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分子细胞。作者手稿；可在2015年12月28日的PMC中获得。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2011年7月22日；43(2): 275–284.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2011.07.006
PMCID公司：项目经理4691841
美国国立卫生研究院：尼姆斯744842
PMID：21777816

未修饰组蛋白H3R2的PHD指纹识别将UHRF1与常染色体基因表达调控联系起来

埃拉帕·拉贾库马拉,#2 王振田,#1 马红辉,1 胡露露,1 郝晨,1 阎琳,1 芮果,1 吴飞珍,1 李海涛,三 费兰,4 余江热那石,1,5 徐燕慧,1,6 丁肖·J·帕特尔,2,*和杨石1,7,8,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

组蛋白甲基化发生在赖氨酸和精氨酸残基上，其动态调控在染色质生物学中起着关键作用。这里我们识别了UHRF1 PHD指（PHD超高频射频1)作为组蛋白H3未修饰精氨酸2（H3R2）识别方式，是DNA CpG甲基化的重要调节器。这一结论是基于PHD的结合研究和共晶结构得出的超高频射频1与组蛋白H3肽结合，未修饰R2的胍基形成广泛的分子间氢键网络，H3R2甲基化，而非H3K4或H3K9，破坏复合物的形成。我们已经从微阵列和ChIP研究中确定了UHRF1的直接靶基因。重要的是，我们表明UHRF1抑制其直接靶基因表达的能力依赖于PHDUHRF1型与未修饰的H3R2结合，从而证明了该识别事件的功能重要性，并支持组蛋白精氨酸甲基化与UHRF1功能之间的潜在串扰。

简介

染色质共价修饰，包括DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰，在表观遗传调控中起着重要作用。组蛋白N末端尾部经历了广泛的修饰，包括赖氨酸（K）和精氨酸（R）残基的甲基化。组蛋白H3和H4的不同赖氨酸残基的甲基化可通过多种蛋白质形式识别，包括植物同源结构域（PHD）、PWWP和色域(Taverna等人，2007年). 这种识别机制赋予了大量基于染色质模板的生物过程的精细调控功能，包括基因调控、DNA复制和重组。最近的研究进一步证明，甲基化和非甲基化赖氨酸残基都被对基因表达调控重要的特定蛋白质模式识别(Lan等人，2007年;Ooi等人，2007年;Shi等人，2006年). 相反，尽管精氨酸甲基化起着同样重要的作用，但对组蛋白精氨酸残基是如何识别的知之甚少(贝德福德和克拉克，2009年).

这里我们报告了UHRF1（PHD）中PHD指状结构域的鉴定超高频射频1)作为组蛋白H3尾部结合模块，识别组蛋白H三（H3R2）的未修饰精氨酸残基2。UHRF1（泛素样，具有PHD和环指结构域1）（也称为NP95和ICBP90）是维持CpG DNA甲基化所必需的(Bostick等人，2007年;Sharif等人，2007年)由多种蛋白质组成(图1A)包括结合半甲基化CpG的SRA(Bostick等人，2007年;Sharif等人，2007年)，一个结合三甲基组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me3）的Tudor结构域(Walker等人，2008年)以及一个PHD结构域，其组蛋白结合伙伴尚不清楚(Karagianni等人，2008年;Papait等人，2008年). UHRF1主要定位于着丝粒周围异染色质（PCH）(Papait等人，2007年)，但最近的研究表明，UHRF1也定位于特定的常染色区，可能在转录抑制中发挥作用(Daskalos等人，2011年;Kim等人，2009年). UHRF1被认为可以调节PCH功能以及某些肿瘤抑制基因的转录(Daskalos等人，2011年). 然而，UHRF1向异色或常色区域募集的机制基本上仍不清楚。

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博士超高频射频1识别未修饰的组蛋白H3尾部

（A） 人类UHRF1结构域的示意图。数字表示不同结构域边界上的氨基酸位置。

（B–D）使用含有所示修饰的各种生物素化组蛋白肽进行体外结合分析。重组全长UHRF1或PHD超高频射频1与固定在链霉亲和素Sepharose珠上的生物素化组蛋白肽孵育。结合蛋白进行SDS-PAGE并用考马斯蓝染色。

（E） 组蛋白H3（1-10）与URHF1的Tudor、PHD和SRA结构域结合的ITC图，显示了解离常数（Kd）值。UD，无法检测。

与都铎相比，我们展示了这一点超高频射频1，结合H3K9me3(Walker等人，2008年)，博士超高频射频1特异性结合未修饰的H3。令人惊讶的是，H3R2甲基化显著降低了这种结合，但H3K4和H3K9甲基化在很大程度上没有影响，这表明PHD超高频射频1通过识别未修饰的H3R2结合H3。PHD的结构支持这一假设超高频射频1与H3肽复合，确定H3R2是PHD的主要接触位点超高频射频1以及H3上第一个丙氨酸残基的N末端氨基和侧链，这可能有助于锚定PHD超高频射频1因此有助于未经修改的R2识别特异性。等温滴定量热法（ITC）提供了PHD的结合亲和力超高频射频1对于R2、K4和K9处甲基化的未修饰或修饰H3，强化了未修饰R2是PHD主要接触位点的概念超高频射频1基因组表达微阵列分析结合染色质免疫沉淀（ChIP）确定了一些UHRF1直接靶基因，其表达受到UHRF1抑制。重要的是，破坏PHD的点突变UHRF1型与未修饰的H3R2结合也会削弱UHRF1抑制靶基因表达的能力，而这些突变对UHRF1 PCH定位没有影响。总之，我们提供了识别PHD的绑定、结构和功能数据超高频射频1作为未改性的H3R2粘合剂。我们的发现表明，PHD对未修饰的H3R2的识别超高频射频1可能是将UHRF1靶向常染色区域的重要机制，组蛋白H3R2甲基化可能通过调节其染色质可及性影响UHRF1功能。

结果

博士超高频射频1识别未修改的H3尾部

如上所述，UHRF1主要定位于PCH，但也可能存在于常染色位点(Kim等人，2009年). 了解UHRF1是如何被招募到基因组的这些不同区域的，对于理解UHRF1介导的生物过程的机制非常重要。UHRF1由多种蛋白质形式组成。除了介导泛素化的环指结构域之外(Citterio等人，2004年)它还包含Tudor、PHD和SRA结构域，分别介导UHRF1与组蛋白和DNA的相互作用(Bostick等人，2007年;Karagianni等人，2008年;Sharif等人，2007年;Walker等人，2008年) (图1A). 先前的研究表明，PHD超高频射频1结合H3K9me3(Karagianni等人，2008年). 然而，最近的一项研究表明，H3K9me3结合也由Tudor介导超高频射频1(Walker等人，2008年). 因此，到底什么是PHD超高频射频1绑定仍不清楚。

为了解决这个问题，我们首先使用纯化的全长UHRF1和组蛋白肽集合进行了体外结合分析，包括修饰或不修饰。如所示图1B，UHRF1特异性且牢固地结合未修饰的N末端组蛋白H3尾部（aa 1–21）（通道4），但不结合H3的更内部序列，无论是未修饰的（aa 15–35，通道5）还是R17上的甲基化（aa 15-35，通道16–17）。UHRF1与未修饰或甲基化组蛋白H4也几乎没有结合(图1B，车道18、19–23），以及至未修改的H2A或H2B（aa 1–21）(图1B，24–25车道）。重要的是，H3K4和H3K9的二甲基或三甲基化，以及H3R8的二甲基化，大体上没有显著影响结合(图1B，9–15车道）。相反，H3R2的甲基化显著降低了结合(图1B，车道6-8），表明H3R2可能是UHRF1的关键接触点。从UHRF1中删除PHD结构域将废除结合，这表明PHD超高频射频1是UHRF1结合H3所必需的(图1C，将车道5与车道3进行比较）。最后，博士超高频射频1仅该结构域就足以结合未修饰的H3，结合同样受到H3R2甲基化的阻碍，但在H3K9甲基化的影响很大(图1D). ITC分析确定了PHD之间的结合亲和力（Kd）超高频射频1未经修改的H3约为2.1μM(图1E). 相比之下，都铎超高频射频1，主要识别H3K9me3(Walker等人，2008年)，对未修饰H3的亲和力显著降低（Kd=85.0μM）。此外，SRA超高频射频1结合半甲基化DNA的结构域未检测到与组蛋白H3的结合(图1E). 综上所述，这些发现表明，在UHRF1中存在的各种蛋白质形式中(图1A)，博士超高频射频1可能通过识别未修饰的R2残基来结合未修饰的H3。

PHD的晶体结构超高频射频1自由态和H3（1-9）束缚态

上述生化和分子研究提出了令人兴奋的可能性，即PHD超高频射频1可能是未经修改的H3R2“读取器”。了解PHD的分子机制超高频射频1-通过介导组蛋白H3识别，我们确定了PHD的晶体结构超高频射频1游离态，与组蛋白H3（1-9）和H3（1-9）K4me3肽复合，晶体统计数据列于表1.

表1

PHD结晶数据采集与精炼统计超高频射频1游离态和肽结合态

水晶UHRF1 PHD-H3（1-9）超高频射频1 PHD-H3（1-9）K4me3UHRF1无PHD状态
光束线BNL X29型APS 24ID-C家庭来源
波长1.28280.97918
“空间”组P（P）4三212P（P）4三212我212121
单位单元格
a、b、c（奥数）42.62, 46.62, 183.4842.62, 46.62, 183.4853.74, 53.81, 128.48
    α, β, γ (°)90, 90, 9090, 90, 9090, 90, 90
分辨率（Ω）20–1.80 (1.86–1.80)一20.0–1.95 (2.02–1.95)一20.0–2.65 (2.74–2.65)一
R（右）sym（对称）0.069 (0.54)0.12 (0.78)0.064 (0.84)
I/σ（I）38.3 (1.67)34.9 (3.23)41.9 (3.1)
完整性（%）99.1 (92.1)98.7 (96.1)99.5 (99.1)
冗余13.1 (6.5)13.3 (13.7)7.0 (7.1)
唯一反射数17072131225681
R（右）工作/R（右）自由的(%)21.5/24.321.3/24.724.8/29.4
非氢原子数
蛋白质10701035948
肽12898-
水122477
锌888
平均B因子（λ2)
蛋白质29.928.875.1
肽38.635.6-
锌34.325.376.9
水36.53374.4
Rmsd公司
粘结长度（Ω）0.0080.0080.012
结合角（°）1.1671.1151.700
一括号中显示了最高分辨率外壳（单位：Ω）。

标准PHD指由交叉括号的双锌指域结构定义(Aasland等人，1995年). 与典型PHD手指的序列比较表明，PHD超高频射频1与标准序列相比，有一个额外的N末端基序包含三个额外的Cys残基（参见图S1A在线提供）。基于PHD的2.65Ω晶体结构UHRF1型在自由状态下，标准PHD指的N末端的Pro311至Val328段采用一个称为PHD前基序的结状折叠（图S1B). 来自富Cys-前PHD基序N末端的三个Cys（315、318和326）残基和来自典型PHD指N末端的Cys329与锌离子（指定为Zn1）配位形成前PHD(图S1B)，具有连接前PHD和典型PHD指状基序的单个螺旋匝，其相对排列通过氢键相互作用稳定。两个对称相关单体形成PHD的锌配位二聚体超高频射频1在自由状态下，由单个锌离子（指定为Zn4）介导(图S1C).

我们已经解决了PHD的1.80Ω结构超高频射频1与未修饰的H3（1-9）肽共结晶。两个非晶体对称性相关单体形成PHD的锌配位二聚体超高频射频1处于H3（1-9）结合态，由一对锌离子（指定为Zn4）介导(图S1D). 博士超高频射频1接触结合H3（1-9）肽的前四个残基，残基Arg8与对称性相关分子相互作用。结合的H3肽的A1-R2-T3-K4残基通过肽-蛋白质骨架相互作用与PHD指表面的β1链以反平行排列对接(图2A). 结合肽的Ala1侧链被埋在疏水残基Leu344、Pro366和Trp371形成的口袋中(图2A). 此外，肽的氨基末端与Glu368的主链羰基氧相互作用(图2A).

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PHD的晶体结构超高频射频1结合H3（1-9）和H3（1-9）K4me3肽

（A） 显示的是PHD 1.80Å晶体结构的带状（蛋白质）和棒状（肽）表示超高频射频1与H3（1-9）肽结合。博士超高频射频1为淡蓝色，此视图中未显示PHD前版本。结合的H3肽呈黄色，PHD上有相互作用的残基超高频射频1用洋红着色。分子间的相互作用被描绘成红色虚线。参与分子间识别的桥联水分子显示为红色球体。

（B） 所示为PHD晶体结构的静电（蛋白质）和棒状（肽）表示超高频射频1与H3（1-9）肽结合。结合肽呈黄色，R2的侧链位于蛋白质的红色酸性表面补丁内。

（C） PHD晶体结构叠加的立体视图UHRF1型处于游离（浅蓝色）和H3（1-9）肽结合（洋红）状态。结合肽的H3（1-4）段以黄色显示。

（D） PHD 1.95μl晶体结构的带状（蛋白质）和棒状（肽）表示超高频射频1与H3（1-9）K4me3肽结合。

另请参见图S1和S6.

Arg2侧链对接在PHD指状体内带负电荷的表面凹槽上(图2B)，通过NεH原子与Asp347侧链和NηH形成氢键，连接PHD指的β1和β2链的Asp347-Asp350发夹片段在未修饰的Arg2识别中起着关键作用2Asp350侧链上的氢键原子(图2A). Cys346的主链羰基氧也与Arg2的Nη2H质子形成极性接触。此外，有序的水分子介导氢键相互作用网络，从而将结合肽Arg2的主链酰胺质子与蛋白质Met345的主链羰基氧和Asp347的侧链连接起来(图2A). 结合的H3肽的Arg2和PHD指之间如此广泛的氢键相互作用为PHD识别未修饰的H3R2标记的特异性提供了充分的基础超高频射频1在肽结合后，重组Glu368-Glu370片段以容纳肽N末端的Ala1残基，Asp350侧链经历构象变化（χ2角度从−19°变化到23°）以促进H3 Arg2侧链识别（立体视图图2C比较自由[蓝色]和束缚[洋红色]结构）。

观察到的涉及Arg2的广泛分子间接触网络确定了PHDUHRF1型识别其复合物结构中未经修饰的H3R2(图2A). PHD之间结合亲和力的显著降低支持了这种结构观察超高频射频1当Arg2对称（Kd=39.7μM）或不对称二甲基化（Kd=44.9μM）或者被Ala取代（Kd>150μM）时，H3肽（Kd=2.1μM）的结合亲和力下降较小（Kd=0.6μM）(图3A). 总的来说，H3K9的三甲基化对结合没有影响（Kd=2.5μM），而H3K4的三甲基化引起了适度的减少（Kd=7.3μM）(图3B)，与全长UHRF1体外下拉结果一致(图1B)PHD的1.95Ω晶体结构超高频射频1与H3（1-9）K4me3肽结合(图2D). 此外，在H3肽的N末端添加Ala-Ala片段会导致结合亲和力大幅下降（Kd>400μM）(图3C)N末端乙酰化（Kd>250μM）(图3C)，强调H3的N末端对PHD的重要贡献超高频射频1H3识别(图2A). 这些发现以及对R2A突变体（Kd>150μM）的结合研究(图3A)，进一步支持PHD绑定的概念超高频射频1到H3主要由未修饰的R2介导，辅以对H3 N末端的识别。事实上，Asp347和Asp350与复合物中H3R2的胍基形成氢键(图2A)当突变为Ala时，D350A突变体与Kd=47.0μM的结合亲和力显著降低，D347A突变体的Kd=95.0μM(图3D).

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ITC测量PHD之间的相互作用超高频射频1和组蛋白H3尾部

（A） PHD结合的叠加放热ITC焓图超高频射频1至H3（1-10）、H3（-1-10）R2me1、H3。插页列出了测量的绑定常数。

（B） PHD结合的叠加放热ITC焓图超高频射频1至H3（1-15）K4me0、H3（1-15）K4me1、H3。插页列出了测量的绑定常数。

（C） PHD结合的叠加放热ITC焓图超高频射频1至H3（1-10）、H3（-1-10）K4A、H3AA（1-10。插页列出了测量的绑定常数。

（D） PHD野生型与D350A和D347A突变体放热焓图的比较UHRF1型与H3（1-10）肽结合。

最后，博士超高频射频1当T3被磷酸化（H3[1-15]T3ph）（Kd>500μM）时，与组蛋白H3的结合非常弱(图3C)，表明H3序列中与R2相邻的T3磷酸化后，由于空间和/或静电排斥而导致的复合物不稳定。

博士超高频射频1H3R2结合对UHRF1调节的基因表达至关重要

上述生物化学和结构研究揭示了一种蛋白质形态，它能特异识别未修饰的H3 R2，表明这种识别可能在将UHRF1导向特定基因组位置方面发挥重要作用。如前所述，在PCH中发现UHRF1，但PHD缺失超高频射频1或H3R2-结合氨基酸（D347A和邻近的E348A）的突变显示PCH定位与野生型UHRF1相当(图4A)表明H3R2结合可能对UHRF1 PCH定位是不必要的。这可能并不意外，因为UHRF1 PCH定位被认为涉及SRA超高频射频1结合半甲基化CpG(Bostick等人，2007年;Sharif等人，2007年)，PCH的标志性修改(理查兹和埃尔金，2002年)，尽管这是SRA的PCH本地化角色UHRF1型最近的一项研究对其提出了质疑(Rottach等人，2010年). 总之，我们的发现表明，虽然博士超高频射频1对于UHRF1 PCH定位来说似乎是不必要的，这可能是将UHRF1定位到常染色位置的关键。

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UHRF1直接调控靶基因的鉴定

（A） H3R2结合可能是UHRF1 PCH定位所必需的。将dsRed融合的野生型和突变型UHRF1构建物转染NIH 3T3细胞，转染后2天进行免疫染色。代表性单元格以虚线圆圈突出显示。

（B） 用RT-qPCR验证微阵列表达数据。我们随机选择了微阵列中上调的20个基因进行进一步验证。从plko.1对照shRNA和UHRF1-sh2处理的HCT116细胞制备RNA，并将其反转录成cDNA用于qRT-PCR。误差条代表三个独立实验计算的SEM。

（C） UHRF1的RNAi导致其靶基因（ADAM19和SUSD2）的UHRF1占用率降低。误差条代表三个独立实验计算的SEM。

为了确定H3R2结合对于UHRF1调节常色基因表达是否重要，我们进行了微阵列分析，使用从用扰乱的或两种独立的UHRF1 shRNA（UHRF1-sh2和UHRF1-sh5）处理的细胞中分离的RNA来鉴定UHRF1调节的基因。每个uhrf1 shRNA都会引起大约3000个基因的上调和下调(图S2). 然而，在两种uhrf1 shRNAs的反应中表现出表达变化的基因数量较少（分别为367和606个上调和下调基因）(表S1). 我们认为只有那些在两种UHRF1 shRNAs处理的细胞中表现出差异表达的基因才是潜在的UHRF1调节基因。鉴于UHRF1主要是转录抑制因子(Daskalos等人，2011年;Kim等人，2009年)，我们的初步验证工作集中在那些在没有UHRF1的情况下上调的基因上。RT-qPCR显示，在26个基因中，22个基因在uhrf1 RNAi细胞中上调，证实率超过80%(图4B). GO术语分析确定了UHRF1调节基因在RNA加工和代谢以及细胞死亡中的潜在参与(图S3A和S3B)而KEGG通路分析表明UHRF1可能调控癌症通路(图S3C)这与之前关于UHRF1在细胞凋亡和肿瘤发生中可能作用的报道一致(Abbady等人，2003年;Hervuet等人，2010年;Tien等人，2011年). 重要的是，我们通过ChIP和定量PCR（ChIP-qPCR）证明了这两个UHRF1调节基因与UHRF1近启动子结合(图4C)以及基因体（数据未显示），表明其表达直接受UHRF1调控。一致地，ChIP也表明这两个基因的启动子区域缺乏H3R2甲基化（H3R2me2s）(图5A). 这两个启动子也缺乏H3K9三甲基化(图5B)，这可能解释了这些基因的UHRF1调节依赖于PHD域（见下文）。我们还研究了这些启动子的DNA甲基化状态，并通过甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）测定确定UHRF1是否参与调节(Weber等人，2007年). 如所示图5C，5-methyl-C抗体（Eurogentec）在ADAM19和SUSD2的启动子以及已知甲基化的RARβ的启动子处检测到MeDIP信号(Widschwendter等人，2000年)（同时图S4). 一致地，MeDIP信号显著高于RPL30，RPL30是一个积极转录的基因，因此预计没有或只有低水平的DNA甲基化。有趣的是，UHRF1的敲除降低了两个启动子的甲基化信号(图5C)表明UHRF1介导的对这两个基因的抑制可能涉及DNA甲基化。虽然要了解这些UHRF1调节基因是否以及如何在介导UHRF1生物学中发挥作用，还需要进一步研究，然而，这些结果表明组蛋白和DNA甲基化可能在UHRF1调节的基因阻遏中发挥作用，并为下文所述的遗传互补实验提供UHRF1调控的靶基因。

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UHRF1直接靶基因ADAM19和SUSD2缺乏H3R2me2s和H3K9me3，但在其启动子处有DNA胞嘧啶甲基化

（A） ADAM19和SUSD2启动子缺乏H3R2对称二甲基化。ChIP实验使用新加坡Guccione实验室开发的H3R2me2特异性多克隆抗体，Sp2启动子用作阳性对照。误差条代表三个独立实验计算的SEM。

（B） UHRF1直接靶点与低水平H3K9me3相关。相同的引物用于图4C用于H3K9me3-ChIP。代表异色区的SAT2重复序列和看家基因RPL30分别用作阳性和阴性对照。误差条代表三个独立实验计算的SEM。

（C） ADAM19和SUSD2启动子被胞嘧啶甲基化，甲基化似乎需要UHRF1。5-甲基-C抗体用于MeDIP分析。MeDIP结果表示为相对于其相应输入的值。RARb和RPL30分别作为阳性和阴性对照。误差条表示从两个独立实验计算出的SD。

确定PHD的功能重要性超高频射频1结合未修饰的H3R2，我们接下来使用全长、野生型和R2-结合缺陷双突变体（D347A和邻近的E348A）进行了遗传互补实验，根据ITC分析结果显示H3结合无法检测(图6A). 如所示图6BUHRF1的野生型双突变体（D347A和邻近的E348A）恢复了对两个UHRF1调节基因SUSD2和ADAM19的抑制，但没有结合缺陷双突变体。野生型和双突变体蛋白都得到了相似的表达，这表明结合缺陷突变体缺乏拯救并不是因为缺乏表达(图S5). 综上所述，这些结果表明PHD的主要功能超高频射频1是通过识别和结合未修饰的R2残基，将UHRF1定位到常染色目标。

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UHRF1结合H3R2对其调节靶基因表达的能力至关重要

（A） 全长UHRF1（野生型或突变型）和组蛋白H3肽与估计结合亲和力（Kd）结合的叠加ITC焓图。UD，无法检测。

（B） 救援实验。抗RNAi的野生型UHRF1，而不是UHRF1的H3R2结合缺陷突变体（D347A/E348A），在UHRF1 RNAi细胞中恢复了对两个UHRF1调节基因SUSD2和ADAM19的抑制。建立了HCT116稳定细胞系，该细胞系共表达对照或UHRF1 shRNA和/或指示标记的UHRF1结构。qPCR检测SUSD2和ADAM19的mRNA表达。GAPDH被用作内部控制。SEM是从三个独立的实验中获得的。

讨论

PHD识别N-末端H3肽的比较超高频射频1和WD40西部数据5域

在本研究中，我们证明了未经修饰的H3R2对PHD的识别超高频射频1主要由侧链间氢键介导，代表组蛋白H3尾部识别模式。通过PHD中的结合囊识别未修饰的H3R2超高频射频1它的胍基和酸性残基侧链之间既有静电作用又有氢键作用(图2B)以及其脂肪族侧链和Met345侧链之间的疏水作用(图2A). 事实上，Arg2的二甲基化或Ala替代Arg2会导致结合亲和力显著下降(图3A).

先前的研究确定WDR5的WD40结构域是组蛋白甲基转移酶SET1/MLL家族的一个组成部分，是未修饰的H3R2的读取器(Couture等人，2006年;Han等人，2006年;鲁森伯格等人，2006年;Schuetz等人，2006年). WD40对未修饰H3R2的识别西部数据5涉及定位N末端和将未经修改的R2侧链插入到WD40螺旋桨折叠的中心腔中，通过直接和水介导的氢键定向，并夹在交错的Phe侧链之间(图S6B). 然而，PHD之间有一个重要的区别超高频射频1(图S6A)和WD40西部数据5(图S6B)复合物，因为未修饰的H3R2被PHD靶向超高频射频1使用“表面凹槽”识别模式，其装订袋更容易接近，而WD40则将其作为目标西部数据5使用“空腔插入”识别模式，将标记插入并埋藏在深蛋白缝隙中，具有更大的尺寸选择识别潜力(Taverna等人，2007年).

需要注意的是，帝舵JMJD2A公司(Huang等人，2006年;Lee等人，2008年)和ADDDNMT3A型(Otani等人，2009年)分别绑定H3K4me3和未修改的H3K4标记的，也显示与未修改H3R2位点的接触。这些TUDOR/ADD结构域不能被指定为H3R2标记的读取器，因为它们没有形成广泛的分子间氢键网络到R2的胍基上，正如在PHD中观察到的那样超高频射频1(图2A). 此外，在R2甲基化或用丙氨酸替代ADD后，观察到结合亲和力的降低要小得多DNMT3A型和TUDORJMJD2A公司与PHD相比超高频射频1.

与未经修饰的K4识别所涉及的其他复合物不同(Lan等人，2007年;Ooi等人，2007年)当铵基团与酸性侧链形成多个氢键时，未经修饰的H3K4侧链与PHD中Cys329的主链羰基形成单一氢键UHRF1型复杂(图2A和图S6A). 因此，有足够的空间来适应H3K4的甲基化修饰，这已被结合研究作为K4甲基化状态的功能所证实(图3B)与PHD结合的H3（1-9）K4me3肽的晶体结构UHRF1型(图2D).

博士超高频射频1将UHRF1靶向常染色体位置和调节常染色体基因表达至关重要

UHRF1主要参与异染色质功能(Karagianni等人，2008年;Papait等人，2008年;Papait等人，2007年)DNA复制过程中CpG甲基化调控(Bostick等人，2007年;谢里夫等人，2007年). 虽然先前的研究确定了少数受UHRF1调节的基因，但表明UHRF1可能在基因表达调控中发挥作用(Kim等人，2009年)，我们的研究在全基因组水平上调查了UHRF1的这种作用。我们的分析确定了数千个潜在的UHRF1靶基因，支持UHRF1的一般转录作用。早期研究表明UHRF1参与细胞增殖和凋亡调节(Fang等人，2009年;Fujimori等人，1998年;Tien等人，2011年)并提示UHRF1可能是一个可能的癌基因(Bronner等人，2007年). 我们的GO术语分析(图S3)在UHRF1上调基因和凋亡基因中发现了可能的抑癌基因，如Axin2和BMP4，这增加了这些基因可能介导UHRF1调节细胞增殖和细胞死亡的能力这一令人兴奋的可能性。有趣的是，许多先前报道的与癌症相关的UHRF1调节基因，如BRCA1和p73，并不属于我们分析中确定的UHRF1-调节基因。这可能是由于细胞类型或分析条件的差异。无论如何，我们的研究支持UHRF1直接调节大量基因表达的观点，为未来的研究奠定了基础，旨在进一步深入了解这些基因如何介导UHRF1生物学。

值得注意的是，我们的发现为UHRF1如何靶向常染色区以发挥其转录作用提供了分子和结构方面的见解，即通过识别和结合未修饰的H3R2残基。我们认为PHD的主要功能超高频射频1是将UHRF1靶向缺少H3K9me3的常染色区域。对于携带H3K9me3的基因，我们预测Tudor超高频射频1结合H3K9me3，将主导并减轻对PHD的依赖超高频射频1与此一致，我们发现H3K9me3的存在在体外抵消了R2二甲基化对UHRF1与组蛋白H3结合的抑制作用（数据未显示）。除了PHD的常染色靶向功能超高频射频1在此报道，之前的研究也证明了PHD的需求超高频射频1在PCH结构的调节中(Papait等人，2008年). 总的来说，博士超高频射频1尽管UHRF1对PCH靶向是必不可少的，但它对靶向常染色和PCH功能似乎很重要。

组蛋白精氨酸甲基化与UHRF1功能之间的潜在串扰

总之，我们提供了结合、结构和功能数据，突出了用于识别组蛋白H3上未修饰精氨酸残基（R2）的效应器模块的发现。我们的发现进一步表明，R2的任何修饰都可能对UHRF1与H3的结合产生负面影响，包括甲基化(图2和​和3）三)以及可能的去氨作用(Cuthbert等人，2004年)，增加了UHRF1染色质结合和调节H3R2翻译后修饰的途径之间串扰的可能性。有趣的是，R2单甲基化对UHRF1 H3结合的影响较小（减少3.5倍，图3A)与对称和不对称二甲基化相比（结合减少20倍，图3A)这表明R2修饰的细微差异可能会对UHRF1染色质结合产生差异调节。UHRF1调节的单甲基化与二甲基化的潜在功能意义尚不清楚，有待更好地了解这些修饰中涉及的甲基转移酶。以及组蛋白上甲基化精氨酸标记读数的最新报告(Yang等人，2010年)和蛋白质(Liu等人，2010a,2010年b)通过TUDOR结构域，这些发现开始揭示组蛋白精氨酸残基差异甲基化状态识别的潜在精细效应器网络。

实验程序

蛋白质表达与纯化

所有构建物均使用基于PCR-的克隆策略生成，所有突变体均通过QuikChange突变协议（Strata-gene）生成。将全长UHRF1（1-806）、Tudor（139-298）和PHD（311-379）的DNA片段亚克隆到编码3C蛋白酶裂解位点的pGEX-6P-1或pET-15b衍生物中。所有结构均以大肠杆菌菌株BL21（DE3），并使用谷胱甘肽4B柱层析纯化。PHD手指（311–380）、TUDOR（140–295）和SRA（427–630）也分别克隆到GST和六组氨酸sumo标记的表达载体中。表达条件和序列蛋白纯化方案详见补充实验程序.

肽下拉分析

生物素化组蛋白肽（每个1μg）用于GST融合PHD或his6标记全长UHRF1的下拉分析，遵循前面描述的结合方案(Lan等人，2007年).

抗体

UHRF1多克隆抗体在家中培养，而H3R2me2s抗体是在新加坡Gucioone实验室生产和质量控制的兔多克隆抗体(gs.ude.rats-a.bcmi@enoiccuge公司).

ITC测量

使用VP-ITC量热计（MicroCal，LLC）在25°C下进行等温滴定量热实验，使用MicroCal Origin软件进行曲线拟合、平衡解离常数和摩尔比计算。有关详细过程，请参阅补充实验程序.

结晶、X射线数据采集和结构测定

PHD结晶试验超高频射频1在18°C下，使用蚊子结晶机器人，采用坐滴蒸汽扩散法对未修饰和甲基化的N末端H3肽进行结合。PHD晶体的X射线数据集超高频射频1在自由状态下，与H3肽变体结合，收集在表1.PHD络合物的晶体结构超高频射频1用单波长反常色散（SAD）技术在Zn-peak波长下求解H3（1-9）的结合。PHD的后续结构超高频射频1并利用PHD的结构通过分子置换法解决了其配合物超高频射频1作为搜索模型绑定到H3（1-9）。

有关结晶、数据收集和结构计算的其他详细信息，请参阅补充实验程序上述所有结构的晶体学统计数据列于表1.

RNA干扰与基因拯救

慢病毒Plko.1构建物表达shRNAs（序列列于表S2)购自Open Biosystems。按照推荐的方案（Addgene）在293T细胞中产生病毒颗粒。用共表达的慢病毒plenti6.2或plenti6.2-UHRF1（野生型或突变型）和plko.1 shRNAs（对照或UHRF1 RNAi）建立稳定的HCT116细胞系。感染后24小时，分别以1.6μg/ml和5μg/ml的浓度添加嘌呤霉素和Blastidin S盐酸盐，以选择稳定感染细胞的混合群体。选择6天后，收集细胞进行RNA提取。用1μg RNA进行逆转录，然后进行实时PCR。实时PCR的引物列于表S3.

基因表达芯片分析

在Affymetrix基因芯片系统上使用标准方法进行全球基因表达的微阵列分析。

甲基化DNA免疫沉淀

用UHRF1shRNA和控制慢病毒处理14天后，从HCT116细胞中纯化基因组DNA，经超声处理、变性，并在4°C下用抗5-甲基-C（Eurogentec）单克隆抗体（10μl）孵育（8μg）4小时。用蛋白a/g珠捕获抗体-DNA复合物，并通过实时PCR检测MeDIP组分中的DNA富集。

补充材料

补充的

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致谢

我们感谢杨翔、陈德贵和复旦大学生物医学科学研究院表观遗传学实验室的成员，以及加州大学洛杉矶分校医学院的史蒂夫·雅各布森和格雷格·霍洛维茨，以及斯隆-凯特琳纪念癌症中心的玛丽·戈尔，感谢他们的关注和有益的讨论。我们感谢Ernesto Guccione提供的H3R2me2s抗体和Sp2引物，以及Or Gozani提供的组蛋白肽引物。我们感谢阿贡国家实验室先进光子源光束线24ID-C和24ID-E的工作人员，以及布鲁克海文国家实验室BNL X29的工作人员在X射线数据采集方面提供的帮助。这项工作得到了斯塔尔基金会和白血病-淋巴瘤项目赠款（D.J.P）以及中国教育部“985”计划和中国基础研究“973”国家重点发展计划（2009CB825602、2009CB825903）的支持，复旦大学，中国上海。作者的贡献如下。E.R.在H.L.的协助下，在D.J.P.的监督下，负责ITC、结晶、晶体数据收集和结构分析。Z.W.、H.M.、。，和L.H.（在F.L.、Y.G.S.、YX.和Y.S.的监督下）。Y.L进行了ITC实验，如图6和H.C.参与了本研究中使用的各种质粒的构建。R.G.和F.W.分别在技术和生物信息学方面做出了贡献。这份手稿由Y.S.和D.J.P.撰写，并由其他作者输入。F.L.是Constellation Pharmaceuticals，Inc.的员工。Y.S是Consellation Pharmaceoticals公司的联合创始人，也是其科学咨询委员会的成员。

脚注

加入人数

原子坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中，并带有以下登录代码：PHD超高频射频1在自由状态下（3SOX），与H3（1-9）肽（3SOU）的络合物，以及与结合的H3（1-9）K4me3肽（3SOW）的络合物。UHRF1微阵列数据已保存在GEO数据库中，注册号为GSE30478。

补充信息

补充信息包括六个图、三个表、补充实验程序和补充参考，可以在本文的在线网站doi:10.1016/j.molcel.2011.07.006上找到。

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