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干细胞研究。2015; 6(1): 127.
2015年7月1日在线发布。 数字对象标识：10.1186/s13287-015-0116-z
预防性维修识别码：项目经理4529699
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人类骨髓和脂肪间充质干细胞分泌富含独特miRNA和tRNA物种的外泌体

塞雷娜·鲁宾娜·巴格里奥,通讯作者 库斯·罗伊杰斯, Danijela Koppers-Lalic公司, 弗雷德里克·维尔韦杰, 佩雷斯·兰佐, 尼科莱塔·齐尼, 本诺·奈杰肯斯, 弗朗西丝卡·佩鲁特, 汉斯·尼森, 尼古拉·巴尔迪尼,和D.米歇尔·佩格特尔通讯作者
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

介绍

骨髓间充质干细胞（MSCs）的应用为免疫学和退行性疾病患者提供了一种有希望的治疗选择。越来越多的证据表明，MSCs的愈合效果主要与独特的旁分泌特性有关，这为分泌体治疗开辟了机会。除了可溶性因子外，MSC通过细胞外小泡（EV）释放功能性小RNA，这些小泡似乎传达了MSC的基本特征。在这里，我们开始描述MSC产生的外泌体的完整小RNA组。

方法

我们建立了一个分离早期传代脂肪（ASC）和骨髓基质干细胞（BMSC）释放的外泌体的方案，并通过电子显微镜、蛋白质分析和小RNA测序对其进行了表征。我们开发了一个生物信息学管道来定义外显子封闭RNA物种，并对BMSCs和ASCs及其生物复制品中相应的外显子进行了首次完整的小RNA表征。

结果

我们的分析表明，初级ASC和BMSCs具有高度相似的小RNA表达谱，主要由miRNAs和snoRNAs控制（合计64-71%），其中150-200个miRNAss存在于生理水平。相反，MSC外泌体中的miRNA库仅占总小RNA组的2-5%，并且由miRNA的一小部分组成。然而，外泌体中的miRNA不仅反映细胞含量，而且与来源细胞相比，一组特定的miRNA在外泌体中过度表达。此外，多个高表达的miRNA被排除在外体分选之外，这与这些miRNA参与RNA靶点的功能抑制的概念一致。虽然ASC和BMSC外泌体在RNA类分布和组成上相似，但我们观察到进化保守tRNA物种的分类存在显著差异，这似乎与MSCs的分化状态有关，如Sox2、POU5F1A/B和Nanog表达所定义的。

结论

我们证明，初级MSCs通过外显体释放小RNA，外显体越来越多地参与细胞间通讯。tRNA物种，尤其是tRNA半体，优先被释放，它们对外泌体的特异性分类与MSC组织起源和干细胞有关。这些发现可能有助于了解MSC如何影响邻近或远处细胞，并可能对其治疗用途产生影响。

电子辅助材料

本文的在线版本（doi:10.1186/s13287-015-0116-z）包含对授权用户可用的补充材料。

介绍

间充质干细胞（MSCs）在体内表现出独特的生物学特性，可用于治疗多种病理状况，尤其是骨缺损、退行性疾病和自身免疫，因此受到广泛研究[1].

MSCs是具有自我更新潜能的成人多能干细胞[2]可以分化为间充质生殖层的替代表型，即成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞[三]. MSCs最常见的来源是骨髓[4,5]; 然而，间充质干细胞存在于许多其他组织中，尤其是脂肪组织，这是高度相关的，因为它是一种容易获得的丰富干细胞来源[6]. 来自不同来源的MSC是否可以被视为相同的细胞类型以及不同的环境是否会影响其表型和功能仍在争论中[7,8].

最近的研究表明，MSCs的有益作用来自分泌因子，而不是其组织插入和分化。MSC分泌体通过诱导损伤部位从促炎性细胞因子产生转向抗炎性细胞因子生成，从而促进器官愈合[9–11]. 这些观察结果支持了无细胞、分泌体疗法的发展，这些疗法可以规避与干细胞疗法相关的风险，如免疫介导的排斥反应、基因组改变的积累和衰老诱导的遗传不稳定性[12–14]与临床使用的细胞相比，可能需要更简单的安全规定[11].

MSC分泌体背后的兴趣超越了其在组织修复中的应用。事实上，MSC对不同癌症类型的肿瘤生长和进展有重要影响[15–17]尽管也有报道称其抗肿瘤活性突出了其多效性[18,19]. MSC的一个独特之处在于，它们对炎症信号有强烈反应，导致其归巢到活性肿瘤部位，在那里它们提供旁分泌生存、促血管生成和免疫调节信号，类似于促进伤口愈合的信号。先前的研究侧重于描述MSC产生的可溶性因子（即细胞因子、趋化因子和生长因子）的特征。然而，现在很清楚，除了可溶性因子外，细胞外囊泡（EV）也是细胞间通信的关键工具[20]. 在EV的许多亚型中，内切体衍生的外泌体已成为MSC分泌体的生理相关和强大的成分[11,12,21].

外泌体是一种纳米大小的EV，具有显著的生理特性，起源于晚期内泌体的限制膜向内萌芽，称为多泡体（MVB）。MVB与质膜融合后，外泌体被释放到细胞外环境中，既可以被微环境中的靶细胞吸收，也可以通过生物流体携带到远处。除了运输蛋白质和脂质特征外，外泌体还包装核酸，尤其是具有调节功能的各种RNA物种[22]. 可以说，研究最多的一类外泌体编码RNA是一类microRNAs（miRNAs），它在体外抑制受体细胞中的靶mRNAs[23–26]和体内[27]. 然而，我们最近在B细胞中发现，miRNAs仅占外体RNA的一小部分。事实上，其他非编码转录物，包括重复序列和结构RNA，完成了B细胞以及其他细胞类型中产生的外体RNA序列[28,29].

MSC衍生囊泡具有典型的功能性MSC的显著特性。Kordelas等人[11]证明MSC外泌体治疗难治性移植物抗宿主病的临床疗效。此外，MSC-EV调节神经突起生长[30]促进体内外血管生成[31]，减少心肌缺血/再灌注损伤[21]，修复急性肾损伤[32,33]. 因此，可以合理地假设MSC-EV运输关键的MSC相关分子，这些分子以特定的方式改变靶细胞的生理学。蛋白质组学分析表明MSC EVs或其亚类含有MSC特有的关键表面标记物和信号分子[34]. 此外，先前的定量PCR分析[35]结果表明，尽管一些miRNAs存在于MSCs及其相应的微泡中，但其他的miRNAss是选择性表达的。

为了更好地理解和开发成人MSC衍生外泌体的临床潜力，定义其所包含的相关功能分子非常重要。目前还没有关于MSC外显体完整RNA含量的全面信息，来自不同来源的成年MSC是否共享类似的小RNA库，或者它们的含量是否不同，仍不清楚。

在这里，我们首次对来自两种不同来源的成年MSCs释放的外显子小RNA图谱进行了全面的深度序列分析：脂肪源性MSCs（ASCs）和骨髓源性MSC（BMSCs）。我们对外体内容物的分析有助于了解MSC如何影响其在居住地生态位中的微环境以及在归巢到受损和炎症组织时的微环境，这可能会对其治疗用途产生影响。

材料和方法

细胞培养

在获得荷兰阿姆斯特丹医学伦理委员会（METC）的批准和书面知情同意后，从Tergooi医院整形外科获得选择性整形手术的人类脂肪组织样本。如前所述，脂肪组织在24小时内进行处理[36]. 简单地说，使用手术刀将脂肪组织切碎，并在37°C下连续摇晃45分钟，用0.1%胶原酶a（德国罗氏曼海姆公司）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中消化1%牛血清白蛋白（BSA；罗氏诊断公司）。Ficoll密度分离后（淋巴管；挪威奥斯陆Axis-Shield），细胞以100000个细胞/cm的密度接种2接受髋关节置换术的患者的骨髓是在意大利博洛尼亚整形外科学会批准并获得书面知情同意后，从里佐利整形外科学会获得的。用Ficoll Hystopaque梯度（Sigma-Aldrich，Milan，Italy）分离单核细胞，并以250000个细胞/cm的密度接种24天后，去除非粘附细胞并向培养物中添加新鲜培养基。ASC和BMSCs在含有100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素（荷兰布列斯维克Gibco）和10%胎牛血清（FBS）或5%血小板裂解物（PL）的α-微量必需培养基（α-MEM；荷兰布雷达Lonza）中扩增[37]和10 U/ml肝素（利奥制药，荷兰阿姆斯特丹），在5%CO的湿化空气中237°C时。通过荧光激活细胞分选（FACS）分析典型MSC表面标记物的表达，并通过抗坏血酸、地塞米松和β-甘油磷酸钠诱导后茜素红染色评估MSC进行成骨分化的能力[38].

外显子分离

MSC外泌体从约3.2×107早期传代细胞（第2-3代）。MSC培养达到70%融合后，将细胞在含有外显体缺失的FBS或PL的α-MEM中培养24–48小时。在70000×克温度为4°C。如前所述分离外显子[39]. 简单地说，MSC条件培养基在500×克10分钟，2000×2次克以10000×克持续30分钟。然后将上清液转移到超清管中，并在70000×克在SW32Ti转子中，在4°C下保持1小时（荷兰沃尔登贝克曼·库尔特公司）。用PBS清洗含外泌体的颗粒，并在70000×克持续1小时。然后将颗粒小心地重新悬浮在200μl PBS中，并立即使用或储存在−80°C下。

共焦激光扫描显微镜

对于共焦激光扫描显微镜分析，MSC接种在聚乳酸-我-赖氨酸涂层（Sigma-Aldrich）盖玻片，用4%多聚甲醛固定，用0.1%Triton-X100渗透，用PBS 10%FBS封闭（30分钟）。将载玻片与抗CD63的一级抗体（BD Biosciences，Breda，荷兰）或EEA1（Cell Signaling，Leiden，荷兰）孵育，然后与兔抗鼠荧光素异硫氰酸盐（FITC）抗体（DAKO，Heverlee，比利时）在室温下孵育30分钟。LysoTracker red（分子探针，Bleiswijk，荷兰）在固定前与活细胞孵育。所有染色用莱卡DMRB显微镜进行成像（莱卡，Son，荷兰）。通过将针孔设置为1AE（标准）的顺序扫描获得图像。使用488nm（FITC）和561nm（Alexa594）激光线激发荧光团。

蛋白质印迹

对于western blot分析，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液（Roche）对细胞进行裂解，并通过BCA分析测定蛋白质浓度（Pierce，Etten-Leur，荷兰）。将稀释在样品缓冲液中的细胞裂解物和胞外体制剂置于10%SDS凝胶上，并在硝化纤维素膜上进行印迹（GE Healthcare，Eindhoven，荷兰）。膜与抗CD63、CD81或细胞色素C单克隆抗体（BD Biosciences）和辣根过氧化物酶偶联兔抗鼠二级抗体（DAKO）孵育。CD63和CD81检测凝胶在非还原条件下运行。

透射电子显微镜

细胞颗粒用2.5%戊二醛（德国达姆施塔特默克KGaA公司）在磷酸盐缓冲液中固定2小时，用1%四氧化锇后固定，在分级系列乙醇中脱水，并嵌入Epon中（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司）。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。将外显子制剂与等量的4%多聚甲醛（Sigma）混合在磷酸盐缓冲液中。然后将5μl溶液沉积在200目Formvar-carbon-coated electronic microscopy（EM）镍网格上，并在室温下放置20分钟进行吸附。样品用1%戊二醛（Merck）固定在磷酸盐缓冲液中，与草酸铀酰（pH 7.0）进行对比，并以1:9的比例嵌入4%乙酸铀酰和2%甲基纤维素（25 cps；Sigma）的混合物中。然后用不锈钢环去除格栅，用滤纸吸干多余的液体，以确保甲基纤维素膜的厚度合适。干燥后，用蔡司EM109透射电子显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）检查格栅。使用尼康数码相机Dmx 1200F（尼康公司，日本东京）和ACT-1软件（尼康集团）拍摄图像。

RNA分离、RT-PCR和小RNA测序文库的生成

如前所述，使用Trizol试剂（荷兰布雷达Invitrogen）分离总RNA[39]. 用RNase A（Sigma-Aldrich）在37°C下以400 ng/μl的最终浓度预处理外显子制剂1小时，以降解未受保护的RNA。使用安捷伦2100生物分析仪系统（荷兰阿姆斯特尔芬安捷伦）评估RNA的数量和纯度。在LightCycler 480实时PCR系统（Roche）中，使用SYBR-Green PCR主混合（罗氏）进行分化和茎相关基因的表达分析。根据ΔΔCt方法，对3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的结果进行标准化[40]. 按照制造商的说明，使用TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit（荷兰埃因霍温Illumina）制备用于测序的cDNA文库。扩增的cDNA构建物在6%的PAGE凝胶上纯化，对应于15-90核苷酸转录物的DNA分子被切除，从凝胶中洗脱，并通过乙醇沉淀浓缩。使用高灵敏度DNA芯片（Agilent）在生物分析仪上验证文库，并在测序运行中进行等摩尔混合。在HiSeq 2000（Illumina）配对100次循环结束（PE100）运行时进行测序。

为阅读指定功能

使用cutadapt（v1.1）从原始数据的3′端修剪适配器序列[41]和参数“-O 12-e 0..25”。使用bowtie（v2.0.6）将修剪后的读数与人类基因组（构建hg19）对齐[42]，并使用参数“--seed 42--gbar 100-D 10-R 2-L 20-N 0-i C，1-k 50--scoremin L，0，-0.4”报告每次读取的多个有效对齐（最多50个）。对于每次读取，在随后的分析中仅使用得分最高的比对。

使用了几个基因组注释来源。性别规范v.15[43]但总长度大于120的转录本以及“sense_intronic”、“sense_重叠”和“miRNA”型基因被排除在外。对于miRNAs，来自miRBase的注释（v.19）[44]用于初级和成熟转录本注释。tRNA注释来自GENCODE/tRNA，并由GtRNAdb的元数据补充[45]. piRNA数据库中的piRNA注释[46]在将重叠注释折叠成簇时使用。RepeatMasker的重复注释和元数据来自加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器（2013年3月27日）[47].

使用每次读取的（可能多个）比对和之前描述的注释，确定了一组（可能部分）重叠的基因。如果这组基因都属于某个“特征型”（即RNA型），则特征型被指定为该读。在特征类型不明确的情况下，采取了以下步骤。如果读取长度大于25个核苷酸，则特征类型“miRNA，processed”被删除；否则，特征型“miRNA，早产儿”被消除。如果读取长度大于32个核苷酸，则特征型“piRNA”被消除。如果此时可以明确确定featuretype，则分配此featuretype。否则，如果有两种可能的特征类型，其中一种是重复的，则将非重复特征类型分配给读取。如果不是这样，并且读数有两个或多个可能的对齐，则只显示一个对齐的所有特征类型都将被删除。同样，如果此时可以明确确定featuretype，则分配此featuretype。在其他情况下，如果未明确确定特征类型，则将读取指定为“模糊”（附加文件中的图S11).

为了进一步分析，对比对进行了处理，并创建了列举特征类型、唯一序列和计数的表格。这个过程可以分析按特征类型划分的序列长度，并分析每个样本的RNA类型部分。为了分析特定miRNA的差异表达，进一步细化miRNA的特征类型以解析miRNA名称。类似地，为了详细分析tRNA和重复序列，这两类的特征类型被进一步细化，分别包括tRNA反密码子和重复序列家族。

样本相关性

仅对在细胞样本上总读取次数至少为15次的基因或在外显子样本上总阅读次数至少为5次的基因进行相关分析。使用M值中的三值归一化对计数进行归一化。通过取最低非零标准化值除以2，并取该值的对数，计算对数值，并对每个样本的零以上对数进行插补（即，通过检测下限的估计来插补零计数）。计算样本之间的皮尔逊相关系数。在热图中，基因通过其标准欧氏距离进行聚类，样本通过其相关系数进行聚类。

tRNA/mRNA 3′UTR互补性分析

tRNA片段序列的非冗余列表由每个样本中最丰富的20个tRNA片段组成。使用GENCODE v15转录本注释（仅适用于具有完整CDS注释的转录本）准备mRNA 3′UTR的BLAST数据库。使用BLAST（blastn v.2.2.25）搜索tRNA片段序列以确定与3′UTR的互补性，参数仅允许未标记的互补点击（“-u T-S 2”）、种子长度6、，以及调整后的有效搜索空间大小，设置为数据库中使用的3′UTR跨越的总基因组长度（以调整来自相同基因组序列的重叠3′UTRs）。允许的最大值e（电子）值为1.0。对于每次点击，使用phyloP 100路数据（从UCSC轨迹获取，日期：2015年3月20日）检查与tRNA匹配的基因组区域的保守性。此外，还计算了匹配区域相对于最短重叠3′UTR的守恒性。

统计分析

所有统计分析均在R软件中进行(http://www.r-project.org/). 使用edgeR包中的exactTest例程确定差异表达[48]和常见的库分散。使用提供的M值三均值算法对计数进行归一化，但在高级特征类型（例如“miRNA”、“piRNA”和“repeat”）的分析中除外，在这种情况下，使用总库大小进行归一。

研究是按照赫尔辛基宣言进行的，所有实验方案都得到了VU大学医学中心和Rizzoli骨科研究所伦理委员会的批准。

结果

来自脂肪组织和骨髓的间充质干细胞释放富含小RNA的外体样EV

为了研究间充质干细胞释放的EVs，我们从人骨髓中分离出原代成人MSC（BMSCs，n个＝4）和脂肪组织（ASCs，n个=3）（附加文件中的图S21). 早期传代MSCs（第0–2代）在外显体缺失的FBS或PL中扩增以支持在体外膨胀[36].

通过免疫荧光和EM分析MSC内体室。免疫荧光染色显示CD63的高点状表达，主要定位于细胞核周区的非酸性小泡中，如溶血酶原追踪（图1a个，左上角）。早期内体抗原A1（EEA1）染色显示，大量早期内体分布在整个细胞体中（图1a个，左下角）。然而，尽管有内胚体标记物的表达，干细胞的超微结构显示，具有内部囊泡结构的晚期内胚体数量相对较少，提示存在MVB样隔室和/或分泌溶酶体。这些小室的直径约为500 nm，并包含40–100 nm的腔内小泡（图1a个，右）。EM检测到的MVB样细胞器的低丰度表明，在MSCs的核周间隙观察到的大量CD63与与MVB无关的细胞膜有关。

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ASC和BMSC含有相对较少的MVB，并释放富含小RNA的外泌体样小泡。一CD63的免疫荧光染色(左上角)和EEA1(左下角)和MVB样内体的超微结构(正确的)ASC和BMSC。b条ASC和BMSCs外泌体的透射电镜照片(左边); 以及细胞和相应外泌体中CD63、CD81和细胞色素C的western blot(正确的).c（c）生物分析仪细胞和外显体的小RNA图谱显示外显体中20–70核苷酸小RNA富集。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，欧洲经济区1早期内体抗原A1，外显（exo）外体

如前所述，通过差速离心分离EV[39]通过对CD63和CD81的EM和western blotting证实其纯度。评估细胞色素C以排除凋亡小体的污染（图1亿). 尽管差速离心是从培养上清液中分离外泌体最常用的方法[49]，在使用该程序时，不可能排除外显子体制剂中存在其他类型的EV。然而，由于我们通过超速离心获得的制剂在大小、形状和四spanin含量方面似乎富含外泌体，我们将这些MSC-EV视为“外泌物”。为了排除PL或FBS衍生EV对MSC-exosome制剂的潜在污染，我们分析了经差速离心的外泌体缺失培养基中的CD63和CD81。由于没有检测到CD63，我们得出结论，我们的制剂主要含有MSC衍生的外泌体（附加文件中的图S3A1).

为了确定MSC外显体的小RNA组成，我们通过添加外源RNase A降解外显体制剂中任何未受保护的RNA。随后，我们分离出细胞和外显体RNA，并对其进行生物分析仪分析。外显体的小RNA图谱显示出20到70个核苷酸之间的特征峰，提示存在miRNAs和tRNAs。细胞中的尺寸分布更具异质性，包括更长的转录物（图1c个). 我们构建了MSC细胞和外泌体RNA分子的cDNA文库，长度在大约15到90个核苷酸之间（附加文件中的图S3B1).

我们观察到早期传代原代MSCs含有相对较少的MVB，这表明与其他细胞类型相比，这些细胞分泌相对较少的外泌体[23,50,51]. 然而，MSC释放的外泌体包含一个小RNA群体，受外源RNase保护。

间充质干细胞及其外泌体具有不同的RNA组成

对这些库进行排序后，总共产生了2500万次读取。细胞样本显示读取长度分布广泛，主要峰值约为22个核苷酸（图2年)，无论组织来源和供体。ASC释放的外显子主要峰值在31到36个核苷酸之间，而BMSC外显子样品显示出两种不同的特征，因此被分为亚型（BMSC I和BMSC II）。BMSC I外显体的长度分布与ASC相似，而BMSC II外显体在15和70核苷酸处出现额外的峰值。为了评估样本之间的变异性，我们进行了无监督的层次聚类分析。聚类分析显示，无论干细胞来源如何，MSC样本之间都有很强的相似性（图2亿). 然而，有趣的是，当观察外泌体制剂时，ASC样品紧密地聚集在一起，而BMSC I和BMSC II外泌体样品看起来彼此不同。根据相关分析（图3a年)表明细胞样本之间有很强的相关性（0.87<第页<0.94). 在比较外显体文库时，这种相关性降低：BMSC I和BMSC II亚型的皮尔逊系数分别为0.90和0.87，而两个亚组的皮尔森系数分别为0.66和0.73。ASC外泌体的系数在0.84到0.88之间，而ASC和BMSC外泌体总的系数在0.65到0.84之间。

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MSCs及其外泌体显示出不同的小RNA组成。一ASC和BMSCs及相应外显子（一个代表性供体）中RNAseq校准读码的长度分布。b条基于总小RNA含量的MSCs和外显体的无监督分层聚类分析。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，外显（exo）外体

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MSCs在不同分化阶段释放的外显子相互适度相关。一MSC和胞外体样本的相关矩阵。b条早期成骨分化的相对表达水平(顶部)和多能性(底部)通过定量PCR分析基因。数据按照GAPDH标准化。BMSC II表达较高水平的Sox2（方差分析测试：第页= 0.006; 费希尔PLSD测试：第页=0.02 BMSC II与ASC，第页=0.03 BMSC II vs.BMSC I），POU5F1A/B（ANOVA检验：第页=0.01；费希尔PLSD测试：第页=0.03 BMSC II与ASC，第页=0.01 BMSC II vs.BMSC I）和Nanog（方差分析测试：第页= 0.03; 费希尔PLSD测试：第页=0.056 BMSC II vs.ASC）。碱性磷酸酶碱性磷酸酶，方差分析方差分析，ASC公司脂肪间充质干细胞，骨髓基质细胞骨髓间充质干细胞，COL1A1公司胶原蛋白1型α1，外显（exo）外体，GAPDH公司3-磷酸甘油醛脱氢酶，Fisher's PLSD Fisher's保护最小显著性差异

BMSC外泌体的两个亚型之间相对较低的相关性促使我们研究产生细胞是否代表不同的分化阶段。因为MSCs在体外扩增过程中可以自发进行成骨分化[52]，我们通过定量PCR分析了早期成骨标记物的表达，如Runx2、碱性磷酸酶（ALP）和胶原蛋白1型α1（COL1A1），以及茎相关基因SOX2、POU5F1A/B和Nanog的表达（图3亿). 虽然我们没有观察到骨相关基因表达的差异，但与其他亚型相比，BMSC II亚型细胞的Sox2、POU5F1A/B和Nanog表达升高（ANOVA检验，Fisher的PLSD校正：第页Sox2和POU5F1A/B的BMSC II与ASC、BMSC II和BMSC I，以及Nanog的BMSCⅡ与ASC之比<0.05）。反映MSCs干细胞的多能性基因的不同表达水平可能解释了胞外体小RNA组成的不同。

相关矩阵分析（图3a年)强调了细胞与相应外泌体之间的弱相关性(第页≤0.57). 这意味着外显体并不严格反映起源细胞的RNA组成，而是选择性地结合多种RNA物种。事实上，我们观察到细胞中不同类别的RNA富集，而其他类别的RNA在外泌体中过度表达（图4a、b). 在所有MSC样本中，miRNAs和小核仁RNA（snoRNAs）是细胞中最丰富的RNA类别，尽管它们的比例独立于组织来源而变化（分别为19-49%和21-49%）（图4a类). 这两类共占整个细胞小RNA库的64-71%，其次是重复序列（6-11%）、tRNA（5-11%）和rRNA（高达8%）。相比之下，外显体文库在tRNAs类中高度富集，在脂肪来源外显体中占总小RNA的50%以上，在骨髓外显体和重复序列中占23-35%，从脂肪外显体的17-30%到骨髓外显体内的24-40%不等（图4a类). tRNA在外显体中的优势与它们在细胞质中的功能和丰度一致。外显体中的其他代表类是杂合RNA、rRNA和miRNA，后者仅占小RNA库的2-5%。与MSC文库中观察到的结果形成鲜明对比的是，snoRNAs仅占外体RNA含量的很小比例（<0.6%）。

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间充质干细胞及其外泌体具有不同的RNA类别分布。一MSCs和外泌体中过度表达RNA物种的相对分布。b条MSC外泌体中RNA类与由logFC排序的细胞的差异表达。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，外显（exo）外显子、snoRNA小核仁RNA、logFC对数折叠变化、FDR假发现率

总之，我们的数据表明，miRNAs和snoRNAs在细胞中显著富集（miRNA:logFC 3.35，FDR 3.3×10–10; snoRNA:logFC 6.65，FDR 4.9×10–27)而tRNAs和重复序列形成了一个在外显体中高度富集的特定RNAs库（tRNA:logFC 2.46，FDR 1.59×10–6; 重复次数：logFC 1.88，FDR 2.1×10–4个)，暗示优先排序和发布。长度分布（图2年)在ASC和BMSC I外显体中显示出31到36个核苷酸的优势峰，在BMSC II外显体的约15到70个核苷酸处显示出额外的峰，这表明外显体存在全长tRNA和tRNA片段。由于tRNA和tRNA片段参与翻译调节和RNA沉默，这些观察结果可能指出MSCs转录后调节和胞外体生物发生之间的生理联系[53,54].

间充质干细胞外泌体选择性结合特异性miRNAs

MSCs中细胞小RNA含量的很大一部分（19-49%）是miRNA。然而，这一类在外泌体中的表达不足（占总小RNA的2-5%）（图4a类). 由于这种差异，我们研究了细胞和外泌体是否具有相似的miRNA含量。

与我们之前对总小RNA图谱的研究结果一致，基于miRNA含量的无监督聚类分析和相关分析仅显示细胞样本内的高度相似性（0.89<第页<0.96），而胞外体样品显示出更大的变异性（0.75<第页<0.90). 总的来说，细胞和外泌体之间的相关性似乎较弱（图5a级; 和附加文件中的图S4A1).

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间充质干细胞及其外显子显示不同的miRNA序列。一基于miRNA含量的MSCs及其外泌体的无监督分层聚类分析。b条ASC、BMSC I和BMSC II细胞和外泌体中miRNA读取的长度分布（一个代表性供体）。c（c）高度代表的miRNA基因的序列覆盖率（基于UCSC基因组浏览器自定义轨迹）显示MSCs和外显子中主要存在成熟形式（一个或两个miRNA臂）。Y（Y）轴表示标准化计数（rpm）。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，外显（exo）外体

为了评估miRNA是作为前体还是作为完全处理的转录物存在，我们观察了miRNA读取的长度分布（图5亿)发现在所有MSC亚型中，无论是在外显体还是相应的细胞中，绝大多数miRNA序列在20到25个核苷酸之间。因此，最具代表性的miRNA基因的测序覆盖率（UCSC基因组浏览器）（图5厘米)主要显示了定位到前体的5p和/或3p臂的成熟miRNA的存在。

然后，我们检测了单个miRNA在总miRNA读数库中的相对比例（图第6页; 和附加文件中的图S4B1). 令人惊讶的是，ASC外显体中五种最丰富的miRNA（miR-486-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-191-5p和miR-222-3p）占总miRNA读取量的43-59%。为了评估miRNA在细胞和外泌体中的相对分布，我们根据百万分读取数（rpm）值对细胞和外体miRNA进行排序，并比较了细胞和外逸体中最具代表性的20种miRNA（表1). miR-21-5p、miR-22-3p、miR-10b-5p和miR-222-3p在细胞和外泌体中的表达最多；然而，各种miRNAs（表中以粗体显示1)仅出现在细胞或外体高度表达的miRNA列表中。接下来，我们询问特定的miRNAs是否优先排泄或保留在细胞中。图6b条显示了与MSC相比，外泌体中的前四个miRNA过度表达（logFC>7；FDR<5×10–15). 另一方面，与外泌体相比，miR-34a-5p、miR-34c-5p、miR-15a-5p和miR-136-3p在细胞中的表达显著过高（logFC>3；FDR<3×10–6)（图第6页c). 这些miRNA的相对丰度如附加文件中的图S4C所示1总之，miRNAs的非随机分布与处理“未使用”小RNA或与周围环境通信的分类机制一致，如其他细胞类型所示[55].

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MSC外显体选择性地结合特定的miRNAs。一miRNA在总miRNA读取库中的相对比例。五种最丰富的miRNA占总miRNA读取量的50%。b条过度代表和c（c）与产生细胞相比，MSC外显体中的miRNAs表达不足（LogFC>3；FDR<0.0002）。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，外显（exo）外体

表1

MSC外显体和细胞中最丰富的miRNAs

排名外显体中最具代表性的miRNA细胞中最具代表性的miRNA
微小RNArpm ASC外泌体微小RNArpm ASC电池
1 miR-486-5p 172,837 miR-21-5p145,332
2miR-10a-5p117,453miR-22-3p92,902
三miR-10b-5p104447个miR-10b-5p82,089
4 miR-191-5p型 92,545 miR-222-3p74,725
5miR-222-3p49,405miR-143-3p73,794
6miR-22-3p37205年let-7a-5p71,686
7let-7a-5p28,814miR-10a-5p44,303
8miR-21-5p27,233miR-92a-3p33,827
9miR-127-3p27,071let-7f-5p33,248
10miR-143-3p22,579 let-7i-5p 22,624
11 miR-99b-5p 21,471 miR-127-3p 17,303
12miR-100-5p18,836 miR-148a-3p 2009年
13miR-92a-3p基因18,217miR-26a-5p16,127
14let-7f-5p17,589miR-92b-3p14,852
15miR-92b-3p16,124 miR-21-3p 14,548
16miR-26a-5p13,207 miR-221-3p 12,481
17 miR-146a-5p 12,212 miR-16-5p 11,544
18 miR-4485型 10,656 miR-100-5p11,180
19 miR-146b-5p 10,,558 miR-31-5p 9521
20 miR-151a-3p 10,262 miR-411-5p 8051
微小RNArpm BMSC外泌体微小RNArpm BMSC电池
1miR-143-3p124,950miR-143-3p185,884
2miR-10b-5p103,485miR-21-5p150,993
三 miR-486-5p 91274个 miR-22-3p105,358
4miR-22-3p74,730let-7a-5p91,387
5miR-21-5p47,445miR-10b-5p42,729
6miR-222-3p46,094miR-222-3p38,076
7miR-191-5p型45,054miR-27b-3p35,496
8miR-100-5p41,668let-7f-5p29,054
9let-7a-5p38,486let-7i-5p21,993
10 miR-99b-5p 29,011 miR-26a-5p 21,934
11miR-92a-3p24,941miR-100-5p21,157
12miR-127-3p21,319miR-127-3p14836个
13第7页，共5页21,203 miR-148a-3p 12,789
14miR-92b-3p20,938miR-92b-3p12,306
15 miR-423-5p 19,807 miR-92a-3p11840个
16 miR-10a-5p 14,716 miR-191-5p型11,384
17miR-27b-3p13,604 miR-21-3p 11,372
18let-7i-5p11,997 miR-125b-5p 10,699
19 miR-28-3p 10,554 let-7b-5p 9603
20 miR-125b-5p 10,378 miR-16-5p 9583

仅存在于细胞或外体miRNA列表中的miRNA以粗体突出显示

ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，微小RNA微RNA，移动交换中心间充质干细胞，每分钟转数百万读取数

tRNA-衍生RNA片段在MSC外显体中高度表达

MSC外显体中tRNA序列的显著过度表达促使我们研究哪些tRNA最具代表性，以及这些tRNA是否可能是功能性加工转录物或降解产物。

我们的分析表明，无论组织来源如何，成年MSC亚型的tRNA谱基本相似（图第7页，顶部）。tRNA-CTC（Glu）在ASC和BMSCs中均高度表达，占总tRNA读取量的43-72%。为了排除导致特定tRNA序列高表达的潜在实验偏差，我们还分析了在无关细胞类型即淋巴母细胞（LCL）中通过小RNA序列获得的tRNA图谱（附加文件中的图S5A1). 有趣的是，我们在这些细胞中发现了非常独特的tRNA分布，这表明，与miRNAs类似，tRNA图谱可能有助于作为组织起源的指标。总的来说，外体tRNA图谱与细胞图谱不同（附加文件中的图S61)并显示出更多的组间差异（图第7页，底部）。MSC外显体中五种最常见的tRNA序列占总外显体tRNA库的87-97%（由40-54个不同的受体组成）。有趣的是，虽然在BMSCs和LCL中，细胞和外泌体中最丰富的tRNA明显对应，但ASC外泌体内最丰富的t RNA，即tRNA GCC（Gly），仅代表细胞总tRNA的一小部分（5%）（图第7页). 此外，与BMSC外泌体相比，这种tRNA在ASC外泌体内过度表达（logFC 3.8；FDR 1.1×10–7)（附加文件中的图S5B1).

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tRNA-衍生RNA片段在MSC外显体中高度表达。一MSCs和相应外显体中高代表性tRNA的相对分布。b条ASC和BMSC I和II细胞及外泌体中tRNA测序读数的长度分布。c（c）高度代表的tRNA基因的序列覆盖率（基于UCSC基因组浏览器自定义轨迹）。Y（Y）轴表示标准化计数（rpm）。ASC公司脂肪间充质干细胞，BMSC公司骨髓间充质干细胞，外显（exo）外体

为了研究MSC文库是否包含全长tRNA或处理过的转录物，我们分析了tRNA读取的长度分布（图7亿). 令人惊讶的是，在细胞和外显体中，tRNA片段占总tRNA的很大一部分。虽然来自两种组织来源的MSCs显示了广泛的tRNA长度，但外显体tRNA序列具有特定的片段大小。ASC外显体和BMSC I外显体主要包含30–35个核苷酸的片段，而BMSC II外显体也在70–75个核苷酸处显示出优势峰。这些发现引起了我们的兴趣，我们放大了最具代表性的tRNA基因的基因组覆盖率和长度分布（图第7页c; 和附加文件中的图S5C1). 引人注目的是，虽然脂肪和骨髓MSC在细胞水平上含有最丰富的tRNA、tRNA CTC（Glu）的全长形式，但ASC和BMSC I外显体释放的外显体始终显示出最丰富序列的33-核苷酸5′半（图第7页c; 和附加文件中的图S5C1). 由高表达多潜能因子的细胞产生的BMSC II外显子似乎优先包围tRNA CTC（Glu）的全长形式和其他丰富tRNA物种的33-核苷酸片段（附加文件中的图S5C1). 在脂肪和骨髓外泌体之间观察到的tRNA组成的显著差异保证了未来对来自不同来源和不同分化阶段的成体干细胞的旁分泌作用的研究。

尽管tRNA片段和tRNA半体在哺乳动物细胞中的功能在很大程度上仍然未知，但最近有人提出了这些tRNA物种的miRNA/siRNA（小干扰RNA）样功能[56]. 在这里，我们进行了生物信息学分析，以评估细胞和外显体中最丰富的tRNA物种与注释蛋白编码转录物的3′UTR的反义互补性。我们发现了一组假定的候选目标（表2; 和其他文件2)其中许多具有未定义的生物学功能。有趣的是，在潜在靶点中，我们发现了参与干细胞自我更新和MSC分化的因素，如TFCP2L1、RUNX2和SOX11，转化生长因子β（TGFβ）信号传导介质SMAD3，以及免疫相关因素，如HHLA2、EMR2和TRIM62。

表2

tRNA物种与蛋白编码基因3′非翻译区的互补性分析

查询查询序列命中长度 e（电子）价值比特斯科尔基因名称保护价值归一化守恒值
tRNA；谷氨酸；反恐委员会AGTGGTTAGGATTCGGCGCTCACCGCGGCCC公司140.1928.2高尔夫6A0.5100.970
tRNA；谷氨酸；TTC公司TCCCTGGTGGTCTAGTGTCGGCTCTTT公司240.01232.2TFCP2L1型0.1461.067
140.1928.2NELF公司-0.3030.962
170.7426.3KIAA0513号机组-0.3671.013
130.7426.3ZBTB45型-0.4470.950
130.7426.3HHIPL1号机组-1.1030.808
130.7426.3HSP90AA1型-0.2480.982
130.7426.3TULP4公司1.9371.345
130.7426.3SMAD3型0.2591.001
130.7426.3RPS19型-0.4740.984
130.7426.3ZNF662型0.1400.990
130.7426.3AC104841.2标准2.8101.542
tRNA；甘氨酸；通用条款GCATGGGTGGTTCAGTGGGAATTCGCCT公司180.1928.213菲律宾比索0.0420.914
140.1928.2KDSR公司-0.2430.904
140.1928.2广场20.6340.881
130.7426.3NOX5（氮氧化物）-0.2310.982
130.7426.3EPM2AIP1系列0.3730.996
130.7426.3GTF3C1型-0.4761.095
130.7426.3110加仑0.2931.053
130.7426.3TPI1型0.2410.971
130.7426.3PPP2R1B型-0.3020.875
130.7426.3LUZP2型0.1250.998
130.7426.3VPS41系列-0.2430.977
130.7426.3第1部分0.1871.025
130.7426.3RUNX2（运行2）1.3580.956
130.7426.3地图1LC3B-0.2540.890
GCATGGGTGGTCAGTAGTAATCTCGCCG公司140.1928.2通用条款10.1271.032
170.7426.3SLC2A13型0.5070.983
130.7426.3GTF3C1型-0.4761.095
130.7426.3HHLA2型-0.0751.004
130.7426.3TPI1型0.2410.971
130.7426.3聚乙二醇10-0.1260.806
130.7426.3电子病历2-0.1660.954
130.7426.3第1部分0.1871.025
110.722.3THAP5型0.1550.979
110.722.3THAP5型0.3931.029
GCATGGGTGGTTCAGTGTGAGTAATTCGCTG公司140.1928.2通用条款10.1271.032
170.7426.3SLC2A13型0.5070.983
130.7426.3GTF3C1型-0.4761.095
130.7426.3HHLA2型-0.0751.004
130.7426.3TPI1型0.2410.971
130.7426.3聚乙二醇10-0.1260.806
130.7426.3电子病历2-0.1660.954
130.7426.3第1部分0.1871.025
110.7322.3THAP5型0.1550.979
110.7322.3THAP5型0.3931.029
GCATTGGTTCAGTGAGTAATCTCGCCCCACGCGAGGCCCGGGT200.01232.2SOX11型0.1800.752
140.1928.2通用条款10.1271.032
170.7426.3SLC2A13型0.5070.983
170.7426.3FAM57B型-0.1580.849
130.7426.3HHLA2型-0.0751.004
130.7426.3C1或159-0.6630.984
130.7426.3KLC2公司-0.2240.835
130.7426.3聚乙二醇10-0.1260.806
130.7426.3DRG2（DRG2）-0.4680.817
130.7426.3VPRBP公司1.5140.913
130.7426.3TRIM62标准-0.0980.921
130.7426.3电子病历2-0.1660.954
130.7426.3ANXA8L2型2.9261.223

讨论

MSC-EV的应用优于基于细胞的治疗，因为它消除了与向患者注射多能干细胞相关的安全问题[12]. MSC分泌的外泌体最近被证明可以改善难治性移植物抗宿主病[11]并在各种临床前模型中促进器官愈合[21,32,33]. 因此，对这些囊泡进行全面表征是了解其生物活性以最大限度地发挥临床效用的关键一步。

与其他一些细胞类型相比，MSC以前被描述为外泌体的多产生产者[57]. 然而，这一结论是基于myc转化（永生化）人类胚胎干细胞衍生MSCs的使用[58]这是克服体外膨胀潜力有限所必需的。因为永生化细胞可能通过EV分泌致癌物质[59]，这些囊泡的临床用途尚不确定。此外，永生化MSC可能会产生内容发生变化的电动汽车，这使人们对这些电动汽车是否代表其自然对应物产生了更多疑问[60]. 我们在这里显示，培养中未经处理的MSC很少产生具有外源性特征的EV。因此，与我们实验室迄今为止分析的大多数细胞类型相比，培养中的MSCs具有相对较少的原型MVB[23,50]. 尽管MSC外显体与B细胞母细胞外显体具有相同的形态，并携带典型的标记蛋白，但它们在划分、生物发生以及RNA组成方面可能有所不同。此外，我们推测组织起源（成人或胚胎）和茎干等因素可能会影响外泌体的产生和含量。

MSC样本中极低的组内和组间变异性表明供体特异性特征和组织特异性微环境不会显著影响细胞的小RNA表达谱。然而，在比较EV制剂时出现了重要差异。ASC和BMSC EV之间的变异性表明，组织特异性微环境可能影响MSC的外体分选。组内变异性表明，细胞内在因素，如细胞的分化状态，可能决定了细胞所发出的信号，如之前报道的细胞因子和生长因子[61,62].

虽然大多数研究表明，miRNAs仅代表外体RNA的一小部分[28,63,64]，通过外显体转移的miRNAs可以在体内外抑制其靶点[23–27]. 在我们的分析中，我们发现MSC外显子中五种最丰富的miRNA占总miRNA读取量的50%。因此，大量存在的特异性miRNAs可能具有生理效应。在之前的研究中，Chen等人[65]显示人类胚胎干细胞衍生MSCs分泌的颗粒富含前miRNAs。相反，我们的研究表明，成人MSC外显体主要包含成熟转录物。尽管胚胎和成年MSC释放的EV可能优先包含不同的miRNA形式，但与本研究分析的差异超速离心纯化的外泌体相比，条件培养基整体上可能包含异质的RNA群体。可能，前miRNAs不会与外泌体一起释放，而是并入不同性质的囊泡中。尽管ASC和BMSC外泌体中最具代表性的miRNAs之间有很大的相似性，但它们的相对比例不同，这就增加了ASC和骨髓间充质干细胞向其微环境传递不同信息的可能性。其中一些miRNAs与MSC生物学有关[66]. miR-486参与ASC复制性衰老[67]，miR-143与MSCs的免疫调节功能有关[68]miR-10a和miR-22是MSC分化的重要调节因子[69,70]miR-10b促进小鼠骨髓间充质干细胞的迁移[71]. ASC和BMSC释放这些miRNAs可以通过控制和微调增殖、分化和归巢在干细胞生态位维持中发挥作用。此外，成人MSC外泌体中高度表达的多个miRNAs调节细胞周期进展和增殖（miR-191、miR-222、miR-21、let-7a），并调节血管生成（miR-223、miR-二十一、let-7f）和内皮细胞分化（miR-6087）[72–74]. 这些miRNAs在损伤部位的摄取可能促进多种细胞类型的增殖，并刺激组织修复用新血管的形成。

虽然外显体中功能性小RNA的研究主要集中在miRNAs的类别上，但与之前报道的免疫细胞和神经细胞的小RNA相比[28,63]与产生细胞相比，MSC外显体高度富集tRNA，特别是tRNA半体和重复。

最近的研究表明，增殖细胞和分化细胞中的tRNA池是不同的。重要的是，有人指出，参与细胞自主功能的基因携带与增殖相关tRNA相对应的密码子，而与多细胞性相关的基因需要分化相关tRNA[75]. 因此，研究MSCs通过外泌体产生和释放的最丰富的tRNA物种与细胞蛋白质组成之间的相关性，以及在特定分化程序激活后这一点可能如何变化，将是非常有趣的。

tRNA转录后加工成tRNA片段是一种非随机进化保守机制[53,54,76]. 引人注目的是，确定大小的tRNA片段在成年MSC中高度表达，tRNA半体似乎被大量分选成MSC外泌体。已知14-30核苷酸tRNA-衍生RNA片段（tRFs）与精氨酸蛋白相关，并且具有与miRNAs相似的特性[53]. 此外，这些片段可以定义转化细胞[77]. 然而，哺乳动物细胞中tRNA半体的功能在很大程度上尚不清楚。应激条件下蛋白质生物合成的抑制最初被认为是tRNA断裂最合理的解释。然而，tRNA的两半通常不均匀稳定，这表明这些tRNA片段的作用更加复杂[54]. 最近，5′半被认为与应激诱导的翻译抑制和应激颗粒的形成有关[78]. 在MSCs中，tRNA半体似乎在标准培养条件下以相对较高的水平表达，可能表明其具有生理功能。

我们发现ASC外显子主要携带tRNA半体，几乎没有全长转录物。BMSC外显体具有两种不同的tRNA长度，似乎与分化状态有关。事实上，表达高水平关键干细胞标记物（BMSC II）的BMSCs同时包含全长转录物和33-核苷酸片段，而分化程度更高的细胞（BMSC I）显示出与ASC外体相同的tRNA长度特征。然而，有趣的是，外泌体中最丰富的tRNA并不总是与细胞中的tRNA相对应，这表明细胞可以对特定的tRNA进行分类，这可能是基因表达调控的一种机制。通过分析最丰富的tRNA读数的基因组覆盖率，我们发现ASC和BMSC I外显子分别显示了最具代表性的tRNA序列的5′半，tRNA GCC（Gly）和CTC（Glu）。最近研究表明，tRNA-CTC（Glu）的5′半以miRNA/siRNA-like的方式作用于沉默靶mRNAs[56]，尽管该片段和其他片段的假定目标转录本尚未确定。

细胞和外显子中最丰富的tRNA物种与蛋白质编码基因的3′UTR的互补性分析突出了与干细胞更新、分化和免疫调节有关的有趣的假定tRNA靶点。例如，我们发现：TFCP2L1，一种参与干细胞自我更新的转录因子[79]; RUNX2和SOX11，MSC分化中的主转录因子[80,81]; 转化生长因子β诱导增殖、分化和存活的介质SMAD3；RPS19参与红细胞生成分化和增殖[82]; 以及免疫相关因子和炎症介质，如HHLA2、EMR2和TRIM62[83–85]. 还需要进一步研究来阐明tRNA片段的生物学功能，并评估其通过外显子的释放是否与组织结构的协调有关。

结论

EV-转导RNA在体内生理过程中的作用尚不清楚，部分原因是导致靶细胞生理变化所需的单个RNA分子的最小数量难以预测，并且可能涉及许多因素。最近的一个假设是，EV中最丰富和丰富的RNA物种起主导作用。通过RNAseq分析，我们可以证明成年MSC外显体中最丰富和富集的小RNA是tRNA物种。此外，脂肪和骨髓MSC亚型分泌不同的tRNA物种，这可能与临床应用有关。未来的研究应侧重于这些tRNA分子如何在生理条件下通过MSC外泌体转运，以及它们是否以细胞类型依赖的方式影响其微环境。

致谢

这项工作得到了意大利癌症研究基金会（FIRC）海外奖学金和欧莱雅-联合国教科文组织“科学中的女性”奖（SRB）的支持。

缩写

碱性磷酸酶碱性磷酸酶
ASC公司脂肪衍生间充质干细胞
BMSC公司骨髓间充质干细胞
英国标准协会牛血清白蛋白
COL1A1公司胶原蛋白1型α1
欧洲经济区1早期内体抗原A1
相对长度单位电子显微镜
电动汽车胞外囊泡
FACS公司荧光激活细胞分选
FBS公司胎牛血清
FITC公司异硫氰酸荧光素
GAPDH公司3-磷酸甘油醛脱氢酶
拼箱拼箱淋巴母细胞
α-MEMAlpha-minimum基本培养基
移动交换中心间充质干细胞
微小RNA微小RNA
多功能车辆总线多泡体
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
损益血小板裂解物
每分钟转数每百万读取次数
转化生长因子-β转化生长因子β
tRF公司tRNA-衍生RNA片段
3英尺UTR3'未翻译区域

其他文件

附加文件1：图S1。（250万，ppt）

显示生物信息学工作流。图S2显示MSC起源（A）、FACS分析的表面标记物表达（B）和茜素红染色评估的成骨分化（C）。图S3显示了MSC和外显体、PL和FBS（A）中CD63和CD81的检测，以及MSC细胞和外体RNA（B）的cDNA文库。图S4显示了基于miRNA图谱（A）的MSC和外显子样本的相关矩阵、单个miRNA在细胞总miRNA读取储备中的相对比例（B）以及细胞和外显体中差异表达的miRNA的rpm（C）。图S5显示了tRNAs在MSCs、LCL和各自外显体中的相对分布（A），与ASC外显体相比，在BMSC外显体上差异表达的tRNA（B），以及在MSC细胞和外显体（C）中最具代表性的tRNA的长度分布。图S6显示了与细胞相比，外显体中tRNA的差异表达。

附加文件2：表S1。（28K，xlsx）

提出了最丰富的tRNA物种与注释蛋白编码转录物的3′UTR的反义互补性。

脚注

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

SRB构思和设计了这项研究，进行了实验，汇编和解释了数据，并撰写了手稿。KR对数据进行了分析和解释，进行了统计分析，并撰写了手稿。DK-L、FJV、NZ和MPL进行了实验。BN、FP和HWMN分离、表征并提供原始MSC培养物。NB构思并设计了该研究。DMP构思并设计了这项研究，解释了数据，并撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

参与者信息

Serena Rubina Baglio，电话：+31（0）204444052，ln.cmuv@oilgab.s.

Koos Rooijers，ln.ikn@srejioor.k.

Danijela Koppers Lalic，在cilal.d时的ln.cmvv.

弗雷德里克·J·韦尔韦伊（Frederik J.Verweij），moc.liamg@jiewrevkirederf.

佩雷斯·兰佐，moc.liamg@noznalzerepairam公司.

尼科莱塔·齐尼，ti.rnc.ob.aera@inizn公司.

Benno Naaijkens，moc.liamg@snekjiaanoneb公司.

弗朗西丝卡·佩鲁特，ti.roi@turep.acsecnarf.

汉斯·W·M·尼森，邮箱：ln.cmuv@nessein.mwj.

尼古拉·巴尔迪尼，ti.roi@inidlab.alocin.

D.米歇尔·佩格特尔，电话：+31（0）204444052，ln.cmuv@letgep.d公司.

工具书类

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文章来自干细胞研究与治疗由以下人员提供BMC公司