Sestrin2是mTORC1途径的亮氨酸传感器

摘要

长期以来，人们认识到，亮氨酸除了是一种蛋白质原氨基酸外，还是一种直接调节动物生理学的信号分子，包括饱腹感(1)，胰岛素分泌(2)，和骨骼肌合成代谢(三,4)。因为肝脏代谢亮氨酸的能力很低，所以它的血液浓度随消耗量而波动，因此饮食中的亮氨酸可以直接影响生理(5–7)。亮氨酸作用的关键介质是mTORC1蛋白激酶(8,9)它通过控制蛋白质和脂质合成以及自噬等过程来调节生长。

除亮氨酸外，许多环境信号调节mTORC1途径，包括精氨酸等其他氨基酸，以及葡萄糖和各种生长因子和应激形式(10,11)。mTORC1如何感知和整合这些不同的输入尚不清楚，但很明显，Rheb和Rag鸟嘌呤三磷酸酶（GTPases）具有必要但不同的作用。Rheb是一种单体GTP结合蛋白，Rags作为与RagC或RagD结合的RagA或RagB的专性异二聚体发挥作用(12–14)。Rheb和Rag GTPase都至少部分定位于溶酶体表面(15–18)是mTORC1调控的重要场所(19)。氨基酸以Rag依赖性的方式促进mTORC1向溶酶体的移位，其中Rheb如果与GTP结合，则刺激其激酶活性。生长因子通过将其GTPase激活蛋白（GAP）、结节性硬化（TSC）复合物从溶酶体表面驱赶出去，触发大黄的GTP负载(18).

氨基酸对Rag GTPases的调节是复杂的，许多不同的因素都有重要作用(20)。含有Ragulator、SLC38A9和空泡腺苷三磷酸酶（v-ATP酶）的溶酶体相关超复合物与Rag GTPases相互作用，是氨基酸激活mTORC1所必需的(21–24)。Ragulator将Rag异二聚体锚定在溶酶体上，并对RagA和RagB具有核苷酸交换活性(21,25)。SLC38A9是一种氨基酸转运体和潜在的溶酶体精氨酸传感器(23)但v-ATP酶在mTORC1激活中的功能尚不清楚。两种GAP复合物通过Rag GTPases刺激GTP水解，GATOR1作用于RagA和RagB(26)RagC和RagD上的卵泡蛋白（FLCN）-卵泡蛋白相互作用蛋白2（FNIP2）(27)。单独的GATOR2复合物通过未知机制负调控GATOR1，是mTORC1激活所必需的(26)。最后，Sestrins是GATOR2相互作用蛋白，抑制mTORC1信号传导，但其分子功能未知(28,29).

多年来，mTORC1上游的氨基酸传感器一直难以捉摸。而SLC38A9是检测溶酶体精氨酸的有力候选者(23)，长期寻找的亮氨酸传感器未知。我们证明Sestrin2是mTORC1通路的亮氨酸传感器。

亮氨酸直接调节Sestrin2-GATOR2相互作用

氨基酸激活mTORC1需要五聚体GATOR2复合物(26)。虽然其分子功能尚不清楚，但上位性实验表明GATOR2抑制GATOR1，GAP抑制RagA和RagB及其抑制剂(26)。在细胞内，Sestrin2以氨基酸敏感的方式与GATOR2结合(28,29)去除和重新添加培养基中的所有氨基酸，分别诱导和逆转相互作用(28)。虽然几种氨基酸可以调节mTORC1信号传导，但精氨酸和亮氨酸是最好的确定方法，在不同的细胞类型中，两者的剥夺都会强烈抑制mTORCl(8,30,31)在人类胚胎肾293T（HEK-293T）细胞中，从细胞培养基中去除亮氨酸或精氨酸，抑制了核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）磷酸化所读出的mTORC1信号传导，达到类似程度。然而，令人惊讶的是，只有亮氨酸缺失才导致Sestrin2与GATOR2结合，从而像完全的氨基酸饥饿一样有效地诱导相互作用(图1A)。亮氨酸再添加迅速逆转了结合，氨基酸不影响WDR24和Mios之间的相互作用，Mios是GATOR2的两个核心成分(图1A、和第1部分).

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图1

亮氨酸（而非精氨酸）干扰细胞中的Sestrin2-GATOR2相互作用在体外

A） 稳定表达FLAG-WDR24（GATOR2的一种成分）的HEK-293T细胞中Sestrin2与GATOR2结合。细胞被剥夺亮氨酸、精氨酸或所有氨基酸50分钟。如有指示，用亮氨酸、精氨酸或所有氨基酸再刺激细胞10分钟，并用细胞裂解物制备FLAG免疫沉淀物。免疫沉淀物和裂解物通过免疫印迹法分析所指示的蛋白质。FLAG-meta2作为阴性对照。

B） 亮氨酸和精氨酸对氨基酸保护细胞的冰镇洗涤剂裂解液中Sestrin2-GATOR2相互作用的影响。稳定表达FLAG-meta2或FLAG-WDR24的HEK-293T细胞被剥夺所有氨基酸50分钟。将亮氨酸或精氨酸添加到培养基或细胞裂解物中，并按（A）所述制备和分析FLAG免疫沉淀物。

C） 单个氨基酸对纯化的Sestrin2-GATOR2复合物的影响。从稳定表达FLAG-meta2或FLAG-WDR24的HEK-293T细胞中制备FLAG免疫沉淀，并去除所有氨基酸50分钟。将指示的氨基酸（300µM）直接添加到免疫沉淀物中，重新清洗后，对其进行分析，如（A）所示。

D） 亮氨酸破坏纯化的Sestrin2-GATOR2复合物。除使用了指示浓度的亮氨酸或精氨酸外，实验按（C）进行和分析。

E） 异亮氨酸和蛋氨酸对Sestrin2-GATOR2相互作用的干扰。除使用了指示浓度的异亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸或精氨酸外，实验按（C）进行和分析。

Sestrin2与另外两种蛋白质Sestrin1和Sestrin3同源(32–34)当这三种蛋白过度表达时，它们都能与GATOR2相互作用(28)。与Sestrin2一样，亮氨酸饥饿和刺激强烈调节内源性Sestrin1与GATOR2的相互作用(图S1B)。相反，内源性Sestrin3与GATOR2结合，与亮氨酸浓度无关(图S1B)这表明这种相互作用是结构性的，或由尚待定义的信号调节。

虽然亮氨酸触发的酶反应可能介导亮氨酸对Sestrin2-GATOR2相互作用的影响，但人们很容易认为亮氨酸可能直接作用于复合物。与这种可能性相一致的是，将亮氨酸而不是精氨酸添加到被剥夺所有氨基酸的细胞的冰镇洗涤剂裂解液中，在与激活细胞的亮氨酸刺激作用相同的程度上消除了这种相互作用(图1B)。更有趣的是，当直接添加到从氨基酸衍生细胞分离的免疫纯化Sestrin2-GATOR2复合物中时，亮氨酸也破坏了相互作用。在每种300µM测试的18种氨基酸中，只有与亮氨酸最相似的氨基酸（蛋氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）对Sestrin2-GATOR2相互作用有任何影响在体外(图1C).

当添加到纯化的复合物中时，亮氨酸剂量依赖性地破坏Sestrin2-GATOR2复合物，在约1µM时有一半最大效应(图1D)。蛋氨酸和异亮氨酸的效力相对较弱，作用浓度分别约为亮氨酸的10倍和25倍(图1E)。这些值仅反映了这些氨基酸的相对效力，因为没有达到平衡条件，因为大的分析体积阻止了Sestrin2在解离后重新结合到GATOR2。

Sestrin2将亮氨酸与K_d日20µM

鉴于亮氨酸破坏了纯化的复合物，我们推断亮氨酸可能直接与Sestrin2或GATOR2结合。为了验证这一点，我们开发了一种平衡结合分析法，将固定在琼脂糖珠上的纯化蛋白质与放射性氨基酸孵育，并在洗涤后定量结合氨基酸。放射性标记的亮氨酸与Sestrin2结合，但与WDR24、GATOR2复合物或控制蛋白Rap2A结合的方式与过量的非放射性标记亮氨酸完全竞争(图2A)。相反，精氨酸不与Sestrin2或Rap2A结合(图S2A)。与Sestrin1-和Sestrin3-GATOR2复合物对亮氨酸的不同敏感性相一致，Sestrin1与亮氨酸的结合程度与Sestring2相似，而Sestrin3结合非常弱(图2B和S2A公司).果蝇属dSestrin（CG11299-PD）也结合亮氨酸，尽管含量低于人类蛋白质(图S2B和C).

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图2

Sestrin2将亮氨酸与K_d日20µM

A） 放射性标记的亮氨酸与Sestrin2结合，但不与WDR24、GATOR2或控制蛋白Rap2A结合。从瞬时表达指示蛋白或复合物的HEK-293T细胞制备的FLAG免疫沉淀物用于与[^三H] 方法中描述的亮氨酸。在指定位置添加未标记的亮氨酸。值为一个代表性实验的3个技术重复的平均值±SD。SDS-PAGE和Coomasie蓝染色用于分析与结合分析中包含的免疫沉淀平行制备的免疫沉淀。星号表示WDR24和GATOR2纯化中的分解产物。

B） Sestrin1（两种异构体）、Sestrin2和Sestrin3的亮氨酸结合能力。制备FLAG免疫沉淀物，并进行结合分析，如（A）所示。

C） 亮氨酸与细菌产生的Sestrin2结合，但不与RagA/RagC异二聚体结合。按照方法中所述进行亮氨酸结合分析，并使用与Ni-NTA树脂结合的His-MBP-Sestrin2或His-RagA/RagC进行分析（A）。

D） 在热位移分析中亮氨酸和精氨酸对细菌产生的Sestrin2熔化温度的影响。His-MBP-雌激素与含有或不含亮氨酸或精氨酸的Sypro橙色染料孵育。加热样品后，捕获荧光变化，并用于计算所示条件下的熔化温度（Tm）。数值为3个重复的平均值±标准偏差。

E） Sestrin2将亮氨酸与K_d日20µM。按照（A）制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM或20µM的结合分析[^三H] 亮氨酸和未标记亮氨酸的指示浓度。在所示的代表性图表中，每个点代表10µM测定中n=3的归一化平均值±SD[^三H] 亮氨酸。这个K_d日根据六个实验的结果计算得出（三个10µM，三个20µM[^三H] 亮氨酸）。

F） 蛋氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[^三H] 亮氨酸和未标记蛋氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K_我使用三个实验的数据进行计算。

G） 异亮氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[^三H] 亮氨酸和未标记异亮氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K_我使用三个实验的数据进行计算。

由于所有这些蛋白都是在人HEK-293T细胞中表达并纯化的，因此，与Sestrin2（和Sestrin1）共同纯化的未知蛋白在形式上仍然可能是亮氨酸的实际受体。为了解决这种可能性，我们在细菌中制备了人Sestrin2，这是一种不编码Sestrin同源物甚至TOR通路的异源系统。与在人类细胞中制备的Sestrin2获得的结果一致，放射性标记的亮氨酸与细菌产生的Sestrin2结合，但不与用作对照的RagA-RagC异二聚体结合(图2C)。此外，在热位移分析中，亮氨酸（而非精氨酸）将细菌产生的Sestrin2的熔化温度改变了8.5°C，但没有改变两种对照蛋白的熔化温度(图2D和S2E–F型)。总之，这些数据强烈证明亮氨酸直接与Sestrin2结合。

虽然热位移分析对于评估蛋白质结合配体的能力很有价值，但这种方法不适合获得准确的K_d日(35)。因此，我们使用了一种竞争结合试验，通过增加未标记亮氨酸的数量来确定亮氨酸具有K_d日对于20±5µM的Sestrin2(图2E)。相比之下，蛋氨酸和异亮氨酸以抑制常数竞争亮氨酸结合(K_我)分别为354±118µM和616±273µM(图2F和G)。这些值大约是亮氨酸对Sestrin2亲和力的十八分之一和三十分之一，并且与亮氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸在干扰Sestrin2-GATOR2相互作用中的相对效力密切相关在体外(图1D和E).

Sestrin2通过GATOR2调节mTORC1

与亮氨酸通过调节Sestrin2与GATOR2的结合来调节mTORC1一致，20–40µM亮氨酸对HEK-293T细胞中的Sestrin2-GATOR2相互作用和mTORC2活性有一半最大的影响(图3A和B)。该浓度范围包括K_d日表明Sestrin2对亮氨酸的亲和力与生理相关。

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图3

Sestrin2通过GATOR2调节mTORC1

A） 通过S6K1磷酸化测定不同亮氨酸浓度对mTORC1活性的影响。HEK-293T细胞被剥夺亮氨酸50分钟，并用指示浓度的亮氨酸重新刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物中的指示蛋白质和磷酸化状态。

B） 不同亮氨酸浓度对Sestrin2-GATOR2相互作用的影响。如（A）所示，稳定表达所示蛋白的HEK-293T细胞被饥饿，并收集FLAG免疫沉淀物。用指示浓度的亮氨酸处理免疫纯化复合物，然后按图1C.

C） Sestrin2 S190W突变体的GATOR2结合能力降低。从瞬时表达指示蛋白的HEK-293T细胞制备FLAG免疫沉淀，并通过免疫印迹分析指示蛋白。

D） Sestrin2 S190W亮氨酸结合能力的测定。进行分析并分析免疫沉淀物，如图2A.

E） 在表达Sestrin2 S190W的Sestrin1-3三重零细胞中，mTORC1通路无法检测到亮氨酸的缺失。使用CRISPR/Cas9系统生成的野生型HEK-293T细胞和Sestrin1-3三重零HEK-293 T细胞表达所示的FLAG标记蛋白。细胞缺亮氨酸50分钟，如有指示，用亮氨酸刺激10分钟，并通过免疫印迹分析裂解产物。

为了正式测试Sestrin2是否通过与GATOR2相互作用来调节mTORC1，我们鉴定了一个Sestrin1突变体（S190W），该突变体仍然结合亮氨酸，但结合GATOR2的能力严重下降(图3C和D)。在Sestrin1-3三重缺失HEK-293T细胞中，mTORC1信号传导活跃，不受亮氨酸剥夺的影响(图3E)。在这些细胞中，野生型Sestrin2的表达恢复了mTORC1途径的亮氨酸敏感性，但Sestrin2S190W的表达没有影响(图3E)。因此，Sestrin2必须能够与GATOR2相互作用，mTORC1途径才能感知亮氨酸的缺失。

为了使亮氨酸激活mTORC1，Sestrin2必须能够结合亮氨酸

为了测试Sestrin2的亮氨酸结合能力是否对mTORC1感知亮氨酸的存在是必要的，我们鉴定了两个Sestrin1突变体，L261A和E451A，它们在一定程度上不结合亮氨酸(图4A)。亮氨酸对突变体与GATOR2的相互作用没有显著影响在体外，与Sestrin2介导亮氨酸对Sestrin2-GATOR2复合物的影响一致(图4B)。野生型Sestrin2在Sestrin1-3三零细胞中的表达恢复了这些细胞中mTORC1途径的亮氨酸敏感性，但任何一种突变体的表达都抑制了信号传导，使其对亮氨酸不敏感(图4C和S3A系列)。此外，在表达突变体的Sestrin1-3三零细胞中，亮氨酸存在时，mTOR在溶酶体中的定位降低，而RagC的定位不受影响(图S4A–D)。因此，亮氨酸激活mTORC1需要亮氨酸与Sestrin2结合。

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图4

Sestrin2结合亮氨酸的能力是mTORC1途径感知亮氨酸所必需的

A） Sestrin2 L261A和E451A突变体不结合亮氨酸。进行结合分析并分析免疫沉淀物，如图2A.

B） Sestrin2 L261A或E451A与GATOR2相互作用的亮氨酸敏感性。从瞬时表达所示蛋白的细胞中制备FLAG免疫沉淀。用指示浓度的亮氨酸处理免疫沉淀物，并按图1C.

C） 在表达Sestrin2 L261A或E451A的Sestrin1-3三重空细胞中，mTORC1通路不能检测到亮氨酸的存在。细胞的生成和分析如图3E.

D） 该模型显示了不同隔室中多个传感器产生的氨基酸输入如何影响Rag GTPases以控制mTORC1活性。

结论

Sestrin2有几个特性，与它作为mTORC1途径的亮氨酸传感器一致：（1）它以与亮氨酸被感测浓度一致的亲和力结合亮氨酸；（2） 不结合亮氨酸的Sestrin2突变体不能向mTORC1发出亮氨酸存在的信号；（3）Sestrin2及其同源物的丢失使mTORC1通路对亮氨酸的缺失不敏感。虽然我们还没有对Sestrin1进行彻底的研究，但它的行为似乎与Sestrin2类似，因此我们认为，Sestring1和Sestring2是mTORC1上游的亮氨酸传感器。

鉴于Sestrin2对蛋氨酸有明显的亲和力，如果在亮氨酸浓度较低而蛋氨酸浓度较高的环境中，Sestrin1可以作为mTORC1途径的蛋氨酸传感器，这也就不足为奇了。

Sestrin2与GATOR2结合并可能抑制GATOR2，但这如何导致mTORC1的抑制尚待阐明GATOR2的分子功能。此外，还需要进行结构研究，以了解亮氨酸与Sestrin2的结合如何破坏其与GATOR2的相互作用，以及为什么亮氨酸与Sestrin3的结合非常差。

由于Sestrin1和Sestrin2是可溶蛋白质，因此它们很可能感测到胞浆中的游离亮氨酸。尽管这些浓度未知K_米据报道，亮氨酸的人类亮氨酸-tRNA合成酶（LRS）为45µM(36)，这与Sestrin2对亮氨酸的亲和力相似，表明胞浆游离亮氨酸浓度在这个范围内。与Sestrin2一样，LRS可以以低于亮氨酸的亲和力结合异亮氨酸和蛋氨酸（LRS的亲和力约为30倍）(36)。Sestrin2和LRS的氨基酸结合特性之间的相似性支持了这样的观点，即Sestrin1对亮氨酸的亲和力和特异性足以使其用作亮氨酸传感器。

我们的工作提出了一个模型，在该模型中，来自不同细胞隔室中不同氨基酸传感器的信号汇聚在溶酶体表面的Rag GTPases上，以调节mTORC1活性(图4D)。假定的精氨酸传感器SLC38A9可能监测溶酶体内容物，而Sestrin2几乎可以肯定是一种细胞溶质传感器。RagC和RagD的GAP上游也必须有一个氨基酸传感器，即FLCN-FNIP2复合物，但其身份和细胞定位未知。未来的挑战是阐明Rag GTPase如何整合来自不同传感器的输入，这可能需要更好地了解异二聚体中每个Rag的功能。此外，体内需要对不同传感器进行表征，以了解特定组织如何适应氨基酸传感路径以满足其特定需求。

鉴于Sestrin2（和Sestrin1）可能具有亮氨酸结合囊，这些蛋白质可能是开发mTORC1途径小分子调节剂的靶点。亮氨酸减弱老年人骨骼肌蛋白质合成的减少并刺激饱腹感(1,37)。因此，能够有效模拟亮氨酸对Sestrin2的影响的小分子可能具有治疗价值。此外，热量限制（CR）抑制mTORC1信号(38,39)并且与多种生物的健康寿命和寿命增加有关(40,41)。因此，拮抗亮氨酸对Sestrin2作用的小分子可能具有CR-mimicking特性。

补充材料

致谢

脚注

参考和注释