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细胞死亡疾病。2015年7月；6（7）：e1802。
2015年7月2日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cddis.2015.150
预防性维修识别码：项目经理4650715
PMID：26136075

林肯HOTAIR公司表观遗传沉默34a英里与PRC2结合促进人胃癌上皮细胞向间质细胞转化

Y-w刘,1,5 M太阳,1,5 R夏,1 E-b张,4 X-h刘,1 Z-h张,2 T-p Xu公司,2 W De公司,1,* B-r刘,三，*和Z-x王4,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

lncRNAs在致癌发生和进展的表观遗传调控中发挥重要作用。以前的研究表明HOTAIR公司有助于胃癌（GC）的发展，以及HOTAIR公司预测预后不良。在这项研究中，我们发现热空气在弥漫型GC中的表达高于肠型(P（P）=0.048). 在扩散型中HOTAIR公司表达式和DFS(P（P）<0.001). CDH1在弥漫型GC组织中下调(P（P）=0.0007），并与HOTAIR公司(第页2=0.154,P（P）=0.0354). 此外，HOTAIR公司敲除显著抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移体外和活泼地逆转GC细胞的上皮-间充质转化。我们还展示了HOTAIR公司招募和结合PRC2表观遗传抑制34a英里控制靶C-Met（HGF/C-Met/Snail通路）和Snail，从而促进GC细胞-EMT过程并加速肿瘤转移。此外，还证明了HOTAIR公司表观遗传调控期间与microRNA的串扰。我们的结果表明HOTAIR公司作为EMT调节器，可能是GC患者的候选预后生物标志物和新疗法的靶点。

胃癌是全球第四大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。1胃癌患者预后不良的主要原因是手术切除后肿瘤复发或转移的频率较高。2化疗和分子靶向治疗是晚期胃癌的主要治疗方法。因此，更好地了解与胃癌转移相关的早期事件有助于降低死亡率和提高患者的生活质量。

在过去的几十年里，细胞和肿瘤生物学家已经确定了上皮-间充质转化（EMT）在癌细胞侵袭和转移中的关键作用，这是上皮细胞失去极性并转变为间充质表型的生物学过程。三最近的证据表明，EMT可以通过促进Rac依赖的间充质细胞迁移来增强癌细胞的侵袭性，并有助于癌细胞的增殖和存活。4,5一般来说，EMT的重要特征包括E-钙粘蛋白的丢失和非上皮性钙粘蛋白（如vimentin和N-cadherin）的表达增加。E-cadherin表达的丢失是EMT过程中的一个基本事件，也是乳头状瘤向浸润性癌发展的关键步骤。6有研究表明，表观遗传变化，如microRNAs（miRNAs）、组蛋白修饰和DNA甲基化，都与癌细胞EMT有关。7,8,9例如，34a英里抑制上皮-间充质转化和癌细胞迁移。10在结直肠癌中miR34a增强Snail的表达并激活IL-6 R/STAT3信号传导以诱导EMT。11,12同时，我们之前的研究发现长非编码RNA（lncRNA）BANCR银行通过调节EMT促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移。13

据估计，98%的人类基因组转录物是非编码RNA（ncRNAs），它们形成了一个高度复杂的调控网络，在肿瘤发生中具有多种生物功能。14lncRNAs是ncRNA家族中重要的新成员，它们大于200 nt，没有蛋白质编码能力。最近，研究人员将异常lncRNA表达与多种人类疾病，特别是癌症联系起来。15,16因此，胃癌相关lncRNA的鉴定及其控制EMT的分子机制的研究对于理解胃癌转移和进展的分子生物学具有重要意义。lncRNA HOX反义基因间RNA(HOTAIR公司)首次确认于2007年。17最近，许多研究表明HOTAIR公司在结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和胃肠道间质瘤中过度表达，与不良临床结局呈正相关。18,19,20,21的活动HOTAIR公司部分原因是其与多梳抑制复合物2（PRC2；EZH2、SUZ12和EED）的相互作用，该复合物增强HOXD位点的组蛋白H3赖氨酸-27三甲基化，从而降低HOXD的多基因表达。17我们之前的研究表明HOTAIR公司胃癌组织中的表达增加，与恶性特征和预后不良有关。此外，HOTAIR公司促进胃癌细胞增殖体内和在体外通过竞争“海绵”miR-331-3p。22然而HOTAIR公司参与胃癌细胞转移的机制目前尚不清楚。

在这项研究中，我们发现HOTAIR公司在弥漫型胃癌中的表达高于肠型胃癌，并且与E-钙粘蛋白.高表达HOTAIR公司弥漫型胃癌预测DFS较差。其他实验表明HOTAIR公司敲除显著抑制迁移、侵袭和转移在体外和体内逆转胃癌细胞EMT。此外，HOTAIR公司也表观遗传下调34a英里通过与PRC2结合以激活其靶基因C-Met（HGF/C-Met/Snail通路）和Snail，从而促进胃癌晚期的EMT。我们的发现为lncRNA调节miRNA表达的机制提供了新的见解。

结果

人胃癌组织中HOTAIR和CDH1的表达水平

弥漫型胃癌的转移行为强于肠型胃癌。我们之前确定HOTAIR公司在癌组织中表达明显上调。22在这项研究中，人类胃癌组织的组织病理学分类为肠道(n个=35）和漫射类型(n个=26).HOTAIR公司弥漫型胃癌中的表达明显增高(P（P）=0.048）与肠道型胃癌相比(图1a). 检查两者之间的相关性HOTAIR公司表达和临床病理特征表明HOTAIR公司上调与淋巴结转移和血管浸润相关(表1). 为了无病生存HOTAIR公司与低表达患者相比，表达患者的预后明显较差HOTAIR公司弥漫型胃的表达(P（P）<0.001，log-rank检验；图1b); 然而，两者之间没有显著相关性HOTAIR公司肠型胃癌的表达及预后(图1c).CDH1型是胃癌重要的转移标志物。我们检测到CDH1表达qPCR和免疫组织化学方法。CDH1型在癌组织中表达下调(P（P）<0.001），60%的弥漫型胃癌组织为阴性(图1d和e). 此外，HOTAIR公司与CDH1型(第页2=0.154,P（P）=0.0354;图1f). 这些结果表明热空气过度表达在胃癌转移中起着重要作用，可能有助于开发新的晚期胃癌预后或进展标志物。

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相对HOTAIR公司胃癌组织中的表达及其临床意义。(一)的相对表达式HOTAIR公司在肠型胃癌中(n个=35）与弥漫型胃癌相比(n个=26).HOTAIR公司通过qRT-PCR评估表达并归一化为GAPDH表达。最终结果显示肿瘤组织相对于正常组织的折叠变化。高表达时折叠变化≥2.0，低表达时<2.0。数据显示为肠组织相对于弥散组织的折叠变化。(b条和c（c）)Kaplan–Meier无病生存曲线HOTAIR公司不同胃癌类型的表达水平。(d日)CDH1在弥漫型胃癌与正常组织中的相对表达(n个=29). (e（电子）)上部：正常组织样本中的E-cadherin免疫染色。下：E-钙粘蛋白免疫染色在弥漫型胃癌组织中呈阴性。(如果)表达式之间的相关性分析HOTAIR公司29个配对肿瘤中的E-cadherin*P（P）<0.05和**P（P）<0.01

表1

HOTAIR在胃癌中的表达与临床病理特征的相关性
特点N个（%）HOTAIR公司一
P（P）-价值
  高低 
性别   0.295
男性38 (62)1721 
女性23 (38)716 
年龄   0.605
≤6531 (51)1120 
>6530 (49)1317 
阶段   0.092
I–II级18 (30)414 
III–IV43（70）2023 
淋巴结转移   0.05*
≤222 (36)517 
>239 (64)1920 
血管侵入   0.05*
是的28 (46)1810 
不33 (54)627 

*P（P）<0.05被认为是显著的（两组之间的χ2检验）。

一高表达时折叠变化（FC；肿瘤组织相对于正常组织）≥2.0，低表达时<2.0。

胃癌细胞HOTAIR表达的调控

为了调查HOTAIR公司关于胃癌细胞的侵袭和转移，我们首先检测了HOTAIR公司,34a英里以及通过qRT-PCR在各种癌症细胞系中的EMT标记。如所示补充图S1A在5种胃癌细胞系（SGC-7901、BGC-823、MGC-803、AGS和MNK45）中，BGC-822表达较高水平的HOTAIR公司（4.11倍）和更低水平的34a英里（0.11倍）和CDH1型（0.17倍）；然而，SGC-7901表达相对较低HOTAIR公司和更高34a英里和CDH1型表达式。因此，我们选择SGC-7901和BGC-823作为实验细胞系。结果表明：HOTAIR公司si-HOTAIR1#和si-HOTAIR2#可有效抑制BGC-823和SGC-7901细胞的表达(图2a)随后在进一步的实验中使用。sh-HOTAIR的效率如所示补充图S2A.

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HOTAIR公司-促进胃癌细胞侵袭、转移和EMT。(一)qRT-PCR用于检测热空气用si-HOTAIRs表达BGC-823和SGC-7901细胞。(b条)Transwell分析用于研究GC细胞迁移和侵袭能力的变化。(c（c）)显示了每个实验组小鼠的肺，以及肺表面肿瘤结节的数量和重量。(d日)整个肺和HE染色肺切片的可视化。(e（电子）和如果)用si-HOTAIR对BGC-823和SGC-7901细胞中的E-cadherin、N-cadherin和vimentin进行Western blotting和qRT-PCR分析。所有实验均一式三份，共有三份技术副本*P（P）<0.05和**P（P）<0.01

HOTAIR促进胃癌细胞侵袭转移在体外和体内

为了调查HOTAIR公司对胃癌细胞的迁移和侵袭进行了Transwell分析，结果表明HOTAIR公司减少BGC-823和SGC-7901细胞的侵袭和迁移(图2b). 研究体内HOTAIR，我们使用了尾静脉化验。Transwell分析证明，sh-HOTAIR1#和sh-HOTIAR2#处理均能降低BGC-823细胞的侵袭和迁移(补充图S2B). Western blot分析证明sh-HOTAIR1#治疗增加了BGC-823细胞的上皮标志物E-cadherin(补充图S2C). 此外，小鼠尾静脉注射sh-HOTAIR稳定转染的BGC-823细胞。注射7周后，处死小鼠并收集肺组织。正如预期的那样sh-HOTAIR公司与pENTR载体组相比，该组肺转移的频率较低，体重减轻较少(图2c). 通过肺切片的苏木精-伊红（HE）染色对整个肺进行检查，进一步证实了这种差异(图2d). 综上所述，这些结果表明HOTAIR公司具有转移活性，其上调可能促进胃癌细胞的转移。

HOTAIR通过诱导EMT促进胃癌细胞转移

接下来，我们调查了如何HOTAIR公司促进胃癌细胞的转移。由于EMT是导致肿瘤转移的关键事件，我们评估了HOTAIR公司对胃癌细胞EMT过程的影响。首先，我们观察到用si-HOTAIR转染的BGC-823和SGC-7901细胞部分恢复了上皮细胞的极性，显示出鹅卵石样的形态(补充图S1C). 然后，我们检测了EMT分子标记的mRNA和蛋白表达水平HOTAIR公司击倒。上皮标记物E-cadherin的表达(CDH1型)在中较高HOTAIR公司与对照细胞相比，敲低细胞。相比之下，包括N-钙粘蛋白和波形蛋白在内的间充质标记物在HOTAIR公司敲除BGC-823和SGC-7901细胞(图2e和f). 此外，我们使用稳定转染细胞获得了相同的结果，即与对照细胞相比，sh-HOTAIR细胞中E-cadherin的表达增加；然而，BGC-823细胞sh-HOTAIR中的N-钙粘蛋白和波形蛋白减少(补充图S2C). 这些结果表明HOTAIR公司可能通过诱导EMT促进胃癌细胞转移。

HOTAIR下调胃癌中miR34a的表达

最近，越来越多的证据表明，lncRNAs可能调节其他类别的ncRNAs，包括miRNAs。调查是否HOTAIR公司我们使用基因集富集分析（GSEA）软件（马萨诸塞理工学院，马萨诸塞州剑桥市，美国）来分析miRNA的表达通用电气47638数据并预测潜在的miRNAHOTAIR公司下游。我们发现各种miRNAs可能是HOTAIR公司下游，以及补充图S1D显示了6个miRNAs的靶基因，它们在HOTAIR公司接下来，研究这些miRNAs是否可以被HOTAIR公司在胃癌细胞中，我们随后在si中检测到miRNAs-HOTAIR公司-转染BGC-823或SGC-7901细胞，发现miR34a与对照细胞相比，表达上调了4.2倍(P（P）<0.01,图3a和b). 然后我们检测到34a英里在胃癌组织中的表达并发现34a英里肿瘤组织中的表达减少(图3c)与HOTAIR公司弥漫型和肠道型的表达(第页2=0.857和0.702，P（P）<0.001;图3d和e). 这些数据表明HOTAIR公司可能下调监管34a英里表达并促进胃癌细胞转移。

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表达式之间的相关性HOTAIR公司和34a英里. (一和b条)34a亿南非兰特qRT-PCR检测si-HOTAIR在BGC-823和SGC-7901细胞中的表达。所有实验均一式三份，共有三份技术副本。(c（c）)的表达式级别34a英里用qRT-PCR检测61例配对肿瘤和瘤周胃癌。(d日和e（电子）)表达式之间的相关性分析HOTAIR公司和34a英里在弥漫型和肠型胃癌组织中进行了检测*P（P）<0.05和**P（P）<0.01

HOTAIR通过招募PRC2沉默miR34a表达

据报道，20%的lncRNAs可以结合多梳组蛋白（PcG）复合体来调节下游基因转录。EZH2是PRC2的一个关键亚基，也包括SUZ12和EED，是一种组蛋白甲基转移酶，通过三甲基化组蛋白H3赖氨酸27（H3K27me3）来抑制下游基因转录。23,24确定是否HOTAIR公司调节34a英里通过与PRC2结合表达水平，我们使用嵌入UCSC基因组浏览器（UC Santa Cruz，CA，USA）中的ENCODE组蛋白修饰轨迹，发现H3K27me3在34a英里启动子区(图4a). 此外，我们还验证了HOTAIR公司位于胃癌细胞的细胞核和细胞质中(补充图S1B)和RNA免疫沉淀（RIP）分析表明HOTAIR公司可以绑定到PRC2(图4b). 我们用si-RNA在BGC-823、MGC-803和SGC-7901细胞中敲除EZH2和SUZ12(图4c和d)并证明了34a英里与对照组相比上调；然而，375百万兰特与对照组相比，表达式没有更改(补充图S3A). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析结果表明，EZH2可以直接结合到34a英里并介导H3K27me3修饰，同时击倒HOTAIR公司和EZH2型导致EZH2和H3K27结合能力降低(图4e和f). 总之，这些数据表明HOTAIR公司招募PRC2复合体保持沉默34a英里通过H3K27me3修改。

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协会HOTAIR公司PRC2蛋白复合物对其调节miR34a. (一)基因组浏览器并分析了34a英里启动子区。(b条)RIP实验使用EZH2抗体进行免疫沉淀。特定底漆HOTAIR公司用于检测热空气. (c（c）和d日)的表达式34a英里在转染si-EZH2、si-SUZ12的BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞中，用qRT-PCR检测到si-SUZ12。(e（电子）和如果)对转染Si-HOTAIR和Si-EZH2细胞的SGC-7901进行ChIP分析34a英里启动子区使用抗H3K27me3和EZH2抗体。相对于输入控制确定富集度。所有实验均一式三份，共有三份技术副本*P（P）<0.05和**P（P）<0.01

激活HGF/Met/Snail通路上调HOTAIR增强胃癌细胞转移

接下来，我们研究了34a英里在里面HOTAIR公司-诱导EMT和促进转移。34a亿南非兰特模拟物转染BGC-823和SGC-7901细胞以上调miR34a表达，qPCR显示34a英里表达增加34a英里mimics转染胃癌细胞(图5a). Transwell分析显示34a英里表达显著抑制BGC-823和SGC-7901细胞的迁移(图5b). HGF/Met/Snail通路在EMT和转移中起着关键作用，其受34a英里.25,26,27,28始终miR34a在BGC-823和SGC-7901细胞中，其靶标C-Met和Snail的蛋白质水平显著降低，而E-钙粘蛋白上调，N-钙粘蛋白和波形蛋白下调(图5c). 免疫荧光分析还显示34a英里蜗牛蛋白表达降低并不影响其在胃癌细胞中的亚细胞定位(补充图S3C). 相比之下，联合转染34a英里BGC-823和SGC-7901细胞中的模拟物和pcDNA HOTAIR部分逆转了C-Met、Snail、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达(图5d和e). 这些数据表明

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HOTAIR公司通过沉默诱导EMT34a英里在胃癌中。(一)qRT-PCR用于检测34a英里BGC-823和SGC-7901细胞的表达34a英里模仿。(b条)Transwell分析用于研究胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化34a英里模仿。(c（c）)采用Western blot方法检测BGC-823和SGC-7901细胞中C-Met、蜗牛和EMT标记物的蛋白34a英里模仿。GAPDH作为对照。(d日和e（电子）)Western blot和qRT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin和vimentin；BGC-823和SGC-7901细胞中的C-Met和蜗牛。所有实验均一式三份，共有三份技术副本*P（P）<0.05和**P（P）<0.01. (如果)的绑定HOTAIR公司PRC2导致表观遗传沉默34a英里，向下表达34a英里促进C-Met转录，激活HGF/C-Met/诱导蜗牛基因转录；此外，miR34a直接调节Snail的翻译，抑制E-钙粘蛋白的转录以促进胃癌中的EMT

HOTAIR公司通过依赖34a英里.

讨论

在过去50年中，全球胃癌的发病率和死亡率显著下降；然而，仍有大量胃癌患者因复发和转移而预后不良，尤其是亚洲的弥漫型胃癌。29最近，一项研究表明，近76%的GENCODE（美国马里兰州贝塞斯达国家人类基因组研究所）注释的lncRNAs在胃癌和正常胃组织中有差异表达。这表明lncRNA可能在致癌作用中发挥重要作用，并可能有助于发现胃癌的新生物标志物和治疗靶点。30例如，H19型在胃癌中表达上调，其过表达与胃癌患者预后不良相关，并促进癌变和转移。31在这项研究中，我们的结果表明HOTAIR公司表达与静脉浸润、弥漫型胃癌和DFS较差有关。这些发现表明HOTAIR公司在胃癌的侵袭性和转移性中起着至关重要的作用，可能是胃癌新的转移或预后标志物。

最近的研究表明，EMT是参与癌细胞转移和进展的重要分子机制。EMT的标志是E-钙粘蛋白表达缺失，N-钙粘蛋白和波形蛋白表达上调。32,33,34,35EMT由转录因子或外部信号启动，如蜗牛、扭转、Zeb和HGF。36,37除了由膜受体触发的这些信号通路外，最近的研究还强调了ncRNAs通过控制EMT诱导物调节上皮表型的重要性。38 200百万兰特是通过抑制ZEB1维持上皮表型的主要阳性调节物之一。39此外，lncRNA马拉特-1通过调节ZEB1、ZEB2和Slug的表达，激活Wnt信号通路，促进EMT。40在这项研究中，我们证明了HOTAIR公司表达有助于显著抑制细胞迁移、侵袭和转移。此外HOTAIR公司表达导致胃癌细胞中E-cadherin的表达显著增加，但N-cadherin和vimentin的表达降低。这些结果表明HOTAIR公司介导胃癌细胞迁移和转移，也可能通过影响EMT。

最近，越来越多的证据表明，lncRNAs可能与包括miRNAs在内的其他类别的ncRNAs相互作用，并表观遗传学调控多个基因的表达，包括那些参与染色质修饰、转录和转录后处理的基因。例如，HOTAIR公司作为“CeRNA”通过海绵调节HER2表达miR-331-3p以促进胃癌的增殖。22,41,42大约20%的lncRNA可以募集PcG复合物来调节基因表达。43EZH2可以表观遗传学沉默下游基因转录，并且在包括胃癌在内的几种癌症中过度表达。44,45,46在这项研究中，我们证明了HOTAIR公司招募并与PRC2结合以表观遗传学沉默34a英里表达促进胃癌细胞EMT进程和转移。

此外，miR34a表达下调，与HOTAIR公司胃癌组织中的表达。确定的目标34a英里包括CDK4/6、细胞周期蛋白E2（CCNE2）、细胞周期素D1（CCND1）、E2F3、c-Met和蜗牛，47,48,49HGF/C-Met/Snail通路在EMT和癌细胞转移中起重要作用。27,38,50HGF与其受体c-Met结合导致自身磷酸化，然后激活Ras/Raf/MAPK通路，从而诱导蜗牛基因转录。27同时，34a英里通过与蜗牛3′UTR结合并抑制蛋白质编码，直接调节蜗牛翻译。11在本研究中34a英里显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力在体外并通过靶向Met和蜗牛来抑制胃癌细胞的EMT。此外，上调HOTAIR公司可以部分逆转密歇根州34a过度表达介导的C-Met、E-钙粘蛋白、N-cadherin、vimentin和蜗牛表达。

LncRNAs被认为是预后和治疗干预的潜在靶点。我们在这里描述了一种新的机制HOTAIR公司简化表达式34a英里：（i）HOTAIR公司招募并结合PRC2表观遗传沉默34a英里; （ii）其继而激活C-Met并因此导致Snail转录的激活；和（iii）Snail表达上调促进胃癌中的EMT(图5f). 预后意义HOTAIR公司表达将帮助我们更好地预测复发风险。最后，这些数据为RNA调控网络提供了新的见解，表明lncRNAs不仅以蛋白质为靶点，还通过染色质修饰影响miRNA的表达。针对两者的个体治疗34a英里和HOTAIR公司可以改善治疗。

材料和方法

组织样本

本研究从2011年3月至2011年12月在江苏省人民医院肿瘤外科、南京医科大学和苏北人民医院获得61例胃癌患者的匹配肿瘤组织和邻近非肿瘤组织。两位病理学家根据世界卫生组织（WHO）指南和pTNM国际癌症控制联盟（UICC）的病理分期标准对所有标本进行了评估。手术前未对这些患者进行局部或全身治疗。组织立即在液氮中冷冻，并在使用前储存在−80°C。所有患者均获得知情同意。江苏省人民医院和苏北市人民医院人体研究伦理委员会批准了该研究。

总RNA提取定量实时聚合酶链反应

按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（德国卡尔斯鲁厄的Invitrogen）从培养细胞和冷冻组织中提取总RNA。采用定量实时聚合酶链反应（PCR）检测HOTAIR公司和34a英里根据制造商的说明，使用PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，中国大连）。将结果归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）或U6的表达。使用的特定引物见附加文件3：补充表S1在ABI 7500（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）上进行qPCR和数据收集。将qPCR结果与CT（阈值周期）值进行分析和表达，然后转换为折叠变化；2.0倍的变化被认为是显著的。18

质粒生成

这个HOTAIR公司序列被合成并亚克隆到pCDNA3.1（Invitrogen，中国上海）载体中。异位表达HOTAIR公司通过pCDNA-HOTAIR转染实现，使用空的pCDNA3.1载体作为对照。我们还合成了靶向shRNA序列HOTAIR公司Si-HOTAIR序列去除3′端的5个碱基后转化为sh-HOTAIR。在互补shRNA寡核苷酸退火后，我们将退火后的寡核苷酸克隆到pENTR载体中(sh-HOTAIR公司; 附加文件3：补充表S1). 的表达式级别热空气通过qPCR检测。

免疫组织化学

对石蜡包埋、福尔马林固定的人胃癌组织进行E-cadherin蛋白免疫染色。用3,30-二氨基联苯胺显色剂对信号进行放大和可视化，然后用苏木精进行复染。当10%或更多的癌细胞被染色时，表达被认为是阳性的。抗E粘附素（1:50）购自Cell Signaling Technology（CST，Danvers，MA，USA）。

细胞培养

BGC-823和MGC-803系在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（美国加利福尼亚州吉布科）中培养，并在37°C、5%CO下培养2和饱和湿度。SGC-7901细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco，CA，USA）中培养，并在37°C，5%CO下孵育2和饱和湿度。倒置显微镜下观察细胞生长。采集对数生长期的细胞用于实验。

细胞转染

使用DNA Midiprep或Midiprep试剂盒（德国希尔登Qiagen）制备用于转染的质粒载体（pCDNA3.1-HOTAIR和pCDNA3.1），并转染到BGC-823或SGC-7901细胞中。si-HOTAIR、sh-HOTIR、si-EZH2、si-SUZ12、，34a英里mimics或si-NC转染到BGC-823和SGC-7901细胞（附加文件3：补充表S1). BGC-823或SGC-7901细胞生长在六孔板上汇合，并根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染。在转染后48小时，收集细胞进行qPCR或western blot分析。

细胞迁移和侵袭检测

对于迁移分析，在转染后48小时，5×104将无血清培养基中的细胞放入插入物（8-μm孔径；Millipore，Bedford，MA，USA）。对于侵入分析，1×105将无血清培养基中的细胞置于涂有Matrigel（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）的插入物的上室。将含有10%FBS的培养基添加到下室。培养24小时后，用棉絮去除残留在上膜上的细胞。迁移或侵入细胞膜的细胞用甲醇和0.1%结晶紫染色，用IX71倒置显微镜在每个孔的五个随机区域进行成像和计数（日本东京奥林巴斯）。实验独立重复三次。

蛋白质印迹分析和抗体

细胞裂解物是使用RIPA蛋白提取试剂（Beyotime，中国北京）辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，Basel，Switzerland）和苯甲基磺酰基氟化物（罗氏）制备的。大约，50μg蛋白质提取物通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。GAPDH作为对照。抗E-cadherin和N-cadherin的抗体（1:1000）购自BD（美国新泽西州富兰克林湖）。抗波形蛋白和C-MET的抗体（1:1000）购自细胞信号技术（CST）。从Abcam（英国剑桥）购买了一种抗蜗牛抗体（1:1000）。

亚细胞分馏位置

根据制造商的说明，使用PARIS试剂盒（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）进行细胞核和胞质组分的分离。

染色质免疫沉淀

我们使用EZ-ChIP染色质免疫沉淀试剂盒对细胞系样品（Millipore）进行了ChIP。简单地说，我们将交联染色质DNA超声处理成200-500-bp的片段。然后使用抗甲基孕酮H3抗体和EZH2（1:5000）免疫沉淀染色质。阴性对照组为正常小鼠IgG。引物序列列于补充表1EZH2和H3K27的ChIP检测抗体来自Millipore。使用SYBR Green Mix（TaKaRa）的qPCR对免疫沉淀的DNA进行定量。使用等式2计算ChIP数据作为相对于输入DNA的百分比：输入Ct−目标Ct×0.1×100。

rna免疫沉淀

我们根据制造商的说明，使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（Millipore）进行RIP实验。用于EZH2 RIP检测的抗体来自Abcam。用反转录PCR检测共沉淀RNA。总RNA为输入对照。

尾静脉注射到裸鼠体内

我们从中国科学院动物中心（中国上海）购买了4周龄的无胸腺雄性小鼠，并将其置于特定无致病条件下的层流柜中。通过G418（400）筛选稳定转染的Sh-HOTAIR BGC-823细胞μg/ml）。将转染HOTAIR1#和pENTR载体（EV）的BGC-823细胞从六孔板中取出，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，在2×107每毫升细胞数。将再悬浮细胞（0.1毫升）注射到7只小鼠的尾静脉中，这些小鼠在注射7周后死亡。肺部被切除并拍照，肺表面可见肿瘤被计数。本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。南京医科大学动物实验伦理委员会批准了我们的方案（许可证号：200933）。所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，并尽一切努力减少痛苦。

荧光免疫组织化学

细胞按照标准方案固定在4%多聚甲醛中。兔抗蜗牛多克隆抗体（1:50；Abcam）作为一级抗体，与TRITC标记的抗兔IgG（1:500；Sigma-Aldrich）用作二级抗体。使用凝胶安装水性安装介质（G0918，Sigma-Aldrich）将切片安装到载玻片上，并使用奥林巴斯BX51显微镜（奥林巴斯光学）进行检查。用4%甲醛固定细胞，并用荧光显微镜检测计数细胞的荧光强度。使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量细胞的荧光强度。

生物信息学方法

GSEA软件从Broad Institute下载(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp). 下游基因剖析数据HOTAIR公司从基因表达综合（GEO）位点获得(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE47638型). 发现了大量丰富的基因集，产生了一个标称的P（P）-值0.05。UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway网站)用于分析启动子区域。

统计分析

使用SPSS 17.0统计分析软件（美国纽约州阿蒙克）对实验数据进行统计分析。根据Student’st吨-测试和χ2测试。的级别HOTAIR公司在胃癌患者中，使用Mann-WhitneyU型测试。的级别HOTAIR公司,CDH1型和34a英里对例胃癌患者进行Spearman相关分析。使用Kaplan–Meier方法分析无病生存概率，并使用log-rank检验进行评估。A类P（P）-值<0.05被认为是显著的。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（No.81472198）、江苏省重点临床医学技术基金（No.BL2014096）和江苏省发展健康项目医学骨干人才基金（No.RC2011080）对Z-xW的资助。

词汇表

LncRNA长非编码RNA
HOTAIR公司HOX反义基因间RNA
34a英里microRNA34a
项目需求控制2多梳抑制复合物2
电子病历上皮-间充质转化
PcG公司多梳群蛋白
BANCR银行BRAF-激活的非编码RNA
新冠核糖核酸非编码RNA
EZH2型zest同源物2的增强子
H3K27me3型组蛋白H3赖氨酸-27三甲基化
HGF公司肝细胞生长因子
qRT聚合酶链式反应实时定量聚合酶链式反应
DFS公司无病生存
高等教育苏木精和曙红
GSEA公司基因集富集分析
地理位置基因表达总览
马拉特-1转移相关肺腺癌转录本1
泽布1锌指电子盒绑定同源盒1
ZEB2型锌指电子盒绑定同源盒2
世界卫生组织世界卫生组织
UICC大学国际癌症控制联盟
GAPDH公司甘油醛-3-磷酸脱氢酶
国际控股公司免疫组织化学
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯
PMSF公司苯甲烷磺酰氟
TBS（待定）三缓冲盐水
炸薯条染色质免疫沉淀
安息rna免疫沉淀
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
DMEM公司Dulbecco改良的Eagle's培养基
计算机断层扫描循环阈值
英国标准协会牛血清白蛋白
发动机控制模块细胞外基质
小分子RNA小干扰RNA
小发夹RNA短发夹RNA
GC公司胃癌
IL6R（IL6R）白细胞介素6受体
STAT3（状态3）信号转导子和转录激活子3
扭转交易工作流创新标准团队
CDK公司细胞周期蛋白依赖激酶

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息附在细胞死亡与疾病网站上的这篇论文(网址：http://www.nature.com/cddis)

编辑：E Candi

补充材料

补充图S1

补充图S2

补充图S3

补充图形图例

补充表S1

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