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《实验医学杂志》。2015年9月21日；212(10): 1725–1738.
数字对象标识：10.1084/jem.20140654
预防性维修识别码：项目经理4577833
PMID：26324446

NOS1衍生的一氧化氮通过抑制细胞因子信号转导抑制因子-1促进NF-κB转录活性

Mirza Saqib Baig公司,1,2,* 索菲亚·扎伊奇克,1,2,* 毛毛,1,2,* 安德烈·德·阿布鲁,1,2,7 Farnaz R.Bakhshi公司,2 彼得·哈特,1,6 乌兹玛·萨奇卜,2 景登,1 索拉布·查特吉,三 米歇尔·L·布洛克,4 斯蒂芬·沃格尔,2 阿斯拉·马利克,2 Marcia E.L.Consolaro公司,7 约翰·W·克里斯曼,1 理查德·明歇尔,2,5 本杰明·甘特纳,通讯作者2和马塞洛·博尼尼通讯作者1,2,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

NOS1号−/−在实验性脓毒症模型中，小鼠的炎症反应和组织损伤减轻。Baig等人表明，巨噬细胞中NOS1衍生NO的产生导致SOCS1的蛋白水解，以减轻其对NFkB转录活性的抑制，从而响应TLR4介导的反应。

摘要

NF-κB通路是炎症调节的核心。在这里，我们证明低输出一氧化氮合酶1（NOS1或nNOS）通过促进NF-κB的活性在炎症反应中发挥关键作用。具体而言，巨噬细胞中NOS1衍生NO的产生导致细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）的蛋白水解，减轻其对NF-κB转录活性的抑制。因此，NOS1号−/−当小鼠遭受两种不同的败血症模型时，细胞因子的产生、肺损伤和死亡率降低。隔离NOS1号−/−巨噬细胞在与革兰氏阴性细菌LPS的攻击中显示出类似的促炎性转录缺陷。一直以来，我们发现激活了NOS1号−/−与野生型细胞相比，巨噬细胞含有增加的SOCS1蛋白和降低的p65蛋白水平。SOCS1依赖NOS1的S-亚硝化损伤其与p65的结合，并以SOCS1为蛋白水解靶点。治疗NOS1号−/−含有外源性NO的细胞可以挽救SOCS1降解和p65蛋白的稳定。点突变分析表明，SOCS1上的Cys147和Cys179都是NO-依赖性降解所必需的。这些发现证明了NOS1衍生NO在调节TLR4介导的炎症基因转录以及由此产生的宿主免疫反应的强度和持续时间方面的基本作用。

炎症的严重程度、持续时间和位置的协调对于实现杀菌免疫同时最大限度地减少组织损伤至关重要。NF-κB途径对建立这种平衡至关重要。NF-κB促进参与免疫反应各个方面的基因转录，从免疫细胞的分化和稳态调节，到急性激活期间屏障功能和白细胞募集的调节，以及介导抗菌活性的免疫效应器机制的部署(Xia等人，1997年;Badrichani等人，1999年;Jeon等人，1999年;Alcamo等人，2001年;Tiruppathi等人，2008年;雅各布森和比鲁科夫，2009年;劳伦斯，2009;巴尔的摩，2011年;Li等人，2011年;Pittet等人，2011年;Ruland，2011年;Sadik等人，2011年;菲伦，2012;Koelink等人，2012年;Summers deLuca和Gommerman，2012年;Sun和Karin，2012年;Takizawa等人，2012年). NF-κB信号传导中断导致病原体清除、自身免疫和组织损伤缺陷(鲍伊和奥尼尔，2000年;Javaid等人，2003年;阿克坦，2004年;Dixon，2004年;Block和Hong，2005年;Parsons等人，2005年;Dombrovskiy等人，2007年;Panettieri等人，2008年;雅各布森和比鲁科夫，2009年;刘，2011;Nacher和Hidalgo，2011年;Rossi等人，2011年;Ruland，2011年;Edgley等人，2012年;Ma和Malynn，2012年).

NF-κB信号传导是复杂的，导致多种不同的转录复合物的形成和稳定性被广泛的蛋白质修饰所调节，包括磷酸化、泛素化和谷胱甘肽化，以及活性氧和氮物种的修饰(鲍伊和奥尼尔，2000年;马歇尔和斯坦勒，2001年;Ben Neriah，2003年;Bubici等人，2006年;Mattioli等人，2006年;Nicholas等人，2007年;Geng等人，2009年;Lin等人，2012年;Sabatel等人，2012年). 一氧化氮（NO）长期以来被认为可以促进NF-κB的反馈抑制，因为高输出一氧化氮合酶2（NOS）在炎症中起着重要作用。然而，哺乳动物编码三种不同的NOS同工酶：神经元（nNOS或NOS1）、诱导型（iNOS或NO S2）和内皮型（eNOS或一氧化氮合酶3；Knowles和Moncada，1994年). 为了确定其中每一种在炎症信号传导中的确切作用，我们分析了两种败血症模型中三种NOS亚型中每一种都有靶向突变的动物。我们证明，在三种NOS酶中，低输出NOS1产生的NO在促进动物和分离巨噬细胞中NF-κB介导的促炎细胞因子转录方面发挥着关键作用。

典型的NF-κB复合体由IκB在细胞质中保持不活跃的p65和p50亚单位组成。IκB的靶向蛋白水解导致p65:p50复合物的核移位，并随后转录激活。IκB的降解受到大量促炎信号通路的促进，其保存是许多抗炎途径的靶点。(雅各布斯和哈里森，1998年;Vanden Berghe等人，1999年;Basak等人，2007年;巴尔的摩，2011年;Ruland，2011年). 因此，我们确定了其在NOS1号−/−巨噬细胞被LPS攻击，但未发现IκB降解缺陷。相反，我们发现p65蛋白水平在敲除细胞中没有保持。据报道，细胞因子信号抑制剂（SOCS1）可促进DNA-结合p65蛋白的降解，从而抑制NF-κB活性和炎症(Kinjyo等人，2002年;Nakagawa等人，2002年;Ben-Neriah，2003年;Park等人，2003年;Ryo等人，2003年;Baetz等人，2004年;Gingras等人，2004年;Strebovsky等人，2011年;Linossi和Nicholson，2012年). 我们表明，NOS1衍生的NO促进SOCS1的S-亚硝化，并且这会破坏其结合和靶向p65降解的能力。因此，我们证明NOS1中的NO通过抑制SOCS1而允许巨噬细胞中NF-κB的完全转录激活。

结果

NOS1号−/−动物免受模型脓毒症损伤和死亡，而NOS2号−/−和NOS3号−/−动物表现出更大的敏感性

我们分析了NOS1号−/−,NOS2号−/−、和NOS3号−/−败血症实验模型动物：腹腔注射LPS。与早期研究类似，我们观察到NOS2号−/−和NOS3号−/−动物(Hickey等人，1997年;Wang等人，2004年;Miki等人，2005年;图1A). 相反，NOS1号−/−与对照动物相比，小鼠的存活率增加(图1 A). 我们测试了NOS1的代偿性表达变化是否有助于解释NOS2号−/−或NOS3号−/−表型，但我们检测到WT中NOS1表达的可比水平，NOS2号−/−、和NOS3号−/−（未发布的数据）。我们还测试了对多菌败血症模型盲肠结扎和穿孔（CLP）的反应。再一次，NOS1号−/−与野生动物相比，动物受到了保护(图1 B). 急性肺损伤是与急性全身炎症相关的发病率和死亡率的主要原因(Matthay和Zemans，2011年). 尽管WT和NOS3号−/−通过毛细血管过滤分析（Kfc（财务总监）),NOS1号−/−两种分析都保护了肺部(图1、C和D). 为了确定这些影响是否由NOS1的丢失而非基因缺失的任何代偿作用引起，我们还用NOS1/NOS2抑制剂1-（2-三氟甲基苯基）咪唑、TRIM治疗了WT小鼠(Handy等人，1995年). 与许多先前的研究一致，我们发现NOS2直到炎症激活后数小时才显著表达，并预计TRIM此时的作用机制应仅通过NOS1（另见图5、F和G). 与此一致，TRIM治疗总结了NOS1基因消融对死亡率和损伤组织学相关性的影响(图1、E和F). 虽然NOS2和NOS3在脓毒症损伤中起保护作用，但我们证明NOS1独特地促进了与模型脓毒症相关的损伤。

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NOS1缺乏可防止模型脓毒症损伤。（A） WT的存续(n个= 42),NOS1号−/−(n个= 31),NOS2号−/−(n个=40），以及NOS3号−/−(n个=32）注射LPS的小鼠（30 mg/kg，i.p.），根据至少3个独立实验汇编，每组10只小鼠，或（B）WT(n个=8）和NOS1号−/−(n个=8）小鼠，从2个独立实验中汇编，进行CLP，并在指定的时间内监测存活率。（C） WT的肺部，NOS3号−/−、和NOS1号−/−在腹腔注射LPS攻击后8 h收获小鼠，并用h&E对切片进行染色。显示了三个独立实验中分析的每种表型的三只小鼠的代表性图像。棒材，100µM。（D） 肺血管通透性测量（Kfc（财务总监）)WT的，NOS3号−/−、和NOS1号−/−小鼠LPS攻击前和攻击后8小时。在三个独立实验中分析了每种表型的三只小鼠。*，P<0.05，学生t吨测试。（E） 单用LPS治疗的WT小鼠的存活率(n个=32）或在LPS前用TRIM（25 mg/kg，i.p.）预处理2 h(n个=30），根据每组10只小鼠（F）进行的至少3次独立实验汇编而成。对WT小鼠进行肺组织学分析，如C组，对照组或TRIM预处理组，如E组。使用Fisher精确试验确定A–C组的显著性。*，P<0.02（B）；**，P<0.001（E）；***，P<0.0005（A）。

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NOS1定位于巨噬细胞的细胞核，是LPS处理后快速产生NO所必需的。（A） NOS1固定和免疫染色后，在BMDM中显示了NOS1的核定位（红色），用DAPI对细胞核进行了复染，并显示了2个独立实验的代表性图像（bar，25µM）。（B） 对BMDM细胞质和细胞核部分进行免疫印迹，以证明NOS1的亚细胞定位。GAPDH和HDAC1作为亚细胞分馏的对照。（C） NOS1丝氨酸1412磷酸化与酶激活相关，通过LPS（100 ng/ml）刺激BMDM在指定时间点的免疫印迹检测。数据是三个独立实验的代表。（D） 亚硝酸盐积累作为NO生成的间接测量，在WT和NOS1号−/−在LPS之前或之后使用Sievers 280i一氧化氮分析仪进行BMDM（100 ng/ml，1 h）。*，P<0.05。（E） 过氧亚硝酸盐生成是NO生成的另一种间接测量方法，通过培养WT或NOS1号−/−BMDM加香豆素-7-硼酸（10µM）30分钟，加或不加LPS（100 ng/ml）。使用HPLC进行荧光测量。*，P<0.0003。（F） LPS诱导的定量RT-PCR分析NOS2号来自WT和NOS2蛋白的mRNA和（G）免疫印迹分析NOS1号−/−经LPS（250 ng/ml）治疗的BMDM在两种基因型BMDM LPS后的早期时间点均未检测到诱导型NOS（NOS2）。P<0.01（学生的t吨测试）。数据代表六个（D和E）和三个（F）独立实验；均表示为平均值±SD。B、C和G中的数据代表三个独立实验。

体内外TLR4介导的细胞因子产生和NF-κB活化需要NOS1

细胞因子的从头转录和翻译在脓毒症期间促进炎症组织损伤中起着关键作用。根据对感染性损伤的保护，我们观察到NOS1号−/−与WT相比，腹腔注射LPS后8 h，小鼠的血浆细胞因子反应显著降低，而NOS2号−/−和NOS3号−/−小鼠产生正常细胞因子反应(图2 A). 巨噬细胞是体内炎症的关键细胞介质(MacMicking等人，1997年). 我们分析了这些细胞中NOS1的功能，发现它们重现了NOS1缺乏的体内表型。骨髓源性巨噬细胞（BMDM）由NOS1号−/−小鼠表现出一系列细胞因子（TNF、IL1β、IL6和MIP2；图2，B–D). TRIM预处理对WT-BMDM中NOS1的急性抑制也降低了LPS治疗的细胞因子转录反应(图2 C). 促炎细胞因子转录的这些广泛缺陷促使我们研究TLR4下游的信号和转录途径。NF-κB活化对多种炎症细胞因子的表达至关重要，因此我们在NOS1号−/−细胞。该途径中的早期信号事件集中于IκB的降解，从而将转录因子复合物释放到细胞核。NOS1号−/−BMDM对LPS处理的反应与WT细胞类似，通过降解IκB，这表明TLR4触发的最早信号事件是完整的。尽管如此，我们发现IκB在降解后的再表达显著减少(图3，A和B). 因为IκB是其主要靶点之一，我们分析了IκB降解下游的NF-κB转录激活。尽管在LPS处理的WT BMDM中检测到核p65 DNA结合活性增加，但我们没有发现NOS1号−/−BMDM公司(图3 C). 与此一致的是，用NF-κB驱动的荧光素酶报告子（内皮细胞-白细胞粘附分子[ELAM]细胞；甘特纳等人，2003年)经TRIM预处理后，经LPS处理6 h，荧光素酶报告活性显著降低(图3 D). 表达另一个NF-κB驱动的荧光素酶报告子作为转基因的小鼠（HLL小鼠）表明，TRIM治疗也可以显著抑制体内的系统NFκB活化,LPS治疗后24小时(Sadikot等人，2001年;图3、E和F). 我们的研究结果表明，NOS1通过驱动NF-κB DNA结合和转录激活，在促进广泛的促炎细胞因子表达方面发挥了新的重要作用。

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LPS引起的炎症细胞因子反应在NOS1号−/−动物和培养的巨噬细胞。（A） WT血浆中IL-1α、IL-1β和IL-6，NOS1号−/−,NOS2号−/−、和NOS3号−/−小鼠注射LPS（30 mg/kg，i.p.）前和8 h后。使用Luminex面板评估血浆中的细胞因子水平，并以相对光单位（RLU）表示。对每种治疗条件和基因型的9只小鼠进行分析，并从三个独立实验中汇编数据，平均值±SEM.*，P<0.005（Student’st吨测试）。（B） 细胞因子mRNA表达的定量RT-PCR分析TNF公司,白介素-6、和IL-1β与WT隔离的BMDM和NOS1号-/−小鼠，并用LPS（250 ng/ml）刺激。*，P<0.0005。（C） mRNA表达分析TNF公司,白介素-6、和IL-1β在LPS（250 ng/ml）刺激前用TRIM（100 nM）处理2 h的WT巨噬细胞（无抑制剂）和WT巨噬细胞。*，P<0.003（学生的t吨测试）。（D） LPS激活的BMDM（250 ng/ml）培养基中TNF和IL-1β细胞因子水平的ELISA测量。*，P<0.02；**，P<0.001（学生t吨测试）。代表性数据来自三个（B–D）独立实验，用平均值±SD表示。

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NOS1是NF-κB转录激活所必需的，但不是上游信号传导所必需的。（A） WT和LPS处理（250 ng/ml）后IκB降解的代表性免疫印迹NOS1号−/−BMDM。（B） IκB水平的密度分析，如（A）所示，归一化为肌动蛋白，表示为三个独立实验定量的平均值±SEM。*，P<0.02（学生的t吨测试）。（C） 从WT和NOS1号−/−LPS前后BMDM（250 ng/ml）1小时*，P<0.001，学生t吨测试。（D） 稳定表达NF-κB驱动荧光素酶报告子（ELAM）的RAW264.7巨噬细胞系用TRIM（50µM）预处理2 h，然后用LPS（100 ng/ml）刺激6 ht吨测试。C和D代表三个独立实验，表示为三个重复的平均值±SD。在用PBS（对照）、LPS或LPS治疗24小时后，用TRIM（50 mg/kg，i.p.）预处理2小时以抑制NOS1后，表达转基因荧光素酶报告子（HLL）的小鼠的（E）的代表性数字图像和（F）NF-κB转录活性的定量。静脉注射30 mg/kg荧光素后10分钟，通过IVIS评估发光。定量集中于胸部活动(n个=每组6只动物，由两个单独的实验汇编而成，每个实验使用3只小鼠），包括LPS或PBS治疗前的基础报告活性进行比较。*，P<0.05（学生的t吨测试）。平均值显示为水平条，红色表示处理过的值，蓝色表示控制值。

NOS1需要阻断LPS激活的巨噬细胞中p65的蛋白水解降解

意外地，NOS1号−/−BMDM在LPS刺激后p65蛋白水平迅速下降，尽管在未刺激细胞中p65表达相似。这与WT或NOS3号−/−p65蛋白水平保持稳定的细胞(图4，A和B). p65的典型结合伙伴NF-κB p50在NOS1号−/−或WT BMDM(图4C且未描述）。p65是典型NF-κB转录的核心，因此其蛋白水平的降低可能是NOS1缺失时细胞因子转录缺陷的原因(Alcamo等人，2001年;瓦拉巴普拉普和卡林，2009年;巴尔的摩，2011年;图2). 为了确定p65的损失是由合成还是降解引起的，我们对NOS1号−/−使用蛋白酶体抑制剂MG132的巨噬细胞能够在LPS治疗后挽救p65蛋白水平(图4，A和B). 与此一致，我们比较了NOS1号−/−和WT BMDM，在用催乳素阻断从头合成蛋白质后(格罗曼，1968年)并发现敲除细胞在LPS处理后仍丢失p65蛋白(图4、E和F). 这些结果支持NOS1阻断巨噬细胞中p65的蛋白酶体降解，而不是影响p65合成的假设。我们从骨髓基质干细胞中制备细胞溶质和核组分，并分析p65蛋白丰度。尽管在细胞质p65中检测到的差异很小，但细胞核p65蛋白从NOS1号−/−BMDM(图4 D). 这使我们确定了NOS1在巨噬细胞中的亚细胞定位。通过免疫荧光成像和骨髓基质干细胞的核分级，我们发现NOS1主要位于细胞核中，与细胞的LPS激活状态无关(图5，A和B). 这一发现与其他报告一致，即NOS1可以在细胞核中发挥作用，并进一步支持了这种酶在调节基因表达中起重要作用的假设(袁等，2004;Saluja等人，2010年;维拉努埃瓦和朱利维，2010年). 然后，我们对NOS1进行了功能表征，以确保其在BMDM中具有酶活性。与之前的观察一致，NOS1在激活时在Ser1412上磷酸化(Huang等人，2012年)，我们发现LPS处理在几分钟内诱导BMDM中该位点的NOS1磷酸化(图5 C). 这与NO的两个间接测量值相关。我们检测到BMDM中亚硝酸盐（60分钟）和过氧亚硝酸盐的产生非常早的脉冲（30分钟）。然而，NOS1号−/−BMDM未能在此时间范围内生产NO的任何一种产品(图5、D和E). 同样，TRIM预处理阻止了WT细胞中任一产品的产生(图5 E且未描述）。与其他细胞类型中报告的NOS1活性一致，钙离子载体处理促进了WT中亚硝酸盐的产生，但在WT中没有NOS1号−/−BMDM（未发布的数据）。为了排除NOS2参与早期NO活性的可能性，我们检测了NOS2号LPS处理后各时间点的mRNA和蛋白。直到LPS治疗后4小时，在我们检测到早期LPS介导的NOS活性后，我们才发现WT或敲除细胞中没有检测到表达(图5，F和G). 我们的数据表明，LPS刺激激活了促进p65降解的机制，并且在NOS家族酶中，NOS1能够阻断这种机制，从而维持p65蛋白水平。

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NOS1号−/−BMDM暴露于LPS后无法维持p65蛋白水平。用LPS（250 ng/ml）刺激的BMDM中NF-κB p65蛋白水平的代表性免疫印迹（A）和密度定量（B），归一化为肌动蛋白，用于指定的时间和基因型。如有指示，用MG132（50µM，蛋白酶体抑制剂）预处理细胞。*，P<0.01。（C） 免疫印迹分析中NF-κB p50总水平NOS1号−/−LPS后的巨噬细胞（250 ng/ml）。（D） WT和WT的分离细胞质和核组分NOS1号−/−在LPS（250 ng/ml）作用60 min前后用免疫印迹法检测BMDM的p65，GAPDH和HDAC1分别作为细胞质或核蛋白的负荷对照。在用吐麦素（100µg/ml）或对照药物治疗BMDM，然后用LPS（250 ng/ml）治疗指定时间，抑制从头合成蛋白质后，通过（E）免疫印迹和（F）密度定量（标准化为GAPDH）评估p65蛋白降解动力学。IκBα再表达的缺失表明了对蛋白质翻译的有效抑制。对于上述所有实验，3个独立实验显示了代表性的印迹，基于所有实验的定量显示为平均值±SEM。P值通过Anova双向检验和Bonferroni事后检验确定，以比较重复次数：*，P<0.02；**，P<0.001；和***，P<0.0001。

NOS1衍生NO介导SOCS1的S-亚硝化，阻止其靶向p65进行降解

据报道，一种直接降解p65蛋白的机制涉及抗炎分子SOCS1。据报道，SOCS1可介导DNA-结合p65的泛素化，导致其蛋白酶体溶解(Ben-Neriah，2003年;Ryo等人，2003年;Strebovsky等人，2011年). 为了确定SOCS1是否参与NOS1依赖的信号传导，我们分析了其在巨噬细胞中的蛋白表达。重量，NOS2号−/−、和NOS3号−/−BMDM显示在检测的时间段内SOCS1蛋白丰度下降。相反，NOS1号−/−仅细胞表现出SOCS1蛋白的积累，这与LPS刺激后p65蛋白水平的下降一致(图6 A). 为了确定SOCS1是否是NO的直接靶点，我们分析了蛋白质S-亚硝化。通过对MG132处理的细胞进行生物素转换分析（以保留否则会被蛋白酶体降解的蛋白质），我们发现在WT BMDM中，SOCS1表现出低的基础S-亚硝化作用，在LPS处理1小时后显著增加。与此形成鲜明对比的是，NOS1号−/−细胞显示出较低的基础亚硝化作用，LPS处理后细胞没有明显的增加(图6 B).NOS2号−/−和NOS3号−/−BMDM表现出低基础和强健的LPS诱导的S-亚硝化作用，证明在我们研究的时间过程中，这些酶不需要修饰SOCS1(图6 C). 除了对蛋白质稳定性的影响外，我们还发现NOS1调节SOCS1与p65的物理相互作用能力。MG132处理的BMDM中SOCS1的免疫沉淀物与p65的结合更强NOS1号−/−与WT电池相比(图6 D). 最后，我们使用快速释放的NO供体二乙胺-硝酸盐（DEANO）测试了外源性NO拯救敲除巨噬细胞中缺陷的能力。DEANO和LPS同时处理逆转了p65的降解NOS1号−/−细胞，同时也促进SOCS1的降解(图6 E). 这些观察结果表明，NOS1的NO快速脉冲促进SOCS1降解，从而稳定p65蛋白和持续NF-κB依赖性转录。据我们所知，这是首次证明SOCS1的翻译后修饰可以调节其抑制NF-κB核活性的能力。

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NOS1衍生NO介导SOCS1的S-亚硝化并阻止SOCS1介导的蛋白酶体降解p65（A）WT中p65和SOCS1的免疫印迹分析，NOS1号−/−,NOS2号−/−、和NOS3号−/−BMDM用LPS（250 ng/ml）处理指定时间。（B） 使用生物素开关法检测WT和NOS1号−/−BMDM用MG132（50µM）预处理1 h，然后用LPS（250 ng/ml）处理指定时间，然后进行SOCS1免疫印迹。（C）NOS2号−/−和NOS3号−/−生物素开关法分析BMDM，如B.（D）在WT和NOS1号−/−BMDM，在LPS（250 ng/ml）之前用MG132（50µM，1 h）预处理指定的时间间隔。（E） p65和SOCS1总蛋白水平的免疫印迹分析NOS1号−/−用DEANO（NO供体，5µM）和LPS（250 ng/ml）处理BMDM。所示的所有斑点代表至少两个（C和D）或三个（A、B和E）独立实验。

Cys147和Cys179对SOCS1亚硝化和蛋白酶体降解至关重要

接下来，我们试图确定被NOS1衍生NO修饰的SOCS1上的准确残基。我们使用了两种预测分子建模技术，然后对候选残基的单个点突变进行功能分析。SOCS1含有5个半胱氨酸残基，我们通过电子对接模型评估了其S-亚硝化的可能性(图7 A). 我们分析了SOCS1的蛋白质序列和结构，并使用最小能量计算模拟了S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）中每个半胱氨酸硫原子对氮原子的可及性预测(图7 B且未描述）。我们选择GSNO是因为它可能是反应性NO的生理载体(Sun等人，2011年;Green等人，2012年). 该方法预测对亚硝化最敏感的残基是Cys147和Cys179，它们分别位于SH2结构域（SOCS盒附近）和SOCS盒结构域本身（p65结合结构域）内(图7，A和B). 对这些结构域的修饰可以解释我们的观察结果，即NOS1降低了SOCS1和p65之间的结合，即使没有蛋白酶体降解。为了在电子预测中进行实证验证，我们在HEK293细胞中瞬时表达了SOCS1的WT或单个半胱氨酸到丝氨酸点突变结构。使用DEANO（含或不含MG132）将转染细胞暴露于外源性NO，以评估每个蛋白对NO-定向蛋白酶体降解的敏感性。与我们的电子预测一致，我们确定尽管WT SOCS1蛋白在接触NO后降解，但C147S和C179S突变体仅受到最小影响(图7、C和D). 相反，三种被预测不是S-亚硝化靶点的半胱氨酸（C43S、C78S和C112S）的突变表现出与WT SOCS1类似的降解(图7 C). 为了证实这种效应与S-亚硝化直接相关，我们进行了生物素转换试验。虽然WT SOCS1在NO供体的存在下被强烈修饰，但C147S和C179S突变体中的S-亚硝化作用受到抑制(图7 E). 这些发现表明，SOCS1中最靠近SOCS盒的两个半胱氨酸残基对调节SOCS1的稳定性及其抑制p65介导的炎症转录的能力至关重要。我们的结果表明，Cys147和Cys179的修饰对于SOCS1的完全S-亚硝化和随后的降解是必需的。

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分子模型和功能测试表明，SOCS1的Cys147和Cys179是S-亚硝化的靶点。（A） SOCS1的蛋白质结构域说明了所有5个候选半胱氨酸残基的位置。（B） 进行分子建模以预测SOCS1半胱氨酸残基（表示为有色棒状原子模型）对可能的亚硝化供体GSNO的可及性（表示为球状和棒状原子模式）。预计半胱氨酸硫原子和GSNO的氮之间的较短距离允许Cys147（4？，中间）和Cys179（6？，右）进行S-亚硝化，而Cys43（13？，左）、Cys112（11？，未描绘）和Cys 78（11？（未描绘）预计相距太远，无法进行反应。（C） 将带有GFP标记的SOCS1结构的代表性免疫印迹或每个半胱氨酸的点突变（C147S、C179S、C112S、C78S和C43S）转染到HEK293细胞中，然后用20 ng/ml IL-1β的15分钟脉冲处理这些细胞。一些细胞用50µM蛋白酶体抑制剂预处理1小时（MG132+），一些细胞在IL-1β（NO供体+）后用10µM DEANO处理1小时。通过免疫印迹法测定SOCS1蛋白水平的稳定性，并根据三个独立实验（平均值±SEM）定量β-肌动蛋白（D）。（E） 在使用生物素切换方法瞬时转染的HEK293细胞中，将SOCS1突变体C147S和C179S的S-亚硝化能力与WT SOCS1进行比较。测定GFP-OCS1变体的免疫沉淀物的生物素（S-亚硝化），并对裂解物进行总SOCS1的免疫印迹作为对照。数据是两个独立实验的代表。

讨论

由于与炎症反应相关的高输出、可诱导NOS2亚型的有效诱导，NO的免疫调节功能早已被认识。已知NOS2中的NO可介导前炎症信号通路的反馈抑制，包括NF-κB(Peng等人，1995年;Matthews等人，1996年;Togashi等人，1997年;delaTorre等人，1999年;马歇尔和斯坦勒，2001年;Marshall等人，2004年;Reynaert等人，2004年;Kelleher等人，2007年). 尽管一些研究表明NOS1中较低浓度的NO可促进炎症(Porras等人，2006年;Kanwar等人，2009年;Lange等人，2010年;Duma等人，2011年)NOS1的作用机制尚不清楚。在本研究中，我们证明NOS1中的NO对NF-κB活性至关重要，特别是通过S-亚硝化介导的SOCS1降解，SOCS1阻止p65的靶向蛋白水解，允许持续的促炎基因转录。

我们证实了NOS1在两种脓毒症模型中的重要生理作用，一种是通过腹腔注射LPS诱导的无菌炎症模型，另一种是由CLP导致的多微生物脓毒症。这两种治疗都显著降低了NOS1号−/−动物(图1). 这是NOS1的独特之处，因为与其他研究结果一致，我们证明NOS2号−/−和NOS3号−/−小鼠死亡率增加(Hickey等人，1997年;Wang等人，2004年;Miki等人，2005年;Duma等人，2011年). 炎症细胞因子对感染性损伤至关重要NOS1号−/−小鼠和NOS1号−/−BMDM均表现出对LPS治疗的细胞因子反应减弱(图2). 事实上，用TRIM对NOS1的药理抑制复制了这些NOS1号−/−表型。虽然TRIM能够抑制NOS2和NOS1的活性，但在我们可以检测和抑制NOS1依赖性、NO-衍生产品的时间点，我们没有检测到NOS2的任何表达(图5). 总之，这些研究结果表明，NOS酶活性（NOS1特异性）是脓毒症引起的炎症损伤所必需的。

受影响的细胞因子的多样性暗示了TLR4下游炎症信号通路的缺陷。我们惊讶地发现，尽管IκB降解在NOS1号−/−巨噬细胞NF-κB依赖性转录显著降低(图3). 我们的发现是，TLR4、ERK1/2和JNK MAPK激活激活的其他近端信号通路在NOS1号−/−细胞使我们更详细地研究了NF-κB通路（未发表的数据）。我们惊讶地发现，活化后的p65蛋白水平显著降低NOS1号−/−巨噬细胞，与WT或NOS3号−/−维持p65蛋白的细胞(图4，A和B). 我们观察到用MG132抑制蛋白酶体可以挽救p65蛋白水平NOS1号−/−而用吐麦素抑制蛋白质合成并没有消除WT和敲除p65反应之间的差异。此外，我们观察到标准p65结合伙伴NF-κB p50的蛋白水平没有变化(图4C). 总之，这些发现表明NOS1衍生NO调节p65的特异性蛋白酶体靶向。与p65–p50复合物相比，p50同型二聚体可以介导不同的抗炎转录反应(Driessler等人，2004年). 因此，我们的研究表明，除了调节炎症反应的强度外，NOS1-衍生NO还可能影响TLR4刺激的炎症反应质量。

SOCS1是一种负调控JAK/STAT信号的信号分子，据报道可介导DNA-结合p65的泛素化，导致其蛋白酶体溶解(Ben-Neriah，2003年;Ryo等人，2003年;Strebovsky等人，2011年). 这一机制与我们对p65的观察结果一致，事实上，我们确实发现LPS处理的SOCS1蛋白水平较高NOS1号−/−单元格(图6 A). 与此一致，我们使用生物素开关方法发现，在LPS处理的60分钟内，SOCS1在WT巨噬细胞中被S-亚硝化。不同于NOS2号−/−或NOS3号−/−细胞，这些时间点的S-亚硝化在NOS1号−/−单元格(图6、B和C). 我们对SOCS1的预测建模和功能突变分析确定半胱氨酸147和半胱氨酸179是S-亚硝化和SOCS1降解所必需的(图7). 我们还观察到，在没有蛋白酶体降解的情况下，NOS1号−/−与WT相比，巨噬细胞SOCS1和p65的结合降低(图6 D). 因此，SOCS1抑制可能是暂时的和可逆的，或者在SOCS1蛋白降解后更持久。尽管需要对Cys147或Cy179残基进行亚硝基修饰来指导SOCS1蛋白水解，但单个突变体与p65的结合能力降低，这一发现支持了这一观点(图7、C和E; 且未描述）。

与其他已证明NO可通过NOS2活性直接亚硝化降低NF-κB活性的报告不同(Kelleher等人，2007年)我们观察到，在TLR4激活后60分钟内，NOS1产生NO，导致p65转录因子稳定。这与先前报道的体外观察一致，即NOS1调节p65的DNA结合能力(Peng等人，1995年;Matthews等人，1996年). 我们已经确定SOCS1的直接亚硝化是这种作用的分子机制。这扩大了SOCS1介导的p65调节的重要性，并表明通过NOS1的药理靶向性调节SOCS1和p65平衡的能力可以提供重要的治疗干预，以塑造广泛的临床相关疾病中的炎症反应。总之，我们发现SOCS1对NF-κB p65的抗炎蛋白水解作用是LPS刺激巨噬细胞期间的一种积极机制，而NOS1唯一衍生的NO需要抑制SOCS1并驱动持续的炎症转录。

材料和方法

动物和细胞培养。

根据伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理机构和美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）的政策进行动物处理和实验。所有动物均来自杰克逊实验室。NOS1号淘汰小鼠，NOS2号击倒小鼠，以及NOS3号敲除小鼠取自JAX。对照组为WT C57BL/6动物。Transnetyx Inc.进行了菌株特异性基因分型。在所有实验中，我们使用8-12周龄雄性动物。BMDM由C57/BL6制备，NOS1号−/−,NOS2号−/−，或NOS3号−/−小鼠（Jackson实验室）通过在来自Invitrogen或RPMI（Gibco）的Dulbecco最小必需培养基（DMEM）中培养BM单细胞悬浮液5–7天，通过添加10%热灭活FBS（亚特兰大生物制品或Gibco公司）、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（来自Mediatech公司的CellGro）或1%（vol/vol）完成培养来自Life Technologies的抗生素-抗真菌混合物，含10-20%的L929细胞调节（ATCC）全DMEM培养基。通过用1 mM EDTA在1×PBS中从18号针（BD）中喷洒细胞，清洗并提升巨噬细胞，然后在1–3天后进行实验。稳定转染ELAM荧光素酶报告子的RAW264.7细胞(休谟等人，2001年)在上述完整的RPMI（生命技术）中培养。通过赖氨酸细胞（Promega）、添加荧光素酶检测试剂（Promeca）和使用Wallac Victor2（PerkinElmer）进行检测来评估荧光素酶的表达。

体内研究。

使用两种方法在小鼠中诱导了脓毒症。i.p.LPS动物腹腔注射30 mg/kg LPS(大肠杆菌，0111:B4；Sigma-Aldrich），表明C57/BL6动物的死亡率>80%。如前所述，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下进行CLP(Rittirsch等人，2009年). 盲肠远端20%（回盲瓣下方，距末端约1cm）用6-0缝合线结扎。盲肠用20号针头穿刺4次。在生存研究中，观察96小时的致死终点，然后处死所有剩余的动物。为了进行组织病理学观察，在治疗后8小时处死动物并切除肺部。将肺部固定在10%中性缓冲福尔马林中，脱水，包埋在石蜡中，切片，然后用苏木精和伊红染色（位于伊利诺伊州芝加哥市伊利诺伊大学研究组织学和组织成像中心[RHTIC]）。微血管Kfc（财务总监）如前所述，测量肺微血管对液体的通透性(Vogel等人，2000年). 简言之，在标准的30分钟平衡灌注后，流出压力迅速升高13厘米H2O持续20分钟，然后恢复正常。肺湿重的变化反映了净液体外渗。在每个实验结束时，将肺从非肺组织中分离出来，并测定肺干重。K（K）fc（财务总监）（ml/min/cmH2O/干重[g]）是根据记录的重量变化与压力变化和肺干重的标准化斜率计算得出的。在一些实验中，在LPS给药前2 h给药NOS1/NOS2双重抑制剂1-（2-三氟甲基苯基）咪唑（TRIM；25 mg/kg，i.p.）。

为了进行细胞因子产生分析，对每种表型的6只小鼠的血样进行凝块和离心2000克持续20分钟，并将血清储存在−80°C下直到测定。根据制造商的说明（EMD Millipore），通过ELISA Luminex xMAP检测检测IL-1α、IL-1β和IL-6的浓度。

HLL转基因小鼠（C57B6/DBA背景）在近端5′HIV-LTR启动子控制下表达磷脂酶cDNA。实验中只使用了8-12周龄的雄性。使用IVIS电荷耦合相机（PerkinElmer）进行生物发光活体内成像。在指定的治疗24小时后，用异氟醚麻醉小鼠，从胸部和腹部去除毛发，静脉注射100µl荧光素（300 mg/ml）（Caliper Life Sciences），10–15分钟后进行成像。定量分析仅通过选择胸部区域的信号进行，数据以每秒光子数表示。

亚硝酸盐和过氧亚硝酸盐测量。

亚硝酸盐是NO的一种稳定代谢物，通过化学发光法测定培养上清液中的亚硝酸盐。BMDM用HBSS清洗两次，并在37°C下在含有1 mM L-精氨酸（Sigma-Aldrich）的无血清HBSS（生命技术）中培养，然后用LPS处理(大肠杆菌处理后，收集培养基，冷冻，离心去除漂浮细胞。通过测量NO间接评估培养基中的NO浓度2−使用280i一氧化氮分析仪（Sievers仪器）进行累积，并以nmol NO/mg蛋白质报告。使用香豆素-7-硼酸盐（CBA；Sigma-Aldrich）测量过亚硝酸根生成量。用100µM TRIM（Sigma-Aldrich）处理1 h或对照的6孔板中电镀的BMDM用DPBS清洗两次，并在含有20µM CBA的无血清HBSS缓冲液中培养。然后用LPS（250 ng/ml）刺激细胞。在阴性对照组中也添加过氧化氢酶（10 U/ml；Sigma-Aldrich）。60分钟后，收集培养基并在3000 rpm下离心5分钟。在Beckman-Coulter HPLC系统上对氧化产物7-OH-香豆素（COH）进行荧光分析。样品（20µl）在Synergi-Fusion（250×4.6 mm；Phenomenex）上分离，使用35%vol/vol乙腈以1 ml/min的流速进行等比例洗脱。使用350 nm（激发）和450 nm（发射）测量荧光。将真实的COH溶液注入HPLC，以验证保留时间并生成标准曲线。

共焦分析。

对于SOCS1和p65染色，BMDM被镀在盖玻片上（直径19mm），并在12孔板中刺激。在室温下用2%多聚甲醛固定细胞15分钟，并在−20°C下向预冷细胞缓慢添加冰镇100%甲醇使其渗透10分钟。所有后续步骤均在室温下进行。用5%BSA在1×PBS中封闭细胞1h，然后用一级抗体（来自Cell Signaling Technology的小鼠抗SOCS1和兔抗p65抗体；1/200在封闭缓冲液中）染色1h，用PBS（×5）洗涤后，用Alexa Fluor 568结合的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488结合的驴抗鼠IgG（PBS中的1/500）对细胞染色1h。根据制造商的方案，使用DAPI进行核反染。使用VECTASHIELD安装介质（Vector Laboratories）将盖玻片安装在玻璃载玻片上，并在LSM 510 META共焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss）上进行分析，该显微镜配备有：25 mW二极管紫外激光（DAPI，蓝色）、1 mW HeNe激光（Alexa Fluor 546，红色）、30 mW可调谐Ar激光（Allxa Fluxo 488，绿色）、，和63×/1.2 Water DIC C-Apochro物镜（UIC成像核心设备）。所有图像均采用相同的曝光设置，并使用LSM软件（卡尔蔡司）进行处理。

mRNA分离、cDNA合成和实时PCR。

根据制造商的规范，使用TRIzol试剂从BMDM中分离出总RNA（Invitrogen）。根据制造商的规范，使用TaqMan RT-PCR试剂盒（生命技术）合成cDNA。qPCR使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）在7500 Real-Time PCR系统上进行。使用以下引物组（每个5pmol）扩增cDNA片段：TNF公司正向引物5′-TTCGGCTACCACAGTTCAT-3′和反向引物5’-CGCACAGTAGTCCTTTC-3′；白介素-1β正向引物5′-CACATGGCACATTCGTTCAAA-3′和反向引物5’-GCCATCAGGCAAGGA-3′；IL6（IL6）正向引物5′-CACGGCCTTCCCTACTTC-3′和反向引物5’-TTGGGAGTGGTTATCTCTGA-3′；GAPDH公司正向引物5′-GCCAGTCAGCGAGAGAAT-3′和反向引物5’-GCCTTCTCCATGGTGAA-3′。将循环阈值（Ct）值转换为线性比例（1/2计算机断层扫描)，并将所得数据归一化为每个样本的GAPDH值。数据以每个数据集最大mRNA响应的百分比表示。使用Microsoft Excel进行分析。要分析的级别NOS2号BMDM中的mRNA，总mRNA从1.2-1.4×106根据制造商的协议，BMDM带有RNA STAT-60（Tel-Test，Inc.）。使用高容量cDNA RT试剂盒（Applied Biosystems）将4.6µg总mRNA转换为cDNA，并使用Fast SYBR Green Master mix（AppliedBiosystes）、AB7500 cycler和以下引物通过qPCR进一步分析0.46µg生成的cDNA：NOS2号正向5′-CAGCTGGGCTGTACAACCTT-3′；NOS2号背面5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′(de Souza等人，2013年;Shi等人，2003年);GAPDH公司正向5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3′；GAPDH公司反向5′-TCCACGACATACTCACCAC-3′。如上所述分析Ct值。所有值均归一化为GAPDH公司对于同一个样本，校正单元数的差异。与未经处理的对照组相比，结果显示为折叠变化。

核/细胞质分馏、细胞因子和p65 DNA结合测量。

使用nuclear/Cytosol Extraction kit（BioVision，）、nuclear Extraction kit（Cayman Chemical Company）或NE-PER nuclear Protein Extraction试剂盒（Thermo Fisher Scientific）从细胞质组分中分离细胞核提取物。使用抗GAPDH抗体（细胞信号技术）对细胞质组分进行免疫印迹分析，使用抗HDAC1抗体（圣克鲁斯生物技术公司）对细胞核组分进行蛋白质印迹分析。根据制造商的方案，使用NF-κB（p65）转录因子检测试剂盒（开曼化学公司）测量NF-κ子B p65活性（核DNA结合）。～每个条件下分析1µg核蛋白。使用Spectra Max M5获得结果e（电子）（分子器件）平板阅读器（450 nm时的吸光度）。使用相同的BMDM池并行测量细胞因子水平以确认表型，并使用Thermo Fisher Scientific公司提供的ELISA试剂盒分析TNF和IL-1β细胞因子。使用Spectra Max M5进行测量e（电子）（分子器件）450和550 nm处的平板阅读器。

免疫印迹、免疫共沉淀和生物素转换分析。

为了进行免疫印迹分析，细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的RIPA缓冲液（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）中溶解，在NuPAGE 4–12%凝胶上溶解（Novex；Life Technologies），并用以下抗磷酸化氮NOS-Ser1412，p50，IκBα，GAPDH抗体进行印迹和探测（Santa Cruz Bintechnologies，Inc.），SOCS1（Abcam）、HDAC1、NOS1、GAPDH、β-actin和抗p65（细胞信号技术）。在二次HRP染色（细胞信号技术或Jackson ImmunoResearch Laboratories）后，使用SuperSignal（Thermo Fisher Scientific）或鲁米诺-羧酸-H检测化学发光2O（运行）2化学发光溶液和胶片（Denville Scientific Inc.）对图像进行数字扫描（HP Officejet J4550扫描仪），并使用ImageJ（美国国立卫生研究院；Schneider等人，2012年). 对于联合免疫沉淀，细胞在带有蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液（20 mM Tris-HCL，pH 8.0，137 mM NaCl，10%甘油，1%NP-40，2 mM EDTA）中进行裂解。使用BCA分析标准化蛋白质浓度（Bio-Rad实验室）。将100µg蛋白裂解物与小鼠抗SOCS1抗体（Invitrogen）和蛋白A/g琼脂糖珠（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）在4°C下旋转培养过夜。用裂解缓冲液洗涤珠子4倍，并用免疫印迹法分析蛋白质。根据制造商的说明，使用S-亚硝基化蛋白质检测试剂盒（Cayman Chemicals）进行生物素转换测定。用MG132（50µM）预处理分化的BMDM 1 h，用LPS（250 ng/ml）刺激30 min。用链霉亲和素Dynabeads（M-280链霉亲和素；Invitrogen）沉淀等量细胞中分离的S-亚硝化蛋白，并用NuPAGE 4–12%凝胶溶解（Novex；Life Technologies）用过氧化物偶联抗SOCS1抗体（1:100；细胞信号技术）或兔抗SOCSI抗体（1:1000；Abcam）免疫印迹，然后用HRP偶联二级抗体（抗兔；Jackson ImmunoResearch Laboratories）免疫印记。

GFP标记的SOCS1和半胱氨酸突变体在HEK293细胞中的表达。

HEK293细胞维持在完整的DMEM中。用pCMV6-AC-GFP载体（OriGene）瞬时转染细胞，该载体表达SOCS1（小鼠；可从GenBank获得，登录号：。NM_009896.2号)由组成型CMV启动子驱动，根据制造商的协议使用Lipofectamine 2000试剂。在SOCS1 ORF（GenScript USA Inc.）中引入了半胱氨酸突变（C147S、C179S、C43S、C78S和C112S）。用20 ng/ml IL-1β（Prospec Inc.）的15 min脉冲刺激HEK293细胞，并用10µM DEA NONOate（DEANO）处理1 h（Alexis生化制剂）。二乙胺NO（DEANO）是NONOate类NO供体的成员。在37°C，pH 7.4时，它会自发生成NO，半衰期为2.1分钟(Schödel等人，2009年). 在存在和不存在50µM MG132（Sigma-Aldrich）的情况下，还测定了总SOCS1和相应的p65蛋白水平，以抑制蛋白酶体溶解。

分子建模和计算对接。

SOCS1区域（残基65–212）的三维结构可从蛋白质模型端口获得，而N末端（残基1–64）的模型则使用I-Tasser建模服务器构建。使用SAVES服务器进行Ramachandran图分析，以测试模型质量。底物S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO；CID_104858）的三维构象最初是从Pubchem化合物搜索中检索到的。Accelrys发现工作室程序（discovery studio Modeling Environment；4.0版；AccelrysSoftware Inc.）用于使用CHARMM力场参数最小化结构的能量。根据最近公布的研究报告，对NO-Cys进行人工收费(韩，2008). 然后将GSNO导出到Mcule对接以进行对接计算。Mcule利用基于AutoDock Vina程序的对接计算。根据标准AutoDock程序准备蛋白质和底物文件。简而言之，包括将由mcule ID、SMILES或InChI字符串定义的输入配体转换为2D MOL，生成定义的立体异构体，将配体2D MOL-3D MOL转换为3D MOL，将配体3D MOL-PDBQT转换，准备对接靶点，最后对接。在最佳的四种对接姿势中，得分最高的一种进行了进一步分析。Castp服务器用于蛋白质袋检测。根据Kyte-Doolittle量表计算口袋的疏水性指数(基特和杜立德，1982年)使用序列操作套件服务器的Protein GRAVY模块。

统计分析。

使用Microsoft Excel或Prism（GraphPad）进行统计分析。使用双尾Student’s评估显著性t吨测试、Anova双向测试和Bonferroni后测试或Fisher精确测试。所有数据均代表至少两个独立实验，除非另有说明，否则误差指的是标准偏差。

致谢

作者感谢Mary Maliakal女士对NOS1调节p65磷酸化的初步工作。

这项研究由美国心脏协会、科学家发展基金（编号：09SDG2250933和13GRNT16400010）赞助；国防部授予M.G.Bonini W911NF-12-1-0493/61758-LS。

作者声明没有竞争性的经济利益。

脚注

使用的缩写：

BMDM公司
骨髓源性巨噬细胞
CLP公司
盲肠结扎和穿孔
ELAM公司
内皮细胞-白细胞粘附分子
GAPDH公司
3-磷酸甘油醛脱氢酶
GSNO公司
S-亚硝基谷胱甘肽
HDAC公司
组蛋白脱乙酰酶
不
一氧化氮
网络操作系统
一氧化氮合酶
SOCS系统
细胞因子信号转导抑制因子
装饰
1-（2-三氟甲基苯基）咪唑

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社