纤维化的特征是细胞外基质（ECM）在损伤组织内和周围过度沉积，是未经检查的创伤愈合反应的结果。如果不能解决，纤维化可能导致永久性瘢痕形成、器官衰竭，最终导致死亡(1,2). 值得注意的是，纤维化导致多种疾病的发病，包括慢性肝肾疾病、限制性肺病、心力衰竭和角膜盲。发达国家约45%的人死于纤维化疾病(三)并对公共卫生系统造成重大负担；然而，目前几乎没有可用的治疗方案。因此，需要进一步了解控制纤维化反应的分子导管，以促进下一代抗纤维化治疗的发展。
在细胞水平上，肌成纤维细胞可以说是器官纤维化最重要的细胞介质。为了应对各种各样的损伤，包括但不限于机械挑战、炎症、感染、代谢失衡和恶性肿瘤，肌成纤维细胞被激活并获得增殖、收缩和ECM生成的成纤维特性。由于肌成纤维细胞的持续激活，纤维胶原逐渐沉积，最终导致薄壁组织被ECM带分隔，这是组织纤维化的组织学特征。虽然肌成纤维细胞的细胞前体是多种多样的，但介导其活化的核心途径在多个组织中得到了很好的确立和保护。实验证明，这些核心通路的异位激活可驱动系统性纤维化表型，反过来，这些活性的药物衰减在临床环境中对纤维化症状的管理似乎有效。因此，以维持肌成纤维细胞活化的细胞内和细胞间通路为靶点，可能成为对抗进展性纤维化并发症的一种有吸引力的治疗策略。
肝脏是人体的中央稳态器官，非常适合探索纤维化的分子机制，因为肝星状细胞（HSC）已被确定为肝肌成纤维细胞的主要前体细胞。在健康肝脏中，HSC是维甲酸和含脂基质细胞，位于窦内皮和肝细胞之间的Diss空间。肝损伤使HSC对旁分泌刺激敏感，而旁分泌刺激最终会激活HSC释放其脂质和维甲酸存储，发生显著的表型变化，并转分化为肌成纤维细胞。从机制上讲，几个关键途径驱动HSC激活，最显著的是血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子-β（TGF-β）信号。虽然目前正在开发的大多数抗纤维化策略侧重于这些信号通路所需的细胞外分子或自主受体，但表观遗传调控在器官纤维化形成中的作用及其治疗潜力仍不清楚。
在这里，我们研究了基因增强子在HSC向肌成纤维细胞转变中的作用，目的是了解组织纤维化的基因组基础。这些研究表明，溴代多巴胺相关蛋白4（BRD4）是溴代多巴素和末端外（BET）家族成员和重要的表观遗传读取器，对HSC中增强子介导的前纤维化基因表达至关重要(4–6). 睫状体分析显示BRD4集中于数百个与参与多个纤维化前途径的基因相关的增强子。使用小分子抑制剂JQ1抑制BRD4-enhancer相互作用，显著阻断HSC激活，并显著降低其增殖能力。此外，在四氯化碳（CCl4)-BRD4抑制剂不仅可以阻止HSC活化，而且可以逆转纤维化的许多临床特征。这些发现将BRD4介导的增强子确定为肝纤维化的关键基因组调控因子，并为纤维化疾病的内在表观遗传易损性提供了机制性见解，可用于药物干预。
结果
BRD4介导激活HSC中的Profibrotic反应。
我们之前对决定肌成纤维细胞纤维化反应的转录因子之间的基因组串扰的证明表明，调节增强子是组织纤维化的关键基因组介质(7). 研究表明，对其活性的选择性调控可以全面解除纤维化基因网络。我们假设表观遗传途径对肌成纤维细胞的纤维化前反应很重要，特别是考虑到它们在确定细胞和组织特性以及调节疾病相关增强子活性方面的关键作用(8). 为了支持这一观点，基于RNAi的遗传学筛查牵连到BET家族成员BRD4(9)作为LX-2细胞纤维化反应的潜在调节器，人活化HSC细胞系(10). siRNA-介导的BRD4缺失导致第1列基因表达，组织纤维化的重要ECM成分(). 重要的是，BRD4的损耗也相应减少第1列主要促纤维化细胞因子TGF-β1存在时的水平(2,三) (). 为了进一步探讨BRD4在纤维化中的作用，我们比较了三种结构不同的BRD4溴代烷抑制剂JQ1的作用(9)，I-BET-151(11,12)和PFI-1(13)在纤维化前基因表达中。值得注意的是，无论是否存在TGF-β1，这三种抑制剂都能全面抑制纤维化前基因的表达(). 此外，染色质免疫沉淀（ChIP）研究表明BRD4与第1列增强子位点和这种占有率通过JQ1治疗显著降低()提示BRD4在调节纤维化前基因表达中起直接作用。
BRD4调节激活HSC基因组的纤维化前反应。(A类)通过RT-qPCR测定用或不用TGF-β1处理的对照（siCNTL）或BRD4特异性（siBRD4）siRNA-转染的LX-2细胞中COL1A1的表达（5 ng/mL，16 h）。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). (B类)经BRD4抑制剂（JQ1 500 nM；I-BET 500 nM和PFI-1 500 nM）处理的LX-2细胞中，无论是否含有TGF-β1（5 ng/mL，持续16 h），纤维化前基因表达的倍数变化。用载体（DMSO）处理的细胞中的基因表达水平被任意设置为1。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。(C类)强度图显示了ChIP-碎片密度的等级聚集，作为启动子区域（转录起始位点的±2 kb）外具有统计意义的H3K27ac峰（FDR=0.0001）中心距离的函数。BRD4（黑色）位置0附近的强度表明BET/H3K27ac位点重叠，H3K17ac（绿色）作为阳性对照。(D类)LX-2细胞中BRD4 ChIP-Seq信号强度相对于其结合位点中心的图（16小时±500 nM JQ1）。(E类)对位于LX-2细胞BRD4峰100 bp以内的最丰富基序进行从头分析（FDR=0.0001），并绘制文氏图，描绘LX-2电池中BRD4和ETS1/SRF/NF-κB/SMAD3基因组结合位点的重叠。
BRD4在激活的HSC中靶向纤维化前增强因子。(A类)用DMSO（载体）或JQ1（500 nM，16 h）处理的LX-2细胞中COL1A1增强子区域的ChIP-qPCR。数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM，一式三份。(B类)LX-2细胞中BRD4靶基因的基因本体分析（MSigDB）。
接下来，为了描述将BRD4与纤维化基因网络联系起来的分子机制，我们检查了BRD4结合相对于组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）的全基因组分布，这是使用ChIP结合深度测序（ChIP-Seq）的活性增强子的表观遗传标记。值得注意的是，BRD4与H3K27ac标记的活性增强子共定位()这意味着BRD4通过调控增强子元件参与纤维化前基因的转录调控。我们进一步测定了在没有或存在抑制剂JQ1的情况下，这些增强子区域BRD4结合的变化。正如预期的那样，由此产生的顺反流显示，JQ1治疗显著降低了这些活性增强剂的BRD4占用率(). 对BRD4结合位点的进一步研究表明，ETS1等显著的纤维化前转录因子的基序显著丰富(14)、SRF(15)SMAD3和NF-κB(16) (). 由于所有这些因子都与细胞增殖和肝星状细胞激活密切相关，因此观察这些因子与BRD4之间的巨大重叠很有意思，这意味着肝星状上皮细胞增殖和激活密切相关。随后对这些前纤维化转录因子的基因组位置进行表征，发现与BRD4位点重叠>40%，与从头开始的基序分析一致(). BRD4假定靶基因的基因本体（GO）分析包括主要的纤维化途径，如局部粘附、ECM-受体相互作用、整合素信号、平滑肌收缩、PDGF信号、NF-κB信号和JNK/MAPK信号(5,17) (). 结果表明，BRD4在介导纤维化前转录因子调节纤维化基因网络中起着关键作用。
BRD4抑制剂阻止HSC激活成肌成纤维细胞。
BRD4增强子控制纤维化前基因表达的内在能力促使我们在传统HSC-肌成纤维细胞自我激活系统中，利用综合化学遗传学和功能基因组学研究其在肌成纤维母细胞激活中的调节潜力(). 这种体外自发分化概括了关键的细胞事件，如伤口愈合，这是星状细胞激活的典型特征(18–20). 为了监测这种转化过程中的基因表达变化，在静止的原代HSC（基线检查第1天）和肌成纤维细胞转化过程中（第3天和第6天），在没有或存在JQ1的情况下进行mRNA-Seq。该分析确定了HSC激活期间超过900个上调基因，其中超过400个被JQ1治疗抑制(). 基于JQ1介导的最高抑制程度的基因表达变化表明，BRD4在HSC激活期间调节诱导基因表达(). 对JQ1抑制的诱导基因的进一步基因本体分析表明，BRD4促进了广泛生物过程和细胞成分的表达，已知这些生物过程和成分在HSC转分化为肌成纤维细胞和肝纤维化中起关键作用(). 这些包括细胞外区域、细胞外基质、胶原、整合素、肌肉收缩和局灶性粘附，与LX-2细胞中BRD4靶基因的GO分析一致(). 值得注意的是，在HSC激活肌成纤维细胞期间，JQ1治疗抑制关键标记基因的诱导，包括第1a1列,学报2,第1a2列、和设计接近基线水平(和)表明BRD4对肌成纤维细胞活化至关重要。事实上，JQ1治疗HSC足以阻止与转分化为肌成纤维细胞相关的表型变化(). 特别是，JQ1处理的细胞不采用活化诱导的特征性成纤维细胞样形态。此外，JQ1显著降低平滑肌肌动蛋白（ACTA2）水平，并显著增加接近静止细胞水平的脂质含量（第1天）().
BRD4抑制阻断HSC激活。(A类)DMSO（0.1%）或JQ1（500 nM）处理的原代活化HSC在不同时间点（第3天和第6天）的选定诱导基因的折叠变化。使用对数对行和列进行欧氏聚类2-转化的mRNA-Seq表达数据，n个=每个治疗组3个。子弹（红色）表示关键纤维化标记基因：第1a1列,第1a2列,学报2、和设计. (B类)JQ1抑制的激活诱导基因的基因本体（GO）分析（MSigDB）。(C类)用DMSO（0.1%）或JQ1（500nM）处理的静止（第1:D1天）和激活（第6:D6天）原发性HSC的代表性图像：亮场(顶部)，Acta2免疫荧光染色(中部)和BODIPY染色(底部). （比例尺，50μm）(D类)通过Western blot分析测定ACTA2的表达。(E类)脂肪细胞的定量C类数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生的未配对t吨测试***P（P）< 0.001).
BRD4抑制抑制HSC激活成肌成纤维细胞期间的纤维化前基因表达。(A类)描述体外HSC自我激活系统的图表。(B类)激活期间诱导的基因总数（红色）和JQ1（蓝色）对该诱导的抑制。(C类)显示褶皱变化的火山图(x个轴）和DMSO（蓝色阴影）在两个时间点（第3天和第6天）和第1天（红色阴影）上调。从浅色渐变到深色渐变表示时间在增加（第3天和第6天）。(D类)DMSO（0.1%）或JQ1（500 nM）处理的原代活化HSC在不同时间点（第3天和第6天）的选定诱导基因的折叠变化。使用对数对行和列进行欧氏聚类2-转化的mRNA-Seq表达数据，n个=每个治疗组3个。项目符号（红色）表示关键的纤维化标志基因：第1a1列,第1a2列,学报2、和设计. (E类)第1a1列,学报2,倾倒1、和设计用DMSO或JQ1（500 nM）处理指定时期的原代小鼠HSC的qRT-PCR分析。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
BRD4是HSC激活的关键有丝分裂调节因子。
活化的HSC在肝纤维化中的病理作用不仅包括在单个细胞中诱导纤维化前基因，还包括活化细胞增殖以帮助修复组织损伤的必要性(4,5,17). 鉴于在，我们检测了BRD4抑制是否也会抑制HSC增殖。有趣的是，JQ1以剂量依赖的方式对活化的HSC表现出显著的抗增殖活性(). 为了排除这种影响是由细胞凋亡增加或细胞衰老引起的可能性，我们进行了TUNEL测定(和)并测定β-半乳糖苷酶活性(和). 我们证实JQ1抑制细胞增殖，支持BRD4作为HSC增殖的有丝分裂调节因子。此外，JQ1治疗显著降低了活化HSC中BrdU的掺入(). JQ1对细胞增殖的抑制作用可能迫使细胞进入静止期；然而，这需要进一步评估。鉴于PDGF信号在肌成纤维细胞有丝分裂中的重要性(21)我们的发现是PDGF通路被BRD4增强子直接靶向()我们推测BRD4在功能上与该途径沟通，以调节活化HSC中的增殖。与这个概念一致，JQ1治疗选择性地破坏了关键PDGF通路成分的诱导Pdgfrb公司以及下游有丝分裂靶点抄送1(22)HSC激活期间无扰动抄送2或Myc公司表达式(). 在LX-2细胞中也得到了类似的结果(). 这些发现支持BRD4不仅控制纤维化前基因的表达，而且作为肌成纤维细胞活化的关键有丝分裂调节器发挥作用的建议。
BRD4抑制剂阻断激活HSC增殖。(A类)在显示的JQ1浓度下，活化HSC的正常增殖活性。(B类)通过TUNEL分析测量JQ1处理的（500 nM）HSC的凋亡。(C类)通过β-半乳糖苷酶染色测量JQ1处理的（500 nM）HSC的细胞衰老。(D类)BrdU纳入对照（DMSO）和JQ1处理（500 nM）HSC。(E类)基因表达的折叠变化Pdgfrb公司,抄送1,抄送2、和Myc公司用RT-qPCR测定用二甲基亚砜或JQ1（500 nM）处理的原代HSC。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). （比例尺，50μM。）
在HSC激活成肌成纤维细胞期间，JQ1没有明显的促凋亡或促生作用。(A类)在指定时间点用二甲基亚砜或JQ1（500 nM）处理的原代小鼠HSC中TUNEL染色的代表性图像。(B类)β-半乳糖苷酶染色的代表性图像，用于测量在指定时间点用DMSO或JQ1（500 nM）处理的原代小鼠HSC的衰老。
激活的人类HSC中BET抑制剂的抗增殖特性。抗增殖活性(A类)JQ1和(B类)I-BET-151对抗LX-2细胞。(C类)用二甲基亚砜或JQ1/I-BET-151（500 nM）处理LX-2细胞72小时后的BrdU掺入试验(D类)用TUNEL法检测用DMSO或JQ1/I-BET-151（500 nM）处理72 h的LX-2细胞的凋亡。(E类)通过β-半乳糖苷酶染色检测用二甲基亚砜或JQ1/I-BET-151（500 nM）处理72 h的LX-2细胞的细胞衰老。(F类)用二甲基亚砜或JQ1/I-BET-151（500 nM）处理LX-2细胞72小时后进行PDGFRB和CCND1 RT-qPCR分析。数据表示至少三次独立实验的平均值±SEM，共三次。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). （比例尺，50μM。）
BRD4抑制对肝纤维化有保护作用。
JQ1能够减弱HSC激活的多个方面，这使我们评估BRD4抑制作为肝纤维化的潜在药物治疗。在标准四氯化碳（CCl）中4)小鼠肝损伤模型()CCl 4周后，C57BL/6J小鼠出现广泛的桥接性纤维化和大量胶原沉积4暴露。尽管JQ1不会改变CCl的范围4-通过血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平评估诱导性肝损伤()，联合治疗显著降低了纤维化的组织学指标以及HSC活化标记物第1a1列,学报2,倾倒1、和Tgfb1型(和). 此外，JQ1治疗结合CCl4抑制肝脏中关键纤维化标记基因网络的诱导(). 此外，HSC激活标记ACTA2()，天狼星红染色，肝羟脯氨酸含量()和组织学纤维化评分（Ishak评分，)在JQ1处理的小鼠中均显著减弱。
BRD4抑制可防止肝纤维化。(A类)天狼星红(左侧)苏木精和曙红（H&E，赖特)4周载体肝脏染色[玉米油加2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD），n个=5]，JQ1（玉米油加JQ1 50 mg/kg i.p。，n个=5），四氯化碳（CCl40.5 mL/kg加上HP-β-CD i.p。，n个=10）和CCl4加上JQ1(n个=8）处理的C57BL/6J小鼠。（比例尺，250μm）(B类)所述肝脏样本中选定的纤维化前基因的折叠变化A类使用日志对行和列进行欧几里德聚类2-转化的信使核糖核酸序列表达数据，n个=每个治疗组3个。(C类)ACTA2免疫组织化学在肝脏样本中的描述A类.纤维化的量化标准(D类)H&E染色（Ishak评分）(E类)羟脯氨酸含量，以及(F类)天狼星红染色。(G公司)ACTA2免疫组化染色定量C类数据表示平均值±SEM。统计意义如所示。
预防性肝纤维化模型的血清ALT和基因表达分析。(A类)预防性肝纤维化模型的给药方案。(B类)肝损伤用血清ALT测定(C类)肝脏Col1a1、Acta2、Tgfβ1和Timp1基因表达水平的qRT-PCR测量。数据表示平均值±SEM。星号表示统计显著差异（学生t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
JQ1是一种潜在的治疗肝纤维化的药物。
JQ1在体内外具有显著的抗纤维化特性，这让我们不禁要问，抑制BRD4是否可以作为一种干预疗法逆转肝纤维化。为了解决这个问题，通过3周CCl在C57BL/6J小鼠中启动肝纤维化4接触CCl4/JQ1联合治疗3周(). 尽管已经存在损伤，但JQ1似乎可以逆转或至少阻止肝纤维化的进一步发展，这是由组织学评分、天狼星红染色定量、肝羟脯氨酸含量和纤维化前标志物基因表达决定的(). 此外，CCl4-定量ACTA2免疫组织化学检测表明，JQ1治疗显著降低了诱导的HSC活化(). 总之，我们的研究结果表明，小分子介导的溴代多巴胺对BRD4的抑制具有改善肝纤维化的能力。
抑制BRD4对肝纤维化的治疗益处。(A类)治疗性肝纤维化模型的给药方案。(B类)6周龄C57BL/6J小鼠（CCl）的肝脏4,n个= 10; CCl公司4+JQ1、，n个=10）天狼星红染色(左侧)苏木精和曙红（H&E，赖特). （比例尺，250μm）纤维化定量(C类)H&E染色（Ishak评分）(D类)天狼星红染色，以及(E类)羟脯氨酸含量。(F类)肝脏表达第1a1列和时间1通过qRT-PCR测量。(G公司)HSC活化，通过ACTA2免疫组织化学测定。(H（H）)ACTA2免疫组化染色定量G公司. (我)肝脏表达学报2通过qRT-PCR测量。(J型)模型描述了BETs对肝纤维化的表观遗传控制。数据表示平均值±SEM。星号表示统计显著差异（学生的未配对t吨测试**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
讨论
纤维化是一种复杂的疾病，在细胞水平上由静止的HSC激活驱动，其特征是持续诱导纤维化基因程序。未减弱的纤维化，如病毒感染或脂肪性肝病，最终发展为肝衰竭，并导致肝细胞癌的主要病因。鉴于传统抗纤维化治疗通常以单一途径为目标，其有限的临床益处可能并不令人惊讶。因此，尽管最近FDA批准吡非尼酮（Esbriet）和硝苯地平（Ofev）作为一线抗纤维化治疗药物，但仍需要额外的新疗法。
我们最近对肝纤维化关键基因调控途径的研究表明，维生素D受体是肝脏维持和星状细胞活化的关键介质(7). 这项工作使我们探索了支持HSC激活和静止之间转换的表观遗传学基础。进一步的筛查分析确定BRD4是纤维化反应的有力驱动因素。BRD4结合在纤维化前基因远端增强子处的富集为损伤反应提供了先前未确定的机制性见解。事实上，BRD4抑制剂JQ1在预防肝损伤和逆转或限制现有纤维化进展方面的显著疗效部分是由于BRD4增强子对药物干预的敏感性增强。
总之，我们对BRD4介导的肝纤维化前增强因子活性的研究确定了内在基因组和表观遗传机制，这些机制可用于药物治疗以改善肝纤维化(). 鉴于肌成纤维细胞是几乎所有纤维化疾病的常见病理细胞类型，通过溴代多巴胺抑制作用靶向纤维化前增强剂可能对各种控制不良的瘢痕反应具有临床益处。
材料和方法
动物、细胞培养和试剂。
如先前报道的，通过原位蛋白酶、胶原酶灌注和单步Histogenz梯度从16周龄雄性C57BL/6J小鼠中分离原代HSC。LX-2细胞是Scott Friedman（纽约西奈山医学院）慷慨馈赠的礼物，按照前面所述进行培养(10). JQ1（Cayman Chemical）和CCl4（西格玛）按照每个实验中的指示进行处理。所有实验程序均已获得索尔克生物研究所动物护理和使用委员会的批准，并已获得其知情同意。
定量RT-PCR。
总RNA在TRIzol提取后纯化，并用DNaseI（生命技术）处理。使用iScript RT Supermix（Bio-Rad）进行cDNA合成。使用SYBR绿色试剂（Bio-Rad）进行技术性三倍定量PCR。采用相对标准曲线法进行定量（Bio-Rad）。通过归一化Gapdh（小鼠）或U36B4（人类）计算表达水平。
RNA-Seq和数据分析。
在DMSO或JQ1处理之前，从小鼠肝脏分离出的HSC在塑料上培养24小时（第1天），再培养2天（第3天）或5天（第6天），所有处理均使用生物复制品。使用TRIzol（Invitrogen）和RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）分离总RNA。使用安捷伦生物分析仪确认RNA纯度和完整性。从100 ng总RNA（TrueSeq v2，Illumina）制备文库，并对Illumiana HiSEq进行单端测序。2500，使用条形码多路复用和100-bp的读取长度，每个样本的平均读取量为34.1M。使用STAR完成读取对准和结查找(23)和Cuffdiff 2的差异基因表达(24)，使用加利福尼亚大学圣克鲁斯分校（UCSC）mm9作为参考序列。
基于RNAi的屏幕。
识别表观遗传调节剂的siRNAs在有无TGF-β的情况下转染到LX-2细胞之前，以96-well的形式进行电镀。72小时后，在Wafergene SmartChip平台上裂解细胞进行RNA提取和cDNA合成，然后进行高通量qPCR。基因表达被用作读数，以确定对纤维化反应重要的点击。
siRNAs的转染。
使用RNAiMax转染试剂（Invitrogen）以10 nM的指示siRNAs（Dharmacon）浓度进行转染。转染细胞在无干扰的情况下培养至少72小时，然后进行最终分析。
CCl公司4肝损伤和纤维化模型。
在预防性研究中，6周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射0.5 mL/kg体重CCl4（西格玛玉米油1:50 vol/vol）或玉米油每周三次，持续4周。JQ1（50 mg/kg体重）或溶媒[10%（wt/vol）（2-羟丙基）-β-环糊精（HP-β-CD）from Sigma]通过静脉注射每周给药五次，从第一剂量CCl开始4或者玉米油。最后一次CCl后72小时，动物被杀死4收集注射物和整个肝脏进行组织学、细胞学、生化和分子分析。在治疗研究中，6周龄雄性C57BL/6J小鼠首先腹腔注射0.5 mL/kg体重CCl4每周3次，持续3周，以建立肝纤维化。然后，同一研究组连续腹腔注射0.5 mL/kg体重CCl4每周三次，持续3周，JQ1（50 mg/kg体重）或载药（10%HP-β-CD）联合腹腔注射，每周五次。
胶原和羟脯氨酸含量的纤维化评分和定量。
福尔马林固定标本和石蜡包埋标本的5µm切片用苏木精-伊红（H&E）和天狼星红染色，并由病理学家审查，病理学家对实验条件一无所知。使用Ishak改良组织学活性指数（HAI）评分系统半定量评估肝纤维化。使用ImageJ软件对10个非相邻Sirius红色切片上的肝纤维化进行量化。采用羟脯氨酸测定定量肾纤维化。所有图像均使用安装在配备4×/0.13、10×/0.30、20×/0.50和40×/0.75 UplanFL N平面物镜的奥林巴斯显微镜上的高分辨率徕卡DFC420数码相机获得，并使用徕卡应用套件进行处理。使用Biovision（K555-100）的试剂盒测量组织羟脯氨酸含量。
血清ALT测定。
使用Thermo Scientific（TR71121）的试剂盒测量小鼠血清中的ALT活性。
细胞活性测定。
将原代HSC或LX-2细胞接种到96周的组织培养板上。24小时后，在使用CellTiter Glo试剂盒（Promega，G7571）进行基于荧光素酶的细胞存活率分析之前，用一系列浓度的JQ1处理细胞。
TUNEL测定。
在四孔室载玻片（Nalge Nunc，154917）上培养的原代HSC或LX-2细胞，使用死端荧光TUNEL系统（Promega，G3250）进行TUNEL分析。
细胞衰老染色。
使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell Signaling，9860s）对在含有DMSO（0.1%）或JQ1（500 nM）的四孔室载玻片（Nalge Nunc，154917）上培养的原代HSC或LX-2细胞进行衰老染色。
脂滴累积测定。
将原代小鼠HSC接种到培养箱载玻片上（Nunc）。过夜附着后，用二甲基亚砜或500 nM JQ1处理细胞5天。抽吸培养基，用PBS（Gibco）清洗细胞两次，并在室温下用10%（vol/vol）的福尔马林缓冲液固定15分钟。取下固定剂并用PBS清洗细胞三次。然后在室温下用1μg/mL 4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-Bora-3a，4a-二氮-s-二茂（BODIPY 493/503，分子探针）在避光条件下对细胞染色1 h。去除染料，用PBS清洗细胞三次，然后用Vectastain贴装介质（Vector Labs）贴装。在徕卡DM5000B荧光显微镜上，通过GFP滤光片观察荧光。使用DAPI（Vector）进行核复染。
免疫细胞化学。
将原代小鼠HSC接种到培养箱载玻片上（Nunc）。过夜附着后，用二甲基亚砜或500 nM JQ1处理细胞，再处理5天。抽吸培养基，用PBS（Gibco）清洗细胞两次，并在室温下用10%的福尔马林缓冲液固定15分钟。去除固定剂，并用PBS清洗细胞三次。然后用3%的BSA封闭载玻片，并在4°C下与兔抗ACTA2抗体（1:100稀释；Abcam）孵育过夜。清洗后，将载玻片与Alexa Fluor 546标记的驴抗兔IgG抗体孵育1小时（1:200稀释；Invitrogen）。最后，使用一体式荧光显微镜（BioZero BZ-9000；Keyence）对载玻片进行荧光分析。使用DAPI（Vector）进行核复染。
免疫组织化学。
肝脏样本脱蜡并在PBS中重新水化。在用靶回收液（Dako）回收抗原后，内源性过氧化物酶活性通过与0.3%过氧化氢孵育而被阻断。将切片浸泡在稀释的正常兔血清中后，在25°C下依次与兔抗ACTA2抗体（1:2000稀释；Abcam）和生物素化抗兔IgG二级抗体孵育1h，然后与生物素化酶结合亲和素孵育。将载玻片与二氨基联苯胺（Dojindo）孵育几分钟，使其显色。使用血红素（Sigma）进行反染色。
染色质免疫沉淀。
用二甲基亚砜（0.1%）或JQ1（500 nM）处理LX-2细胞16小时。然后收集细胞进行ChIP分析。ChIP的实验程序如前所述。简单地说，固定后，分离、裂解LX-2细胞的细胞核，并用Diagenode生物破坏者进行剪切，以产生200–1000 bp的DNA片段，然后使用下列抗体进行免疫沉淀：ETS1（Santa Cruz，sc-350）、SRF（Santa Cruz，sc-335）、NF-κB（Santa克鲁兹，sc-372）、SMAD3（Abacm，ab28379）、BRD2（Bethyl，A302-583A）、，BRD3（Bethyl，A310-859A）、BRD4（Bethlyl，A301-985A）(1)PAF1（Bethyl，A300-173A）(2)、CDK9（圣克鲁斯，sc-484）（D0913）、Pol II（圣克鲁兹，sc-899）（C1413），Pol II S2p（Abcam，ab5095）（GR104063-1）和Pol II S5p（Abacm，ab5131）（GR104 067-1）。
ChIP-Seq数据分析。
程序如前所述(7,25). 简单地说，使用Illumina CASAVA v1.8.2对短DNA读取进行解复用。使用Bowtie对准器将读数与人类hg18（NCBI构建36.1）对准，允许读数中出现最多两个不匹配。只有与基因组唯一对应的标签才被考虑用于进一步分析。随后，使用用于ChIP-Seq分析的软件套件HOMER进行峰值调用和基序分析。以下描述的HOMER方法已经实现，并且可以在biowhat.ucsd.edu/homer公司/。每个独特位置的一个标签被认为可以消除ChIP-Seq方案中片段克隆扩增产生的峰值。峰值是通过在一个200-bp的滑动窗口内搜索标签簇来确定的，要求相邻的簇之间至少相距1kb。确定有效峰值的标签数量的阈值是为<0.01的错误发现率（FDR）选择的，这是通过使用随机标签位置重复峰值发现过程根据经验确定的。要求峰值的标记数至少比输入或IgG对照样品多四倍（归一化为总计数），并且相对于本地背景区域（10 kb）多四倍，以避免识别具有基因组重复或非局部结合的区域。通过识别最近的RefSeq转录起始位点，将峰值注释到基因产物。ChIP-Seq结果的可视化是通过将自定义轨迹上传到UCSC基因组浏览器实现的。
统计。
所有数据均以平均值±SE表示。双尾未配对学生的t吨采用检验或单因素方差分析结合Bonferroni的多重比较来确定数据集之间差异的显著性。当P（P）≤ 0.05.
