血红蛋白作为肝星形细胞来源的肌成纤维细胞的标志物

摘要

介绍

Gabbiani最初将愈合伤口肉芽组织中的肌成纤维细胞描述为具有成纤维细胞和平滑肌细胞特征的细胞类型（Gabbiani等人。，1971).

在肝脏中，肌成纤维细胞首先在血吸虫肝纤维化中被发现（Grimaud和Borojevic，1977); 随后对慢性酒精性肝硬化患者的收缩成纤维细胞（肌成纤维细胞）进行了鉴定（Rudolph等人。，1979).

肝肌成纤维细胞以α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达为特征，α-SMA由ACTA2公司位于人类基因组10q22-q24中的基因（Schmitt-Gräff等人。，1991). 肝肌成纤维细胞的起源很复杂：至少有三种细胞来源-肝星状细胞（HSC）、门静脉成纤维细胞（PFs）和间皮细胞（MC）-被认为转分化为肝肌成细胞（Yin等人。，2013). 每种类型的肌成纤维细胞对肝纤维化的发展或解决的贡献因肝脏疾病的病因而异。

相反，细胞球蛋白（Cygb）属于哺乳动物球蛋白家族，由肌红蛋白、血红蛋白、神经球蛋白和雄激素组成（Burmester和Hankeln，2014). 在对大鼠HSC中表达的蛋白质进行蛋白质组学分析时，意外在HSC中发现了Cygb。Cygb的氨基酸序列和气体结合能力与肌红蛋白相似，因此表明这两种球蛋白在病理生理学中具有相同的主要功能（Kawada等人。，2001; Burmester等人。，2002; 特伦特和哈格罗夫，2002). 然而，最近的研究表明，Cygb参与了各种器官的致癌，这与肌红蛋白的功能不同，肌红蛋白是一种影响肌肉细胞收缩的气体结合传感器（Shivapurkar等人。，2008; Shaw等人。，2009; Latina等人。，2015).

在这篇综述中，我们将讨论Cygb在肝HSC中的独特表达，在HSC的肌成纤维细胞转化和肝脏癌变中的作用。

肝肌成纤维细胞

2002年，Cassiman等人提出在人类肝脏中存在至少四种不同的肌成纤维细胞亚群。门脉肌成纤维细胞和隔肌成纤维细胞分别位于门脉束周围的延伸胶原区和纤维化隔的内部区域。这些肌成纤维细胞对α-SMA呈强阳性，对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、脑源性神经生长因子（BDNF）和α-B-晶体蛋白（ABCRYS）呈可变阳性。第三类肌成纤维细胞是界面肌成纤维纤维细胞，位于纤维化间隔和周围肝实质之间的边缘，对α-SMA、GFAP和ABCRYS以及BDNF、神经细胞粘附分子（N-CAM）、神经生长因子（NGF）和神经营养素4（NT-4）呈阳性。第四类是活化的HSC，位于窦状毛细血管内或周围和假球内，强烈表达α-SMA和N-CAM，对GFAP、NGF、BDNF、NT-3和突触素以及NT-4、ABCRYS、p75和NT受体酪氨酸激酶A和B.Cassiman等人提出，门脉肌成纤维细胞、，除激活的HSC外，还可能来源于PF（Cassiman等人。，2002). 最近的细胞追踪技术更详细地阐明了肌成纤维细胞的起源，如下所述。

细胞球蛋白

Cygb属于哺乳动物球蛋白家族，包括肌肉细胞中的肌红蛋白、红细胞中的血红蛋白、神经系统中的神经球蛋白和睾丸中的雄激素。Cygb最初由我们小组命名为星状细胞激活相关蛋白，由Trent和Hagrove命名为组织球蛋白，于2001年通过蛋白质组学分析从培养的大鼠HSC中发现，即通过2D SDS-PAGE分离HSC中表达的蛋白质，然后通过飞行时间质谱鉴定单个蛋白质。Cygb的分子量为21496 Da，由190个氨基酸组成（Kawada等人。，2001; 特伦特和哈格罗夫，2002; Burmester和Hankeln，2014).

Cygb在HSC中唯一表达，但在肝细胞、内皮细胞或枯否细胞中不表达（图​（图1）。1). Cygb也表达于肝外器官，包括胰腺、脾脏、肾脏、消化道和心脏。Cygb阳性细胞通常位于毛细血管附近，被认为是周细胞，储存维生素A，产生胶原蛋白，并与血管内皮密切相关（Nakatani等人。，2004). 此外，Cygb在软骨细胞、成骨细胞和骨细胞中表达（Schmidt等人。，2004). 此外，最近的一份报告表明，Cygb在黑素细胞和几种类型的黑色素瘤中表达，并通过Cygb基因启动子区的超甲基化参与黑素细胞到黑色素瘤的过渡（Fujita等人。，2014).

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图1

完整人肝脏中的细胞球蛋白表达细胞球蛋白（箭头）沿肝窦定位，即这些细胞与肝星状细胞相同，但与肝细胞不同。在患者同意的情况下，在大阪城市大学医院获得了完整的人类肝组织（Motoyama等人。，2014). 获得患者的书面知情同意书。NK有助于评估人类肝脏组织病理学的诊断。

Cygb的三维结构几乎与肌红蛋白的三维结构相同，它具有由八个螺旋组成的三个以上三个α-螺旋三明治结构，而Cygb-是一种类似于神经球蛋白的双甾体六坐标球蛋白，与肌红素和血红蛋白不同，后者是五坐标球蛋白。然而，Cygb可以结合气体分子，包括氧、一氧化氮和一氧化碳，其动力学性质与肌红蛋白类似。因此，Cygb被认为是一种局部气体传感器（Makino等人。，2006,2011). 最近的一份报告表明，Cygb作为一种一氧化氮双加氧酶[Cygb（Fe²⁺)→O₂→ Cygb（铁²⁺−O（零）₂)→NO→Cygb（Fe³⁺) +<trans data-src="NO">不</trans><trans data-src="3">三</trans><trans data-src="−">−</trans>]导致一氧化氮的局部浓度的调节，从而导致血管紧张（Liu等人。，2012).

Cygb基因表达受缺氧诱导因子-1（HIF-1）调节，HIF-1与Cygb-基因启动子的缺氧反应元件结合。事实上，HeLa细胞暴露于1%O₂在培养中上调Cygb mRNA表达1.7倍（3小时）和1.6倍（6小时）。HIF-1和促红细胞生成素在Cygb基因的5′-UTR病变中分别有2个（-141和-448）和1个（-144）结合位点；这些位点对低氧条件下Cygb基因转录很重要（Guo等人。，2007). 参与Cygb基因表达的其他转录因子包括c-Ets-1、Sp1、活化T细胞核因子和激活蛋白（Guo等人。，2006). 就肝脏而言，在小鼠缺氧（24h和48h，7%O2）和复氧期间会诱导Cygb（Fordel等人。，2007). Man等人证明，服用CCl后Cygb mRNA表达上调3.5倍以上，Cygb-表达细胞数量增加₄在小鼠中（Man等人。，2008). Gninsky等人报道了在大鼠硫代乙酰胺中毒肝纤维化模型中Cygb的诱导作用，该作用明显受到了卤富隆（TGF-β依赖性Smad3磷酸化抑制剂）的抑制（Gnainsky等人。，2007). 在培养研究中，Cui等人证明了阿仑酸（一种星形胶质细胞S100b合成抑制剂）在原代培养的大鼠HSC中诱导Cygb（Cui等人。，2012). Stone等人最近澄清了培养的HTC-T6细胞中Cygb表达的调控；Cygb的表达由层粘连蛋白通过整合素α1β4信号上调，而由I型胶原通过整合蛋白α2β1信号磷酸化焦黏附激酶下调（Stone等人。，2015).

虽然Cygb作为fas-binding分子的功能已被证实，但其病理生理作用尚未完全阐明。Cygb在300μM H暴露下保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞凋亡₂O（运行）₂（Fordel等人。，2006). Li等人证明，siCygb治疗促进了暴露于500μM H的N2a神经元细胞死亡₂O（运行）₂持续4小时（Li等人。，2007). 这些和其他研究表明，Cygb可能是一种抵抗氧化应激的细胞保护剂。

近年来，Cygb在人类各器官癌变中的作用受到了特别关注。通过Cygb基因启动子损伤的高度甲基化，已证明在人类食管癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌中Cygb-基因表达下调（Shivapurkar等人。，2008; Shaw等人。，2009; Latina等人。，2015). 具体而言，Oleksiewicz等人显示（1）与正常人上皮细胞系相比，人肺癌细胞系中的Cygb蛋白显著下调，可能涉及启动子甲基化；（2）与正常肺组织相比，非小细胞肺癌组织中的Cygb mRNA表达显著降低（Mann-Whitney试验，P（P）= 2.3 × 10⁻⁷)，表明Cygb可能具有抑癌作用（Oleksiewicz等人。，2013). 基于这些报告，Hubers等人研究了自发性痰中Cygb基因甲基化，以便将其用于肺癌诊断。因此，他们报告Cygb对肺癌诊断的敏感性为22%（Hubers等人。，2014). 除肺癌外，Wojnarowicz等人证明，与良性肿瘤和正常卵巢表面上皮细胞样本相比，Cygb基因在大多数低恶性潜能肿瘤和癌症中的表达降低（Wojnarouwicz等。，2012). Chen等人还阐明了Cygb在人类组织水平和细胞培养模型中参与卵巢癌的发展（Chen等人。，2014). 在人类前列腺萎缩和腺癌中也有类似的观察结果，表明前列腺恶性肿瘤伴有低水平的Cygb，Cygb-在保护机体免受氧化损伤方面发挥作用（Mogal等人。，2012).

使用我们实验室中产生的Cygb基因敲除小鼠，我们研究了Cygb在肝癌发展中的作用。首先，用0.05 ppm二乙基亚硝胺（一种已确定的肝脏致癌物质）治疗小鼠36周，从而导致57.1%的基因敲除小鼠发生肝肿瘤，而野生型小鼠为0%。在这个模型中，背景肝组织显示出明显的肝纤维化发展，炎症反应增强和过氧亚硝酸盐（ONOO）过度生成⁻)敲除小鼠（Thuy le等人。，2011). 其次，给小鼠喂食胆碱缺乏的L-氨基酸定义的饮食32周，以诱发脂肪性肝炎。出乎意料的是，与0%的野生型小鼠相比，100%的Cygb基因敲除小鼠发生了多发性肝肿瘤。同样，背景肝组织显示出明显的肝纤维化发展和炎症反应增强，并伴有肝细胞中的DNA双链断裂（γH2AX表达）。这些结果显示了Cygb对慢性炎症下氧化应激和肝纤维化发展的保护作用，表明Cygb's在组织致癌中的作用（Thuy le et al。，2015). 根据这些观察结果，之前的两份报告证明了Cygb的抗纤维化功能。Xu等人报道了编码全长Cygb的重组腺相关病毒2在肝脏中的过表达抑制了CCl诱导的肝损伤和纤维化₄给药或结扎大鼠的胆管（Xu等人。，2006)此外，He等人还表明，注射重组Cygb（10 mg/Kg）可以减轻硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化中的肝纤维化（He等人。，2011)表明Cygb具有保肝作用。

作为肝星状细胞源性肌成纤维细胞标志物的细胞球蛋白

如上所述，Cygb最初是在原代培养的大鼠HSC中发现的（Kawada等人。，2001). Cygb在小鼠和人类HSC中表达（图​（图1）。1). 因此，Cygb能否作为一种特异性标记物来区分HSC来源的肌成纤维细胞和PFs来源的肌纤维细胞是一个有趣的问题。Schmidt等人首先详细描述了Cygb表达细胞体内他们证明，在小鼠肝脏中，Cygb在门静脉周围的HSC和成纤维细胞中表达，但在肝细胞中不表达（Schmidt等人。，2004). 然而，在本研究中，门静脉周围的成纤维细胞特征尚不充分。Tateaki等人使用fiblin 2作为PF标记物，证明了肝脏中存在几种类型的成纤维细胞，即fiblin 2中⁺/赛格布⁺，纤维蛋白2⁺/赛格布⁻，纤维蛋白2⁻/赛格布⁺，纤维蛋白2⁻/赛格布⁻他们得出结论：⁺/赛格布⁺和纤维蛋白2⁻/赛格布⁺分别与门脉肌成纤维细胞和活化的HSC相同。本研究的一个局限性是，单个细胞类型的鉴定仅通过免疫荧光染色进行（Tateaki等人。，2004). Ogawa等人采用Nycodenz密度梯度法分离小鼠肝脏非实质细胞组分，并基于维生素A自身荧光和FACS进一步分离组分中的细胞。紫外线⁺细胞生长潜力最小，在培养第1天时表达结蛋白和Cygb，但不表达αSMA和腓蛋白2，随后在培养第7天时结蛋白、Cygb和αSMA呈阳性。因此，紫外线⁺细胞（维生素A储存细胞）与HSC相同。相反，UV⁻细胞表现出高增殖活性，并表达αSMA、fiblin 2和Gremlin，但不表达结蛋白和Cygb，因此表明UV⁻细胞来源于门静脉成纤维细胞（Ogawa等人。，2007). Bosselut等人证明，分离的大鼠门静脉肌成纤维细胞不表达Cygb，因此与大鼠HSC不同，正如2-D MS/MS所确定的那样（Bosselut等人。，2010). Fausther等人最近的研究表明，在培养模型中，大鼠门静脉成纤维细胞和门静脉肌成纤维细胞系RGF和RGF-N2至少在mRNA水平上表达Cygb（Fausterr等人。，2015). 相反，Motoyama等人证明，在慢性丙型肝炎损伤的人类肝脏中，Cygb-和细胞视黄醇结合蛋白阳性细胞沿着肝实质中的肝窦和纤维化隔膜的边缘定位，并且它们与αSMA、纤维蛋白2和Thy-1阳性肌成纤维细胞不相同（Motoyama等人。，2014; 图​图2）。2). 总之，在小鼠、大鼠和人类肝脏中，Cygb在静止的HSC中表达，并且在同样表达αSMA的活化HSC中其表达水平增加。相反，PFs衍生的肌成纤维细胞对纤维蛋白2和αSMA呈阳性，而在人类中对Cygb呈阴性，而在啮齿类动物中，PF衍生的肌成纤维细胞中Cygb的表达需要通过例如使用遗传细胞标记技术来进一步表征。

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图2

人肝纤维化中细胞球蛋白的表达细胞球蛋白（箭头）沿肝窦定位，而α-SMA和Thy-1，肌成纤维细胞标记物，在纤维化间隔处呈强阳性。在患者同意的情况下，在大阪城市大学医院获得慢性丙型肝炎引起的肝纤维化患者肝组织（Motoyama等人。，2014). 获得患者的书面知情同意书。NK有助于评估人类肝脏组织病理学的诊断。

作者贡献

NK有助于评估人类肝脏组织病理学的诊断。

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