角蛋白支架调节表皮屏障形成、线粒体脂质组成和活性

KtyI表皮广泛粘附缺陷和细胞溶解^−/−和KtyII^−/−_K8公司胚胎

最近的遗传和生物化学数据确定角蛋白在细胞构筑、细胞粘附、细胞生长和不同免疫功能调节中的主要作用(Kim等人，2006年；Vijayaraj等人，2009年；Kim和Coulombe，2010年；Wallace等人，2012年；Roth等人，2012a,b条；Lessard等人，2013年；Chung等人，2015年)。

为了检测I型和II型角蛋白对表皮分化的各自贡献，在KtyI的E15.5分层开始时，对组织切片中的组织形态和增殖进行了分析^−/−和KtyII^−/−_K8公司胚胎。在这一发育阶段，两种敲除（KO）小鼠的表皮都是完整的，厚度相似(图2 A)，但解剖时比WT更脆弱(Bär等人，2014年)增殖率无显著差异(图S3 B). 相反，在E18.5，主要是上部棘层和角化层之间的广泛细胞溶解，以及两种KtyI的皮肤过热^−/−和KtyII^−/−_K8公司变得明显（前者增加了3.5倍，后者增加了6倍）(图2，A和B; 和图S3 A；Bär等人，2014年). 此外，KO角质形成细胞似乎更大。同时，细胞-基质接触受到的影响较小(Seltmann等人，2013年b,2015). 与广泛的细胞损伤和表皮过度粘连相一致，KtyI的基底层和大部分基底层上角质形成细胞的增殖率显著增加^−/−和KtyII^−/−_K8公司分别与通过Ki-67阳性细胞百分比推断的WT进行比较(图2C和图S3 C）。出乎意料的是，在KtyI的颗粒层中检测到含有丝蛋白的透明角膜颗粒^−/−但KtyII没有^−/−_K8公司表皮(图2 A). 最后，KtyI的角质层致密度出现下降^−/−KtyII增加^−/−_K8公司皮肤样本，相对于对照。这表明角蛋白依赖性CE缺陷。

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图2。

KtyI和KtyII消融导致表皮增厚、过度增殖、细胞溶解以及颗粒层和层的明显结构异常。（A） E15.5和E18.5小鼠胚胎的苏木精/伊红染色皮肤切片。在E15.5处可见正常表皮，但在KtyI处可见过度增粘和细胞溶解（星号）^−/−和KtyII^−/−_K8公司E18.5处。KtyI中的大透明角质颗粒^−/−以及他们在KtyII的缺席^−/−_K8公司表皮，显示出致密的角质层。棒材，20µm。（另请参阅中其他图片的不同放大倍数图S3 A). （B） 测量显示KtyI在E18.5处表皮厚度显著增加^−/−和KtyII^−/−_K8公司（C）基于Ki-67的WT和KtyI表皮基底（B）和基底上（Sb）细胞增殖率定量^−/−和KtyII^−/−_K8公司E18.5的胚胎（见图S3 C中的图片），显示在缺乏KIF的情况下显著增加。***，P≤0.001。

解开KtyI中不同变化的起源^−/−和KtyII^−/−_K8公司与对照表皮进行免疫荧光和电镜分析。这证实了这两种基因型都没有KIF(图3A和4、B、F和H)KtyI中存在Krt5和Krt1聚集体^−/−KtyII中的Krt14骨料^−/−_K8公司表皮(图3 A)与单角蛋白基因KO小鼠和角蛋白病患者的研究结果类似(马金，2004年；Coulombe等人，2009年；Arin等人，2011年). KtyI缺失时，Krt1和Krt5蛋白量显著减少，而Krt6增加(图3 B). 同样，KtyII中Krt10的数量减少^−/−_K8公司皮肤(图3 B). 然而，Krt14数量没有受到影响(图3 B). 最引人注目的是Krt17，已知其调节mTOR并参与免疫反应(Kerns等人，2010年)，仅升高了三倍，而Nrf2靶基因Krt16(Huebner等人，2012年)在相应的KO小鼠中，其KtyII伙伴Krt6在mRNA水平上被诱导500倍（图S3、D和E），表明由于屏障缺陷，Nrf2活性升高(Huebner等人，2012年). Western blot也检测到Krt6(图3 B)并在基底上角朊细胞中形成聚集体(图3 B)。

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图3。

同种特异性角蛋白在KtyI中的表达和定位^−/−和KtyII^−/−_K8公司表皮。（A） WTs和KtyI角蛋白定位的免疫荧光分析^−/−和KtyII^−/−_K8公司E18.5处的表皮。注意两个KO中都没有KIF，KtyI中Krt1和Krt5的基底上聚集体^−/−KtyII中Krt14广泛聚集，但Krt10不聚集^−/−_K8公司.基底膜用白色虚线表示。棒材，20µm。（B） Western blot分析Krt1、Krt5、Krt6、Krt10、Krt14和α-微管蛋白作为E18.5时WT和角蛋白缺乏胚胎皮肤提取物中的负荷控制。注意与A呈正相关，显示KtyI中Krt6显著增加^−/−但Krt14在KtyII中的存在没有改变^−/−_K8公司与KtyII相比^+/+_K8公司。

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图4。

KtyI皮肤的电镜分析^+/+和KtyI^−/−E18.5描述结构变化的胚胎。（A和B）基岩地层的半桥粒（黑色箭头）在KtyI中很容易检测到^−/−动物。然而，值得注意的是，KtyI基底细胞层缺乏角蛋白丝（KF）和发生细胞溶解^−/−表皮（B，星号）。插图显示半桥粒和相邻的基底层（BL）放大率较高。KtyI基底上层的（E和F）桥粒（黑色箭头）^−/−与KtyI相比，表皮更小，频率更低^+/+注意KtyI棘层中的宽细胞间隙^−/−表皮和线粒体内内含物（白色箭头）。E和F的插图显示桥粒的放大率较高。（G和H）角质层中的角质体（白色箭头）在KtyI中很容易区分^−/−动物。插图显示角质桥粒放大率较高。棒材：（插入）100 nm；（A、B和E–H）1µm；（C和D）5µm。

我们最近对KtyII的分析^−/−_K8公司小鼠和角质形成细胞已经显示角蛋白在桥粒维持和桥粒蛋白水平中的主要作用(Kröger等人，2013年；Bär等人，2014年). 通过电子显微镜观察，KtyI的半桥粒保持完整^−/−表皮，尽管局部细胞溶解(图4，A–D). 如前所述，桥粒较小(图4，C–F)角质桥粒完全形成(图4、G和H). 值得注意的是，线粒体的一个子集显示出黑色内含物，但在其他方面似乎完好无损(图4 D)表明角蛋白参与其完整性(阿尔瓦拉多和库伦，2014年). KtyI中桥粒蛋白的表达和定位^−/−表皮与KtyII相似^−/−_K8公司老鼠(图S4，A–C). 值得注意的是，在用Laemmli缓冲液提取时，桥粒蛋白和桥粒蛋白1和2蛋白显著减少（图S4 C）。同时，斑球蛋白的表达和分布不受SDS提取物中角蛋白状态的影响（图S4、A和C）。

为了更好地了解角蛋白丢失对表皮的影响，我们分析了E18.5胚胎皮肤的转录组图谱。基因集富集分析，然后根据功能对基因本体进行分类和分组，揭示了角蛋白基因座缺失后的许多表达变化，特别是在参与氧化反应、表皮分化、免疫反应、脂质代谢和细胞凋亡/增殖的基因中（图S3 F），提示表皮屏障缺陷。

屏障完整性、CE组成和组装依赖于丝状角蛋白

角蛋白在CE组装和屏障功能中的不明确作用(Candi等人，2005年)以及已知的补偿机制，恢复遗传或药物干扰的屏障(Segre等人，1999年；Yu等人，2006年；塞维利亚等人，2007年)促使我们研究角蛋白、屏障组成和功能之间的机制联系。使用染料渗透试验对E18.5胚胎的外-内屏障进行检查，发现KtyII存在更严重的屏障缺陷^−/−_K8公司比KtyI^−/−与各自的控制相比(图5 A). 在E17.5，两种小鼠之间的差异不太明显(图5 A). 为了解决这一问题，对首席执行官进行了隔离。KtyII的那些^−/−_K8公司胚胎完全破裂，而KtyI中约15%的胚胎保持完整^−/−表明蛋白质组成或交联活性发生变化的制剂(图5、B和C). 甲苯胺蓝试验反映了这种差异，表明存在外-内屏障缺陷。E18.5皮肤的免疫印迹和免疫荧光分析表明，KtyI^−/−表皮、lorisrin、involucrin和filagrgin的表达没有改变(图5D). 令人惊讶的是，KtyII中没有loricrin^−/−_K8公司但在KtyI保持不变^−/−样品(图5、D和E). Profilaggrin是一种大于400 kD的大型角蛋白相关蛋白，由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶14和基质酶加工成丝聚蛋白单体，有助于屏障功能(Hoste等人，2011年). 其缺乏是特应性皮炎的主要原因(Sandilands等人，2007年；川崎等人，2012年). 与洛里克林类似，KtyII中不存在丝聚蛋白^−/−_K8公司在KtyI中，皮肤和profilaggrin对丝聚蛋白的加工几乎被废除^−/−皮肤，如丝聚蛋白单体的强烈减少所示(图5 E). 相反，在KtyI中，另一种重要的CE蛋白——总苞醇的蛋白质水平没有改变^−/−但KtyII减少了约50%^−/−_K8公司皮肤提取物(图5E). 了解表皮分化复合体（EDC）基因座中编码的CE基因表达改变的机制(Kypriotou等人，2012年)从E18.5角蛋白缺乏胚胎和对照胚胎的背侧皮肤RNA中进行illumina阵列和定量RT-PCR。在所选的34个基因中，20个在KtyI中上调了两倍或更多，一个下调了两倍以上^−/−而KtyII中有14个基因上调了两倍或更多，14个基因下调了两倍以上^−/−_K8公司(图5 F). 这两种小鼠菌株中有15个基因受到类似的调控。专注于差异调节的CE基因、丝聚蛋白、角蛋白、洛里克林和Lce3b的mRNA(图5 G)在KtyII中缺席^−/−_K8公司与KtyI相比^−/−这表明这导致前者的屏障缺陷更严重。KtyII中EDC基因转录失调的分子基础^−/−_K8公司将在其他地方描述（未发布的数据）。

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图5。

KtyI的不同表皮屏障缺陷^−/−和KtyII^−/−_K8公司小鼠胚胎。（A） 甲苯胺蓝分析显示KtyI中染料不耐受屏障获得中度延迟^−/−KtyII严重延迟^−/−_K8公司与WT胚胎相比。棒状，5 mm。（B和C）85%来自E18.5胚胎的CEs在KtyI中被破坏^−/−与KtyII的99%相比^−/−_K8公司CE与WT的比较。棒材，100µm。（D） E18.5表皮的免疫荧光分析显示，KtyI中的总苞素、loricrin和丝聚蛋白的分布高度相似^+/+和KtyI^−/−注意KtyI中纤维蛋白染色减少^−/−样品。基底膜用白色虚线表示。棒材，20µm。（E） E18.5胚胎皮肤提取物的Western blotting显示KtyII中的总苞蛋白（Ivl）减少，loricrin（Lor）和filggrin（Flg）缺失^−/−_K8公司同时KtyI中profilaggrin（Pro-flg，上部带）转化为filagglin（底部带）的过程减少^−/−皮肤；α-微管蛋白（tub）作为负荷控制。（F） 转录组分析揭示KtyI屏障蛋白编码基因表达的显著变化^−/−和KtyII^−/−注意KtyII中一些屏障蛋白编码基因的强烈下调^−/−_K8公司仅限（红色）；n个= 3. （G） 定量RT-PCR分析证实在KtyII中缺乏洛菌灵、丝聚集蛋白和角蛋白基因的转录^−/−_K8公司KtyI中总苞素和洛里克林mRNA的上调^−/−皮肤。***，P≤0.001。

尽管Nrf2上调，但角质素依赖性表皮屏障缺陷持续存在

CE缺陷引发了一个问题，即Nrf2是否介导了Sprr2d和Sprr2h的上调，从而挽救了氯霉素中的瞬时屏障缺陷^−/−老鼠(Huebner等人，2012年；Singla等人，2012年)在角蛋白缺乏的胚胎中受损。转录组分析，然后进行定量RT-PCR，在角蛋白缺乏的皮肤中建立了14个主要Nrf2靶基因的强烈上调。编码CE成分Sprr2d、Sprr2h、Krt6和Krt16以及显示抗菌活性的蛋白酶抑制剂Slpi的mRNA(Schäfer等人，2014年)，被诱导了200倍(图6，A和B; 图S3、D和E）。介导抗氧化反应的Nqo1、Gsta3和其他Nrf2靶基因的mRNA也上调，尽管上调幅度较低(图6，A和B). 此外，两种KO小鼠表皮中的Nrf2 mRNA和蛋白质均上调(图6、C和D)而Nrf2调节器Keap1保持不变。强大且持续的核Nrf2积累支持其在上述靶基因表达中的作用(图6 E). 因此，在没有KIF的情况下，几个Sprr基因（包括Sprr2d和Sprr2h）的显著上调未能恢复功能屏障。这与loricrin的缺失或存在无关(图5，D–G). 为了进一步剖析屏障形成的KIF需求，KtyI中高度不溶性CE的蛋白质组图谱^−/−和KtyII^−/−_K8公司与WT表皮对比分析。

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图6。

KtyI中Nrf2的诱导^−/−和KtyII^−/−_K8公司产前表皮。（A） E18.5 KtyI转录组图谱中所选Nrf2靶基因的强上调^−/−和KtyII^−/−_K8公司皮肤RNA。（B）使用定量RT-PCR分析确认A中的数据。（C） 转录组图谱和定量RT-PCR显示角蛋白缺乏胚胎皮肤中Nrf2 mRNA增加。（D） Western blot建立KtyI中Nrf2蛋白的强烈增加^−/−和KtyII^−/−_K8公司E17.5和E18.5，但Keap1无差异。（E） 根据E16.5–E18.5胚胎的免疫组织化学，Nrf2在两个KO小鼠表皮中持续上调和核定位。棒材：（主要）50µm；（插入物）10µm*，P≤0.05。

角蛋白支架在不同阶段调节CE的形成

先前通过基因缺失对CE成分的分析表明，由于替代成分的上调，CE成分存在相当大的冗余(Segre，2006年；松井和阿马盖，2015年). 虽然遗传证据明确表明Krt1参与CE完整性(Candi等人，2005年；Roth等人，2012年b)，到目前为止，尚未研究E18.5原发性CE形成过程中角蛋白的总体需求。从WTs表皮提取的CE胰蛋白酶肽的质谱分析表明，除了适量的Krt75、Krt78和Krt5外，Krt1和Krt10以及三倍低量的Krt77是主要的CE成分(图7 A；Rorke等人，2015年). 根据质谱分析，其他角蛋白是非常微量的成分(图7 A). 我们注意到Krt1、Krt10和Krt77的掺入与它们在表皮中的已知分布一致，并且前体细胞角蛋白Krt15被排除在CE之外(《福斯与格林》，1980年). KtyI的CE分析^−/−和KtyII^−/−_K8公司幼鼠表现出明显的KIF依赖性改变。尽管抗体分析未检测到Krt10，但KtyII CE制剂的质谱显示Krt10含量有所下降^−/−_K8公司(图3，A和B; 和图7C). KtyI中II型蛋白的残留量^−/−比KtyII中的I型蛋白低两到三倍^−/−(图7、B和C). 在前者中，只有基底上表达的角蛋白存在(图7 B)而在后者中，基础Krt14的交联没有改变。与Krt16的mRNA水平远高于Krt17一致，这两种应激角蛋白在CE蛋白中都有相应的表达。因此，角蛋白是主要的CE成分。尽管存在大量的交联单个角蛋白，但这两种KO小鼠的广泛CE缺陷首次表明KIF是CE功能的先决条件。

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图7。

角蛋白是E18.5的主要CE成分。WTs和KtyI富集CE制剂的蛋白质组分析^−/−和KtyII^−/−_K8公司小鼠胚胎和随后的质谱分析。（A） 介绍了小鼠皮肤主要CE角蛋白的光谱计数。I型角蛋白用红色下划线，II型角蛋白则用绿色下划线。除Krt1和Krt10外，Krt77、Krt75和Krt78代表主要CE成分。（B） 与A中相同，但KtyI中的II型角蛋白^+/+和KtyI^−/−老鼠。注意到KtyI中除Krt6外的II型角蛋白显著减少^−/−交联样品。（C） 值得注意的是，KtyII中只有I型角蛋白Krt10显著降低^−/−_K8公司而Krt14和Krt17保持不变，KtyII中有更多Krt16交联^−/−_K8公司.*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001。

为了进一步证实这一点，我们根据非角蛋白CE成分的功能和在CE中的组装情况将其分为四类(Candi等人，2005年；Matsui和Amagai，2015年)即，（a）启动和增强（角质桥粒体、谷氨酰胺转胺酶和Sprr），（b）主要CE组成蛋白，（c）蛋白酶和蛋白酶抑制剂，以及（d）警报蛋白(图8). 相比之下，表皮SDS可溶性提取物的含量较低（图S4 C；Bär等人，2014年)，角质桥粒的组成蛋白在两种KtyI中的交联度显著增加^−/−和KtyII^−/−_K8公司除桥粒糖蛋白1外，这两个KO菌株中桥粒糖苷元1均减少(图8 A). 在没有角蛋白家族的情况下，更多的周斑蛋白和环斑蛋白（已知的早期CE成分）以及桥粒蛋白-斑球蛋白和嗜斑蛋白1和3被交联。相反，Tgm 1、3或Alox12b等酶分别对蛋白质交联和角朊细胞脂质合成至关重要(松井和阿马盖，2015年)，在CE交联组分中代表性不足(图8 A). 伴随着大多数Sprr的显著增加，包括Nrf2靶点Sprr2d、Sprr2f和Sprr2h。尽管其上调，屏障功能并未恢复(图5和​和8A）。8安). 因此，在没有KIF的情况下，改变了CE组装的早期步骤，但没有阻止。同时，除了S100家族成员的重复素增加外，两种KO中已知的主要CE成分洛里克林、霍纳林、丝聚蛋白和丝聚蛋白-2均减少(图8 B). E18.5 KtyII的CE中检测到残留洛林^−/−_K8公司动物很可能是在早期胚胎阶段生物合成的，这表明其周转缓慢(图5 E和图S5 B)。

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图8。

CE蛋白质组图谱依赖于角蛋白。根据是否存在I型和II型角蛋白的功能对CE成分进行分组。（A） CE启动和加固。KtyI中桥粒芯蛋白-1减少（蓝色下划线），但角质桥粒体和CE起始和增强蛋白增加^−/−和KtyII^−/−_K8公司将d与WT进行比较。两种KtyI中的转谷氨酰胺酶（tgm-1和-3）和花生四烯酸12脂氧合酶（alox12b）交联较少^−/−和KtyII^−/−_K8公司与WT相比。（B）除repetin外，两株KO菌株中的主要CE结构蛋白与WT相比较交联较少。（C）参与末端分化和屏障功能的蛋白酶和蛋白酶抑制剂的交联在KtyI中也发生了类似的变化^−/−和KtyII^−/−_K8公司与WT相比。组织蛋白酶-D（Ctsd）和Spink5用橙色下划线，仅在KtyII中改变^−/−_K8公司（D）增强KtyI中报警蛋白的交联^−/−和KtyII^−/−_K8公司与WT相比（红色哈希标记hspa2，在KtyII中上调^−/−_K8公司仅限）.*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001。

在KIF-缺乏的CE中，蛋白酶激肽释放酶6和7略有增加，而钙蛋白酶1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶14则相反(图8 C). 蛋白酶抑制剂蛇蛋白B2、B5、B12和钙蛋白酶1的失调表明角蛋白支架对这些酶活性进行空间控制，以确保CE组装和体内平衡。

全基因组关联和基因表达谱研究已将一组角蛋白与皮肤炎症联系起来(Quigley等人，2009年；Roth等人，2012年b；Lessard等人，2013年). 报警素增加，这是一组参与炎症疾病发病机制的蛋白质(Bianchi，2007年；Chan等人，2012年)也与Krt16缺失后的组织损伤和免疫激活有关(雀巢等，2009年；Lessard等人，2013年). 警报级别升高(图8 D)包括核仁蛋白和S100A9蛋白(Sakaguchi等人，2003年；Lessard等人，2013年)和抗炎性膜联蛋白A1(Lim和Pervaiz，2007年)或膜联蛋白A2，与丝聚蛋白相互作用并具有伴侣活性(Bunick等人，2015年)，表示在没有KIF的情况下宫内屏障救援反应。与Krt16分析预测的不同^−/−老鼠(Lessard等人，2013年)，警报素上调与Krt16的强烈增加同时发生(图8 D以及图S3、D和E）。此外，在两种KO小鼠模型中，包括参与表皮分化、伤口愈合和屏障形成的Hspb1在内的一些伴侣蛋白上调。类似地，两种KO-CE中交联半乳糖凝集素3和7均增加，已知其在伤口愈合的再上皮化中起作用(Gendronneau等人，2008年；潘杰瓦尼，2014). 在转录水平上也检测到KIF缺陷皮肤中警报蛋白的一般激活（图S5 C）。

这些发现首次将KIF确立为蛋白质网络的基本伙伴，该网络协调重要CE蛋白（loricrin、hornerin和filaggrin 2）、警报蛋白和伴侣蛋白的时空组装，这些蛋白不能通过其他成分的上调进行补偿。

单个角蛋白对维持单纯上皮细胞的胚胎发育

先前的研究已经确定胎盘发育是一个主要的发育阶段，与营养素需求增加同时发生，这一阶段依赖E9.5中的角蛋白(黑塞等人，2000年；Tamai等人，2000年；Jaquemar等人，2003年；Vijayaraj等人，2009年,2010；Kröger等人，2011年). 我们证明KtyII中角蛋白对K8/K19和K8/K18的表达^−/−_K8公司和KtyI^−/−小鼠分别克服了这一限制点，并在出生前保持简单上皮的形成，没有明显的粘附和增殖缺陷。当器官特异性免疫和代谢功能变得重要时，简单上皮角蛋白的大量冗余是否延伸到成人生活中(Alam等人，2013年；Mor-Vaknin等人，2013年)，有待研究。缺乏半胱氨酸残基的Krt8未能修复Krt5的皮肤脆弱性^−/−小鼠支持这样的观点，即选择性表皮角蛋白的Cys依赖性交联对于角蛋白组织提供分层上皮的应变弹性是必要的(阿尔瓦拉多和库伦，2014年)。

KIF是CE大会的重要组成部分和组织者

先前的数据表明，CE组成下的补偿性冗余概念旨在将表皮屏障维持在多个水平。例如，需要对周斑金、恩沃普拉金和involucrin进行三重KO来破坏屏障(塞维利亚等人，2007年). 当一种重要的CE成分loricrin缺失时，由抗氧化转录因子Nrf2介导的Sprr2d、Sprr2h和repetin的短暂上调足以恢复屏障(Koch等人，2000年；Huebner等人，2012年). 同样，丝聚蛋白KO小鼠的屏障完整性也有轻微改变(川崎等人，2012年). 即使tgm 1的失效，也会导致小鼠脱水导致围产期死亡，通过将新生tgm 1缺陷皮肤移植到成年裸鼠上，可以部分弥补这一缺陷(松木等人，1998年；Kuramoto等人，2002年). 最后，转录因子和染色质调节因子的失调，包括Satb1、Klf4、Arnt和AP1，与角化过度和表皮屏障缺陷有关(Segre等人，1999年；Geng等人，2006年；Fessing等人，2011年；Rorke等人，2015年)。

KtyI的蛋白质组比较^−/−和KtyII^−/−_K8公司在CE组装和屏障形成的不同阶段，CEs显示出KIF的绝对需求，但非丝状角蛋白同型的绝对需求。尽管KtyI中存在单独的角蛋白Krt1、Krt77和Krt75，但严重的CE缺陷突出了这一点^−/−或KtyI中的Krt10、Krt14和Krt16^−/−_K8公司老鼠(图7). 总的来说，KIF的缺失导致两种KO小鼠中大多数CE成分发生了非常相似的变化(图8)，确定洛里克林、角质素和丝聚蛋白2以及角蛋白是重要的CE成分(图8 B). 在它们不存在的情况下，与loricrin的缺乏相反(Huebner等人，2012年)，在产前角蛋白KO表皮中上调Nrf2靶基因未能恢复表皮内稳态(图5和​和6），6)，将Nrf2对羊水代谢物暴露的保护活性缩小到短时间窗口。鉴于KtyI的表皮形态^−/−和KtyII^−/−_K8公司胚胎在E15.5时完整，但在E18.5时明显改变(图2 A)然而，Nrf2增加可能通过多种机制导致观察到的过度角化和屏障缺陷(Schäfer等人，2012年,2014)。

早期CE组分（结蛋白、周蛋白、内皮素、嗜斑蛋白和血小板球蛋白）的交联增加，这与它们在总表皮蛋白中的下调或不变形成对比(图8 A和图S4 C）表明，KIF通常在有序掺入其他CE成分之前限制其交联(图8 B和图S5 A）。

KIF-依赖性CE缺陷提示角蛋白参与屏障疾病

终末分化由参与tgm 1和tgm 3、profilaggrin、桥粒成分和其他蛋白质加工的蛋白酶和蛋白酶抑制剂级联调节(泽文，2004；Samuelov和Sprecher，2015年). 值得注意的是，在这两种KO小鼠中，不同蛋白酶和蛋白酶抑制剂的CE掺入均失调，表明KIF参与CE形成和脱皮之间的平衡。除激肽释放酶6和7参与角质桥粒降解外(松井和阿马盖，2015年)其他蛋白酶如钙蛋白酶1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶14和组织蛋白酶D在缺乏KIF的情况下显著降低(图8 C). 有趣的是，缺乏后一种酶的动物也表现出表皮屏障缺陷，profilaggrin和tgm-1的处理发生改变(Egberts等人，2004年；松井和阿马盖，2015年). 这些和我们的结果为研究Krt1、Krt2e、Krt9和Krt10突变引起的表皮松解性鱼鳞病中角化过度的机制提供了理论基础(Szeverenyi等人，2008年). 相反，蛋白酶抑制剂Spink 5的上调，其基因多态性与特应性皮炎相关(Kato等人，2003年)表明角蛋白参与了与屏障相关的皮肤病。

聚丝蛋白和角质结构体蛋白（如DSG1）的突变与炎症性疾病有关，如特应性皮炎或多种过敏和代谢损耗（SAM综合征），很可能是通过屏障缺陷使环境因子进入并引发先天和适应性免疫反应(Palmer等人，2006年；Smith等人，2006年；雀巢等，2009年；Oji等人，2010年；Samuelov等人，2013年；松井和阿马盖，2015年；McAleer等人，2015年). 值得注意的是，SAM综合征具有与报道的Krt1、Krt16和Krt17缺陷小鼠相似的细胞因子谱，已知Krt1、Krt16和Krt17缺陷小鼠通过不同途径介导先天免疫反应(Kim和Coulombe，2010年；Roth等人，2012年b；Lessard等人，2013年；Chung等人，2015年). 两株KO菌株交联蛋白中Dsg1的减少(图8 A和图S5A）支持角蛋白突变也容易导致炎症性皮肤病的假设，包括特应性皮炎(Roth等人，2012年b). 在这个方向上，警报素的上调可能代表着在缺乏KIF的情况下试图恢复屏障功能并启动炎症反应(图8 D和图S5、A和C）。其中，hspb1和hsp90a1与过敏性接触超敏反应、炎症或伤口愈合有关(Crowe等人，2013年；Jayaprakash等人，2015年). 未来的工作必须阐明警报蛋白的上调如何取决于Krt16的状态(Lessard等人，2013年)。

KtyII的生成^−/−_K8公司老鼠

这些小鼠的产生和基因分型以前被描述为KtyII^−/−老鼠(Bär等人，2014年). 总之，Krt8转基因FVB/N小鼠(Nakamichi等人，2005年)五次回交至C57BL/6（KtyII^+/+_K8公司). 然后，C57BL/6 KtyII^+/负极老鼠(Vijayaraj等人，2009年)与KtyII交配^+/+_K8公司小鼠产生KtyII^−/−_K8公司两代后的小鼠（图S1 B）。

RNA提取、实时PCR、转录组分析和基因集富集分析

根据制造商的说明（15596-026；Life Technologies），使用TRIzol从E18.5胚胎皮肤中提取总RNA，提取苯酚/氯仿并沉淀，然后进行DNaseI处理（18047-019；Life Technologies）并使用RNeasy MinElute Cleanup试剂盒（74204；QIAGEN）进行纯化。根据供应商的说明，使用RevertAid H Minus First Strand cDNA合成试剂盒（K1631；Life Technologies），使用2µg总RNA进行cDNA合成。使用Taq聚合酶（A600X；Promega）进行半定量PCR。逆转录后，使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（K0221；Life Technologies）进行实时PCR，在ABI 7500仪器（Applied Biosystems）上运行，并使用7500软件v2.0.1进行分析。GAPDH被用作参考。引物序列列于表S2。

使用类似制备的cDNA，如前所述进行皮肤转录组分析(Roth等人，2012年b)使用三份来自E18.5胚胎的MouseWG-6v2.0 Expression BeadChip试剂盒（Illumina）。数据分析基于R统计语言（2.8.0；R开发核心团队）和Beadstudio 3.1.1.0软件（Illumina）。数据进行了分位数标准化。采用fold-change/p-value过滤器筛选差异表达基因；P值<0.05，表达变化>两倍，平均强度信号之间的差异大于背景值被认为具有统计学意义。P值的错误发现率通过Benjamini Hochberg方法进行调整。完整的转录组图谱将与相应小鼠的特征一起公布。

对于基因集富集分析，使用了分子特征数据库（MSigDB数据库v3.0；Broad Institute）。为了最小化噪声，使用平方根平均值计算每组的富集分数。P值使用t吨测验。

组织制备和组织化学

处死带有E18.5-d龄胚胎的怀孕雌性小鼠，并将胚胎的背部皮肤、胃和肠道样本嵌入Tissue-Tek（樱花）冷冻介质和snap在异戊烷中冷冻，在−80°C预冷用于冷冻切片，或在PBS中新制备的4%甲醛中固定过夜，并进行常规石蜡包埋处理(Roth等人，2012年b). 根据组织类型和方法，切片切割厚度为7-14µm。对于苏木精/伊红染色，切片在60°C下脱蜡30分钟，在二甲苯中洗涤两次，在2分钟的乙醇溶液浴（2×100%、1×95%、1×90%、1×80%、1×70%和1×50%）中逐渐再水合，并在染色前在蒸馏水中洗涤三次。将载玻片在苏木精溶液（1:6；109249；Merck）中培养15 s，在蒸馏水中快速冲洗两次，在冷自来水中冲洗10 min，在0.25%曙红溶液（E4382；Sigma-Aldrich）中培养45 s，然后在蒸馏水中短时冲洗两次。切片在乙醇浴中再次逐步脱水，浓度增加（1×30s 70%，1×30s95%，1×10s 100%），在二甲苯中2×5min。然后将节段安装在DPX安装介质（44581；Fluka）中。

组织样本的免疫染色

冷冻和石蜡包埋组织分别用CM3050 S冷冻刀和RM2255切片机（徕卡）切割。如前所述，对切片进行处理和染色(Vijayaraj等人，2009年；Kröger等人，2013年). 所用抗体和染料列于表S3对于表皮中NRF2的免疫组织化学，如前所述处理4-µm石蜡包埋组织切片(Roth等人，2012年b). 根据制造商的方案使用二级抗体（HK-9KT；BioGenex）和揭示试剂（QP900-9；BioGenerx；和K3468；Dako）。抗体列于表S3中。通过测定Ki-67染色细胞在DAPI染色的上皮细胞总数中的百分比来评估肠和表皮的细胞增殖。

显微镜

使用Axioplan2（卡尔蔡司）对25/0.8 NA、40/1.3 NA或63/1.25 NA油浸目标进行组织学分析和免疫组织化学记录。ApoTome.2成像仪。Z2配备AxioCam 506彩色和AxioCam Mrm摄像头（卡尔蔡司），用于Ki-67免疫荧光Ki-67标记组织切片的z堆叠，使用25/0.8 NA和40/1.3 NA油浸物镜。用配备40/1.3 NA或63/1.46 NA浸油的蔡司LSM 780共聚焦显微镜收集荧光标记细胞和组织的z堆。使用ZEN软件2010和2011（卡尔蔡司）、AxioVision Rel.4.8（卡尔蔡司）、NIS-Elements（尼康）和Photoshop CS5.1（Adobe）进行图像分析和处理。为了定量表皮厚度，使用AxioVision线性测量工具测量每只动物12到20个随机选择的区域。

电子显微镜

将E18.5小鼠的皮肤样品切除，直接固定在4%甲醛/1%戊二醛中2 h，在1%OsO4中1 h。固定样品在0.05 M马来酸钠缓冲液（pH 5.2）中用0.5%醋酸铀酰处理2 h，黑暗中，然后脱水，用丙酮作为中间物嵌入人造石中。聚合在60°C下进行48小时。使用金刚石刀用超薄切片机（徕卡）制备半薄和超薄切片。为了增强对比度，用3%醋酸铀酰处理切片5分钟，用0.08 M柠檬酸铅溶液处理切片3分钟。使用iTEM软件（Olympus）在EM10（卡尔蔡司）上用数码相机（奥林巴斯）拍摄图像。

甲苯胺蓝染料皮肤渗透性测定和显微镜CE分离

用甲苯胺蓝染料渗透试验研究E18.5胚胎的皮肤通透性(Hardman等人，1998年). 切割小片胚胎尾部以进行阳性对照试验。然后将幼崽轻轻地放置在基于PBS的连续浴中，每个浴具有不同的甲醇浓度1分钟：0%、25%、50%、75%、100%（2分钟）、75%、50%、25%和0%。然后将胚胎置于过滤的0.0125%甲苯胺蓝溶液中5分钟，然后在PBS中单次洗涤并用立体显微镜（SMZ1500；尼康）获取图像。

如前所述，分离CE(Jarnik等人，1996年). 将总皮肤在95°C的CE提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.2%十二烷基硫酸钠，20 mM DTT和5 mM EDTA）中培养10分钟。在5000℃离心收集CE克在CE提取缓冲液中进一步清洗CE。将颗粒化的CE溶解在0.2%SDS溶液中，并使用血细胞仪进行计数。将所有标本中相同数量的CE放在盖玻片上，并拍摄图像。计算完整和改变的CE数量。

CE萃取用于质谱分析

为了进行蛋白质分析，通过热处理分离小鼠表皮(Macdiarmid和Wilson，2001年). 在断头和阑尾切除后，通过背部纵向切除分离E18.5小鼠胚胎的皮肤，在55°C下加热2分钟，放置在冰冷的PBS中3分钟，然后将其展开（用组织轻轻轻拍以去除PBS）在皮氏培养皿上，表皮面朝下。然后用镊子轻轻挑逗去除真皮，收集半透明表皮。将表皮置于1.5 ml 2%十二烷基硫酸钠和0.1 M磷酸钠（pH 7.8）溶液（CE提取缓冲液II[CE-II]）中，旋转并在100°C下加热10 min。添加5 ml CE-II并在5000℃离心后收集CE克在室温下保持15分钟。将CEs在1.5 ml CE-II中再清洗两次，并在70°C下加热过夜。然后将CE清洗三次，通过离心收集，并在Speedvac（Univapo 100H；UniEquip）中干燥。然后在90°C下将颗粒在2%十二酸钠、50 mM碳酸氢铵和25 mM二硫苏糖醇中萃取四次，持续15分钟，然后在黑暗中室温下用50 mM碘乙酰胺进行烷基化，并搅拌(赖斯，2011年). 消化物用三氟乙酸酸化，用乙酸乙酯萃取三次，用氨水和碳酸氢铵缓冲液将pH调至8.0，用还原甲基化牛胰蛋白酶消化(赖斯等人，2012年)，并使用Q-Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行分析。使用X！搜索UniProt数据库（20140310；87012个条目）！Tandem（CYCLONE版本，2013.02.01.1；GPM）和Scaffold软件（4.4.1.1版本；Avontus软件）用于验证之前描述的基于MS/MS的肽和蛋白质鉴定(Rice等人，2013年；Laatsch等人，2014年). 基于诱饵肽库的肽和蛋白质识别的错误发现率估计分别为0.2%和2.6%。通过共享肽的蛋白质簇中的排他计数验证蛋白质存在后，结果显示为归一化加权光谱计数。在Krt10低的样品中，图示值最大。

细胞培养

从E18.5 WTs和KtyI的表皮分离出角质形成细胞^−/−和KtyII^−/−_K8公司胚胎和培养(Kröger等人，2013年). 简言之，通过在4°C下将皮肤放置于脱皮液（5 mg/ml）中过夜，然后进行手工切割，将表皮与真皮分离，从E18.5胚胎中获得表皮片。将表皮片置于PBS 0.025%胰蛋白酶和0.02%EDTA中37°C下5分钟，分离角质形成细胞。如前所述培养细胞(Kröger等人，2013年；Seltmann等人，2013年b). KtyI公司^−/−稳定表达小鼠K14或K17（KtyI^−/−_K14号公路或KtyI^−/−_K17号公路)在相同条件下培养，但在培养基中加入选择剂，并按上述方法生成(Homberg等人，2015年)。

蛋白质印迹

将溶解的组织样品保存在含有蛋白酶抑制剂（78439；Thermo Fisher Scientific）的5×Laemmli缓冲液中，用T10碱性ULTRA-TURRAX（IKA）均质，并重复加热（95°C）和超声处理以提取总蛋白。随后进行SDS-PAGE和Western blotting，如前所述(Vijayaraj等人，2009年). 初级和次级抗体列于表S3中。

线粒体脂质定量

如前所述，使用与TOM22抗体偶联的磁珠从培养的角质形成细胞中分离线粒体(Hornig-Do等人，2009年). 简而言之，细胞（10⁷)通过29G针头剪切约20次，在1ml冰镇PBS中溶解，包括完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）。将粗细胞裂解液与25µl抗TOM22微球在4°C下孵育60分钟，以进行磁性标记。将悬浮液加载到预先平衡的MACS柱（Miltenyi Biotec）上，该柱置于MACS分离器（Miltenxi Biotech）的磁场中。用3 ml PEB缓冲液（PBS，pH 7.2，2 mM EDTA和0.5%BSA）清洗色谱柱三次。从磁场中取出柱后，用5 ml PEB缓冲液洗脱残留的线粒体。在~13000℃离心后克在1分钟内，用0.32 M蔗糖、1 mM EDTA和10 mM Tris-HCl清洗线粒体颗粒两次，并保存在-80°C下。使用Bradford分析法估计线粒体颗粒的蛋白质浓度。为了通过质谱法分析PC、PE、PI、PS、PG和PA，将相当于75µg的蛋白质悬浮在500µl水中。使用中描述的“一步提取”提取脂质Ùzbalci等人（2013），方法修改自布莱和戴尔（1959）在120–165 pmol的下列内标物（Avanti Polar Lipids）存在下进行油脂提取：PC 17:0-14:1、PC 17:0-20:4、PE 17:0-14:、PE 17:00-20:4，PI 17:00-14:1，PI 17:0-20-4，PS 17:0-14/1，PS 17:00-20-4、PG 17:0-14、PG 17:0-20:、PA 17:0-14:和PA 17:0-20:4。将干燥的油脂提取物溶解在300µl甲醇中。将20µl甲醇中的脂质提取物装入96 well板中，并用20µl20 mM甲醇中的醋酸铵稀释。使用Nano-ESI芯片和ChipSoft软件（Advion）操作的TriVersa NanoMate在以下设置下进行脂质输注和电离：样品输注量：14µl，样品后抽吸的空气量：1µl、芯片前的空气间隙：启用，抽吸延迟：0 s，预穿孔：带心轴，喷雾传感：启用，冷却温度：14°C，气体压力：0.5 psi，电离电压：1.4 kV，排气顶空：启用。预润湿一次。

使用分析员1.6.2操作的QTRAP 6500（SCIEX）进行质谱分析。使用了以下仪表相关设置：气幕气体，20 psi；CAD气体，介质；接口加热器温度，100°C。在正离子模式下，通过在35eV的碰撞能量下扫描m/z184的前体进行PC分析。在正离子模式下，通过在25eV的CE下扫描141185189277和115D的中性损耗进行PE、PS、PG、PI和PA测量。去簇电位的值为100V(Özbalci等人，2013年). 扫描在m/z 650–900 D的质量范围内进行，扫描速度为200 D/s。累计61个MCA光谱。质谱由LipidView软件1.2版（SCIEX）处理，用于甘油磷脂的鉴定和定量。通过将其峰面积归一化为内标物的峰面积，对内源性甘油磷脂进行定量。

通过TLC对CL进行分析。

TLC分析

添加两种线粒体悬浮液，分别置于1 ml水中（含约200µg蛋白质）、2 ml甲醇和1 ml氯仿中。在37°C下提取脂质24小时。通过过滤分离液相，并在氮气流中蒸发溶剂。如前所述，使用改良的Bligh-Dyer程序纯化脂质残留物(Signorelli和Hannun，2002年). 将脂质提取物应用于20×10-cm-高性能TLC硅胶60板（Merck），用氯仿/甲醇1:1（vol/vol）预洗两次，并风干30分钟。在TLC板的每条通道上装载相当于80µg蛋白质的物质(n个= 3). 使用氯仿/甲醇/冰乙酸65:28:8（vol/vol/vol）作为溶剂系统分离甘油磷脂。对于定量分析TLC测定，除脂质样品外，在TLC板上添加更多的CL标准物（Sigma-Aldrich）。为了检测脂带，用磷酸/硫酸铜试剂（15.6 g CuSO）喷洒TLC板₄（H）₂O）₅和9.4毫升H_三人事军官₄【85%，wt/vol】溶于100 ml水中）并在180°C下烧焦10分钟(Yao和Rastetter，1985年). 然后使用TLC-Scanner 3（CAMAG）在595nm波长下通过密度测定法对脂质带进行定量。

内源性和非耦合呼吸的测量

角质形成细胞在测量前24小时随培养基变化呈指数增长。细胞在胰蛋白酶化后以1–2×10的密度重新悬浮⁶37°C时PBS中每毫升。在PBS中使用Clark型氧电极（Hansatech Instruments）监测耗氧量。

细胞ATP含量的测量

根据制造商的说明，使用CellTiter-GloTM发光细胞活性测定试剂盒（Promega）定量活细胞中的ATP水平。简而言之，将冻干酶/底物混合物（100µl）转移到含有细胞裂解物的不透明96 well微孔板中。然后在室温下培养微孔板10分钟，以稳定相对发光信号，然后使用GENios微孔板阅读器（Tecan）测量相对发光信号。对应于相对发光信号的ATP浓度由ATP标准曲线确定。使用BCA分析（Thermo Fisher Scientific）估算细胞提取物中的蛋白质浓度。细胞ATP水平表示为每毫克细胞蛋白的纳米。

统计分析

所有实验都至少进行了三次。平均值、标准偏差和t吨使用Excel软件计算试验结果（Microsoft；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P＜0.001）。使用SigmaPlot软件生成图形。

我们感谢Gabriele Baumbach、Maria Bust、Sabine Eisner、Romina Kühne和Miriam Richter的技术援助，以及Michelle Salemi和Brett S.Phinney博士的质谱分析。我们也非常感谢Omary Bisher教授提供K8转基因小鼠。

马金实验室的工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（DFG；MA1316-15、MA1316-17、MA1316-19、MA1316-21和INST 268/230-1）和莱比锡再生医学转化中心（No.0315883）的支持。Leube实验室的工作得到了DFG（LE566-18-1）和亚琛Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule医学院START-Program的支持。威斯纳实验室的工作得到DFG（Wi 889/6-2）的支持。美国国立卫生研究院拨款2 P42 ES04699（R.H.Rice）支持质谱分析。

作者声明没有竞争性的经济利益。