的合理基础，以揭示EGFR贩运的整体工作机制，EGFR贩运因与细胞生存和癌症信号直接相关而备受关注。

材料和方法

与STAM2（350–370）结合的HD-PTP（1–361）和HD-PTP的制备、结晶和结构测定

通过聚合酶链反应扩增编码人类HD-PTP Bro1结构域（残基1–361）的DNA片段，并将其克隆到pET28a质粒（Novagen）中，该质粒用作模板，用于制备含有N33A和Y34A取代的HD-PTP突变形式。野生型或突变型HD-PTP蛋白产生于E类。大肠杆菌BL21（DE3）RIL菌株（Novagen），18°C，并使用Ni-NTA柱（QIAGEN）进行初步纯化。去除N端（His）后6-通过TEV蛋白酶处理，使用HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤柱（GE Healthcare）进一步纯化蛋白质，该凝胶过滤柱与含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、200 mM NaCl、10%（v/v）甘油和10 mM二硫苏糖醇的缓冲溶液平衡。最终的HD-PTP蛋白样品以1:5的摩尔比与从Peptron（韩国）购买的20 mer STAM2肽（残基350–370）混合。通过混合和平衡0.2μL蛋白质溶液（33 mg/mL）和0.3μL沉淀剂溶液（含0.03 M HEPES钠（pH 7.3）、16%（w/v）聚乙二醇3350、0.67%（w/v）胰蛋白胨和0.03 M尿素），在18°C下通过坐滴蒸汽扩散法获得HD-PTP（1–361）晶体。在数据收集过程之前，将HD-PTP（1–361）晶体短暂浸入低温保护剂溶液中，该溶液与储液溶液相同，但含有42%（w/v）聚乙二醇3350。HD-PTP（1–361；NAYA）−STAM2（350–370）晶体是通过将0.2μL蛋白质溶液（24 mg/mL）与含有0.1 M Bis-Tris（pH 7.0）、30%（w/v）聚乙二醇3350和4%（v/v）乙腈的0.8μL沉淀溶液混合并平衡，在18°C下通过坐滴蒸汽扩散法获得的。在收集数据之前，将复合晶体短暂浸泡在低温保护剂溶液中，该溶液为储液溶液加5%甘油。衍射数据是在韩国浦项加速器实验室的光束线5C上收集的，并使用该程序进行处理香港（HKL）2000 [36]. 通过分子替换法和Phaser程序确定结构[37]使用HD-PTP的Bro1域结构[20]作为搜索模型。节目Coot[38]和PHENIX[39]分别用于建模和细化。结晶数据统计汇总于表1。

重组蛋白和肽的制备

将编码人类STAM2核心区域的每个DNA片段（残基260-370/260-310/311-370）克隆到pET28a质粒中，目的是产生一个与麦芽糖结合蛋白N末端融合的蛋白，以及一个（His）6-标签。将编码HD-PTP Bro1结构域的每个DNA片段（包含T145K、T145R或T145A替换、Alix（残基1-359）和Brox（残基1-374））克隆到pET28a质粒中。这些蛋白质是在E类。大肠杆菌BL21（DE3）RIL菌株在18°C下，使用Ni-NTA柱和HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤柱进行纯化。从Peptron（韩国）购买了合成的STAM2肽，其中21肽段（残基330-350/350-370/350-370，含Y391A取代基）、20肽段（残留311-330）和46肽段（残余371-416），以及18肽段的CHMP4B肽（残基207-224）。

等温滴定量热仪

所有测量均在2°C的iTC200微量热量测定系统（GE Healthcare）上进行。用含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）和100 mM NaCl的溶液透析蛋白质样品。在测量之前，对样品进行离心以去除任何残留物。在单独的实验中测量稀释焓（滴定液进入缓冲液），并从蛋白质和滴定液之间的结合焓中减去。使用Origin软件（OriginLab Corp.）分析数据。

免疫印迹和免疫沉淀

通过聚合酶链反应扩增编码HA–STAM2（完整）、HA–STAM1（1–370）、HA-CHMP4B和Flag–HD-PTP（1–712）的每个DNA片段，并克隆到pcDNA3.1/FRT/TO（Invitrogen）。通过定点突变产生HA–STAM2（完整；Y361A）、HA–STAM2（1–370；Y361A）和Flag–HD-PTP（1–361；T145K）。48小时后收集转染这些构建物的HEK293细胞（ATCC），并在含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%Nonide P40、0.5%脱氧胆酸钠和1mM EDTA的缓冲液中溶解，补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）。用抗HA琼脂糖（Sigma-Aldrich）或抗Flag M2琼脂糖进行免疫沉淀。使用抗HA（1:5000）（Santa Cruz）和抗Flag M2（1:500）（Sigma Aldrich）通过western blot分析免疫沉淀蛋白。使用HSP90抗体（1:5000）（Santa Cruz）以确保载荷相等。通过增强化学发光检测（Amersham）显示特定蛋白带。

接入号码

HD-PTP（1-361）和HD-PTP（1-361；NAYA）在与STAM2（350-370）的复合物中的坐标以及结构因子已分别以5CRU和5CRV的登录代码存储在蛋白质数据库中。

支持信息

S1图

STAM2核心区二级结构预测。

此预测是从PSI-PRED服务器获得的(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/). STAM2残基Leu260、Val370和Gln416用红色三角形表示。

（畅通节能法）

S2图

HD-PTP（1-361）的晶体结构。

（A） HD-PTP（1-361）的结构以带状图的形式呈现。次要结构的标签根据其在主要序列中的出现顺序表示。（B） C类α空间群晶体不对称单元中HD-PTP（1–361）四个分子的微量P（P）1.（C）晶体堆积相互作用。来自一个分子（以橙色显示）的Asn33和Tyr34与来自相邻分子（以浅蓝色显示）的Arg205和四个疏水残基（Leu202、Ile206、Ala336和Leu338）接触。虚线圆圈强调分子间的疏水相互作用。

（畅通节能法）

S3图

ITC测量。

通过将0.5 mM指示肽滴定为50μM野生型，进行ITC测量(B类)或突变型(A类,C类-D类)HD-PTP蛋白。

（畅通节能法）

S4图

立体2Fo-Fc省略了STAM2的地图（350–370）。

STAM2（350–370）片段位于图2B用木条和2Fo-Fc电子密度省略图表示（灰色网格；轮廓为1.0σ）。

（TIF）

S5图

比较HD-PTP（1–361）和HD-PTP分子（1–3651；NAYA）。

（A） 引入两个突变引起的HD-PTP构象变化。针对突变的两个残基显示在木条中并进行标记。虚线表示C的移动αTyr34的原子被丙氨酸取代。（B） HD-PTP分子在晶体中的堆积。HD-PTP（1–361）和HD-PTPα踪迹。为清楚起见，省略了STAM2（350–370）。HD-PTP（1-361）的摩尔A和B在同一不对称单元中；HD-PTP（1–361；NAYA）的分子A、A'和A''不是对称相关的。

（畅通节能法）

S6图

分子间疏水相互作用。

HD-PTP（1-361；NAYA）在绑定到STAM2片段的表面模型中表示，以绿色显示。参与分子间疏水接触的残留物（五种来自STAM2，七种来自HD-PTP；参见图2B)被标记。棒状图中显示的是标记的STAM2残基；黄色是标记的HD-PTP残留物侧链的碳氢化合物部分。

（畅通节能法）

S7图

基于结构的序列对齐。

HD-PTP、Alix和Brox的Bro1域的序列基于结构比较进行对齐。HD-PTP的二级结构显示在一起。保存的残留物以青色为底色。调整STAM2绑定的键残留物以红色显示，并以黑色矩形突出显示。星号表示参与STAM2结合的HD-PTP残基。序列和结构线形统计如下所示。

（畅通节能法）

致谢

本研究使用了韩国浦项加速器实验室的束线5C。我们感谢Byung-Ha Oh教授（韩国高级科学技术研究所）、Kyong-Seok Ryu博士和Jung-Hye Ha博士（韩国基础科学研究所）对ITC实验的帮助。

资金筹措表

这项工作得到了韩国国家研究基金会（2011-0030027和2015M3A9B5030308；给SJK）和世界一流研究所项目（WCI 2009-002；给BYK）的资助，该项目由科学、信息通信技术和未来规划部资助。这项工作还得到了韩国生物科学和生物技术研究所创新研究倡议项目的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

工具书类

1Kolch W，Pitt A（2010年）功能蛋白质组学解析癌症中酪氨酸激酶信号通路。Nat Rev癌症 10: 618–629. 10.1038/编号2900[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
2赫布斯特RS（2004）表皮生长因子受体生物学研究进展。国际放射肿瘤生物物理杂志 59: 21–26. [公共医学][谷歌学者]
三。Bazley LA，Gullick WJ（2005）表皮生长因子受体家族。内分泌相关癌 12 补充1：S17–27。[公共医学][谷歌学者]
4Goh LK，Sorkin A（2013年）受体酪氨酸激酶的胞吞作用。冷泉Harb Perspect生物 5：a01745910.1101/csh个人观点a017459[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
5Tomas A、Futter CE、Eden ER（2014）EGF受体贩运：信号转导和癌症的后果。趋势细胞生物 24: 26–34. 2016年10月10日/j.tcb.2013.11.002[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
6Hurley JH、Hanson PI（2010）ESCRT机器的膜出芽和断裂：都在颈部。Nat Rev Mol细胞生物学 11：556–566。10.1038/编号2937[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
7Schuh AL，Audhya A（2014）ESCRT机制：从质膜到内胚体再回到内胚体。生物化学与分子生物学评论 49: 242–261. 10.3109/10409238.2014.881777[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
8孙S、周X、张伟、盖利克·GE、匡J（2015）解开Alix在MVB排序和激活EGFR沉默中的关键作用。生物化学杂志 466: 475–487. 10.1042/BJ20141156[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
9Kostaras E、Sflomos G、Pedersen NM、Stenmark H、Fotsis T、Murphy C.（2013）SARA和RNF11相互作用，并与ESCRT-0核心蛋白相互作用，调节降解EGFR的贩运。癌基因 32: 5220–5232. 10.1038/一次2022.554[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
10Sirisaengtaksin N、Gireud M、Yan Q、Kubota Y、Meza D、Waymire JC等（2014）UBE4B蛋白结合泛素化和分选机制，使表皮生长因子受体（EGFR）降解。生物化学杂志 289: 3026–3039. 10.1074/jbc。M113.495671号[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
11Ali N、Zhang L、Taylor S、Mironov A、Urbe S、Woodman P（2013）招募UBPY和ESCRT交换驱动EGFR到MVB的HD-PTP依赖分拣。当前生物 23：453–461。10.1016/j.cub.2013.02.033[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
12Castiglioni S、Maier JA、Mariotti M（2007）酪氨酸磷酸酶HD-PTP：一种新的内皮细胞迁移因子。生物化学-生物物理研究委员会 364: 534–539. [公共医学][谷歌学者]
13Mariotti M、Castiglioni S、Garcia-Manteiga JM、Beguinot L、Maier JA（2009年）HD-PTP通过与Src的相互作用抑制内皮细胞迁移。国际生物化学杂志-细胞生物学 41: 687–693. 2016年10月10日/j.bicel.2008.08.005[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
14曹磊、张磊、鲁伊兹·洛扎诺·P、杨Q、钱克雷、格雷厄姆·RM等（1998）一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶含有BRO1样结构域并抑制Ha-ras介导的转化。生物化学杂志 273：21077–21083。[公共医学][谷歌学者]
15Tanaka K、Kondo K、Kitajima K、Muraoka M、Nozawa A、Hara T（2013）miR142-3p microRNA过度表达导致睾丸生殖细胞肿瘤中23型蛋白酪氨酸磷酸酶的肿瘤抑制功能丧失。生物化学杂志 288: 23990–23999. 10.1074/jbc。M113.478891号[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
16陈岱、李明明、吴SY、林毅、蔡世平、赖萍等（2012）Bro1-domain-containing protein近视/HDPTP与Rab4协同调节细胞粘附和迁移。细胞科学杂志 125：4841–4852。10.1242/jcs.108597[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
17Pradhan Sundd T，Verheyen EM（2014）Bro1-domain-containing protein近视在Wnt/Wingless内体转运中的作用。求文献一篇 392: 93–107. 2016年10月10日/j.ydbio.2014.04.019[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
18Doyotte A、Mironov A、McKenzie E、Woodman P（2008）Bro1相关蛋白HD-PTP/PTPN23是内胚体货物分类和多泡体形态发生所必需的。《美国科学院院刊》 105: 6308–6313. 10.1073/pnas.0707601105[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
19Ichioka F、Takaya E、Suzuki H、Kajigaya S、Buchman VL、Shibata H等人（2007）HD-PTP和Alix共享一些与Bro1结构域或富含脯氨酸区域相互作用的膜交通相关蛋白。Arch Biochem生物物理 457: 142–149. [公共医学][谷歌学者]
20Sette P、Mu R、Dussup V、Jiang J、Snyder G、Smith P等（2011）Alix Bro1域的Phe105环在HIV-1释放中起着关键作用。结构 19: 1485–1495. 2016年10月10日/j.str.2011.07.016[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
21Schmidt O，Teis D（2012）ESCRT机械。当前生物 22：R116–120。2016年10月10日/j.cub.2012.01.028[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
22Adell MA、Vogel GF、Pakdel M、Muller M、Lindner H、Hess MW等人（2014）MVB囊泡形成过程中Vps4与ESCRT-III的协同结合驱动膜颈收缩。J细胞生物学 205: 33–49. 10.1083/jcb.201310114[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
23McCullough J、Fisher RD、Whitby FG、Sundquist WI、Hill CP（2008）人类ESCRT途径中的ALIX-CHMP4相互作用。《美国科学院院刊》 105: 7687–7691. 10.1073/pnas.0801567105[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
24Mu R、Dussup V、Jiang J、Sette P、Rudd V、Chuenchor W等（2012）两种不同的结合模式定义了Brox与CHMP5和CHMP4B的C末端尾部的相互作用。结构 20: 887–898. 2016年10月10日/j.str.2012.03.001[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
25Popov S、Popova E、Inoue M、Gottlinger HG（2009）分歧的Bro1结构域共享结合人类免疫缺陷病毒1型核衣壳的能力，并增强病毒样颗粒的产生。J维罗尔 83: 7185–7193. 10.1128/JVI.00198-09[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
26Dussup V、Javid MP、Abou-Jaoude G、Jadwin JA、de La Cruz J、Nagashima K等人（2009）HIV-1 Gag的核衣壳区域与PTAP和LYPXnL晚期结构域合作，以招募病毒出芽所需的细胞机制。公共科学图书馆-病理学 5：e100033910.1371/日志第1000339页[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
27翟Q、兰德斯曼MB、罗宾逊H、威斯康星州桑德奎斯特、希尔CP（2011）HIV-1出芽过程中Bro1结构域蛋白BROX的结构和ALIX-Bro1结构域的功能分析。公共科学图书馆一号 6：e2746610.1371/journal.pone.0027466[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
28Dowlatshahi DP、Sandrin V、Vivona S、Shaler TA、Kaiser SE、Melandri F等人（2012）ALIX是一种Lys63特异性多泛素结合蛋白，在逆转录病毒芽变中起作用。开发人员单元格 23: 1247–1254. 2016年10月10日/j.devcel.2012.10.023[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
29Keren-Kaplan T、Attali I、Estrin M、Kuo LS、Farkash E、Jerabek-Willemsen M等人（2013）泛素结合域的基于结构的电子鉴定提供了对ALIX-V的见解：泛素复合物和逆转录病毒出芽。欧洲工商管理硕士J 32: 538–551. 10.1038/emboj.2013.4[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
30Pashkova N、Gakhar L、Winistorer SC、Sunshine AB、Rich M、Dunham MJ等人（2013）酵母Alix同源物Bro1作为泛素受体发挥作用，将蛋白质分选成多泡内体。开发人员单元格 25: 520–533. 2016年10月10日/j.devcel.2013.04.007[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
31Dores MR、Chen B、Lin H、Soh UJ、Paing MM、Montagne WA等（2012）ALIX结合GPCR PAR1的YPX（3）L基序并介导泛素无关的ESCRT-III/MVB排序。J细胞生物学 197: 407–419. 10.1083/jcb.201110031[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
32Lee S、Joshi A、Nagashima K、Freed EO、Hurley JH（2007）病毒晚域与Alix结合的结构基础。自然结构分子生物学 14: 194–199.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Fisher RD、Chung HY、Zhai Q、Robinson H、Sundquist WI、Hill CP（2007）ALIX/AIP1的结构和生化研究及其在逆转录病毒芽变中的作用。单元格 128: 841–852. [公共医学][谷歌学者]
34Kimura Y、Tanigawa M、Kawawaki J、Takagi K、Mizushima T、Maeda T等人（2015）酵母Bro1家族V结构域与YP（X）nL基序靶蛋白相互作用的保守模式。真核细胞 14: 976–982. 10.1128/约00091-15[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
35Stefani F、Zhang L、Taylor S、Donovan J、Rollinson S、Doyotte A等（2011）UBAP1是内切体特异性ESCRT-I复合物的组成部分，对MVB分选至关重要。当前生物 21: 1245–1250. 10.1016/j.cub.2011.06.028[公共医学][交叉参考][谷歌学者]
36Otwinowski Z，Minor W（1997）振荡模式下采集的x射线衍射数据的处理。酶学方法 276: 307–326. [公共医学][谷歌学者]
37McCoy AJ、Grosse Kunstleve RW、Adams PD、Winn MD、Storoni LC、Read RJ（2007）相位晶体学软件。应用结晶仪 40: 658–674.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Emsley P、Cowtan K（2004）Coot：分子图形的建模工具。Acta Crystallogr D生物晶体仪 60: 2126–2132. [公共医学][谷歌学者]
39Adams PD、Afonine PV、Bunkoczi G、Chen VB、Davis IW、Echols N等人（2010年）PHENIX：基于Python的大分子结构溶液综合系统。Acta Crystallogr D生物晶体仪 66: 213–221. 10.1107/S0907444909052925[PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者]
文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃