淋巴循环延伸到身体的大部分，通过促进清除多余的液体和大分子物质，促进组织内环境稳定和功能(Secker和Harvey，2015年). 然而，中枢神经系统（CNS）被认为缺乏淋巴管，这就提出了一个长期存在的问题，即大脑间质液（ISF）如何清除废物(Iliff和Nedergaard，2013年). 化合物的交换受到血脑屏障的限制，血脑屏障是大脑和循环血液之间的扩散屏障。因此，大多数化合物的血管清除依赖于特定的活性转运体机制(兹洛科维奇，2011年). 此外，大脑已经适应了使用一种独特的血管旁通路，在这种通路中，液体可以沿着胶质“淋巴”（glymphatic）通路在大脑ISF和脑脊液（CSF）之间自由交换，而不需要穿过严格调节的内皮细胞（EC）层(Iliff等人，2012年;谢等人，2013). 在淋巴系统的下游，大多数脑脊液被认为通过蛛网膜颗粒排入静脉循环。然而，几项研究发现，相当大比例的脑脊液也被排入颅外淋巴管和淋巴结(Koh等人，2005年). 然而，脑脊液进入颅外淋巴室的机制尚不清楚。
在过去的十年中，通过识别特定的淋巴EC标记物，如prospero同源盒蛋白1（prospero homeobox protein 1，PROX1）转录因子，一种指定淋巴EC命运的程序中的主调节器，淋巴管的可视化得到了显著的促进(Hong等人，2002年)，血管内皮生长因子受体3（VEGFR3），淋巴管生成性酪氨酸激酶受体(Secker和Harvey，2015年)，趋化因子（C-C基序）配体21（CCL21），一种由淋巴内皮细胞分泌的趋化因子，促进树突状细胞向淋巴结迁移(Liao和von der Weid，2015年)淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）和足蛋白（PDPN）；Oliver和Srinivasan，2010年). 我们最近发现，在眼睛中，另一个先前被认为缺乏淋巴循环的免疫器官，Schlemm管是淋巴管样血管(Aspelund等人，2014年). 这些有趣的矛盾和我们最近的发现使我们更详细地研究了中枢神经系统淋巴循环的可能性。
结果和讨论
大脑周围硬脑膜中的淋巴管
大脑被脑膜衬里所包裹，脑膜衬里由三层组成：软脑膜紧紧贴附在大脑表面，蛛网膜下腔上覆盖着无血管蛛网膜，血管化的硬脑膜与颅骨融合。为了确定中枢神经系统和周围脑膜内是否存在淋巴管，我们分析了Prox1-GFP传感器和素食者3+/LacZ公司报告小鼠和WT小鼠颅骨和大脑针对LYVE1、PROX1、PDPN、CCL21、VEGFR3和PECAM1的整体免疫荧光制剂。为了可视化血管Prox1-GFP传感器用荧光染料1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁（DiI；Li等人，2008年).
从颅骨中取出大脑后，在脑实质或软脑膜上看不到淋巴管（未描绘）。然而，在颅骨下方的脑膜中观察到一个惊人的广泛淋巴管网络(; 和视频1). 在内颅骨的矢状面上，观察到淋巴管沿着横窦、乙状窦、肩胛盂后静脉、头侧鼻静脉以及脑膜中动脉和脑膜前动脉的主要分支向下延伸至颅底(; 和视频1）。在颅骨上部的准备过程中，沿上矢状窦、横窦、口鼻腔静脉和脑膜中动脉可见淋巴管(). 沿着翼腭动脉的脑膜部分，可以观察到大量淋巴管从颅骨流出，翼腭血管是颈内动脉的一个分支，从颅骨内外潜入，形成脑膜中动脉(). 乙状窦和肩胛后静脉的淋巴管沿静脉从颅骨流出(). 在颅底的准备过程中，可以在几个颅神经（视神经、三叉神经、舌咽神经、迷走神经和附件）的远端看到淋巴管，沿着神经离开颅骨(). 筛板的硬脑膜衬里中也可以观察到淋巴管，其中一些血管穿过颅骨进入鼻粘膜().
脑硬脑膜中终末分化的淋巴管。CNS淋巴管的可视化Prox1-GFP传感器DiI血管造影的报告鼠，素食者3+/LacZ公司如图所示，报告小鼠和PECAM1免疫荧光，以及淋巴标记物PROX1、LYVE1、PDPN、CCL21和VEGFR3。白色箭头表示淋巴管，黄色箭头表示颅骨出口部位，星号表示瓣膜。（A） 分析的各个区域的示意图。粗体字母表示下面的相应图像。脑膜中动脉；PPA，翼腭动脉；RGV，关节盂后静脉；RRV，吻侧鼻静脉；SS，乙状窦；SSS，上矢状窦；电视，横静脉。（B） 淋巴管沿着SS向下流动，并从颅骨流出。（C） 淋巴管沿着MMA近端分支向下流动。（D） RGV周围的淋巴管，一些血管从颅骨流出。（E–H）颅骨顶部和底部的全贴装LYVE1免疫荧光。（E） 淋巴管沿SSS和MMA前支远端向前角延伸。（F） 淋巴管沿着SSS，在鼻窦汇合处分叉进入TV。（G） 淋巴管沿视神经（II）和三叉神经（V）和筛板（CP）离开颅骨。CN，颅神经。（H） 与舌咽（IX）、迷走神经（X）和副（XI）神经相关的淋巴管。十二、 舌下神经。（I和J）素食者3+/LacZ公司报告鼠显示硬脑膜淋巴管沿PPA（I）的颅骨出口，并通过CP进入鼻甲。嗅球面积。（K） PECAM1、PROX1和CCL21厚颅骨切片的免疫荧光。bv、血管；蛛网膜下腔。（L–P）用抗PECAM1（L）、LYVE1（M）、PDPN（N）、CCL21（O）、VEGFR3（P）和PROX1（M–P）抗体对上矢状淋巴管进行整体免疫荧光染色。LYVE1和PECAM1共定位用虚线表示。n个=每染色2–3。数据来自两到三个独立的实验。棒材：（B–H和L–P）100µm；（K） 50微米。
一般来说，颅骨上部的淋巴管相对稀少，而颅底包含更广泛的淋巴管网络(). 有趣的是，只有颅底的淋巴管含有瓣膜，但它们的分布相对较少。阀门被无阀血管段的长延伸分开().
为了确定这些血管相对于脑膜的定位，对厚颅骨切片进行了分析。在这些制剂中，PROX1和CCL21阳性淋巴管出现在颅骨骨质部分下方的脑膜中，靠近硬脑膜血管().
上矢状淋巴管的整体免疫荧光染色显示，与传统淋巴管一样，硬脑膜淋巴管表达极低水平的PECAM1()但LYVE1、PDPN、VEGFR3、CCL21和PROX1水平较高(;Aspelund等人，2014年). 因此，硬脑膜淋巴管由末端分化的淋巴管内皮排列。
总的来说，这些数据表明，中枢神经系统的硬脑膜中存在淋巴管，并通过颅底孔沿着动脉、静脉和颅神经排出颅骨。我们根据这些淋巴管的静脉、动脉或颅神经对应物来命名这些淋巴管。血管的定位提示了脑脊液通过蛛网膜吸收的可能作用。
硬脑膜淋巴管将脑ISF引流至颈深淋巴结（dcLNs）
注入大脑ISF的示踪剂已被证明通过glymphatic系统转移到脑脊液，并进一步转移到dcLNs(Koh等人，2005年;Iliff等人，2012年;Plog等人，2015年). 然而，尚不清楚这些示踪剂是如何进入LN的。我们假设硬脑膜淋巴管吸收脑内ISF和CSF。为了测试这一点，我们注入了明亮的近红外染料IRDye 680（PEG-IR染料；Proulx等人，2013年)进入脑实质Prox1-GFP传感器老鼠。注射后2小时，观察到示踪剂通过静脉旁途径离开大脑进入脑脊液空间（未描述），如之前所述(Iliff等人，2012年). 脑ISF的淋巴引流通过在dcLN中观察到强烈信号而不是在颈浅LNs（scLNs；). 观察到优先引流至注射侧的同侧dcLN(). 当追踪充满示踪剂的dcLN传入淋巴管上游时，这些淋巴管似乎从颅底流出(). 在颅骨内部，仅在颅骨的基底部观察到一些PEG-IRDye填充硬脑膜淋巴管()，表明被淋巴管吸收，但很快就会被冲走。当结扎dcLN的传出淋巴管时()，硬脑膜淋巴管充盈增强(). 这些数据表明，硬脑膜淋巴管从蛛网膜下腔吸收脑内ISF/CSF，并将其转运至下游dcLNs。
硬脑膜淋巴管将脑ISF排入dcLNs。（A–J）脑ISF淋巴流出途径的荧光立体显微镜分析Prox1-GFP传感器将PEG-IRDye（红色）注射到脑实质1小时后（绿色）小鼠，不结扎（A-F）和（G-J）dcLN的传出淋巴管。有关实验装置的示意图以及结扎和不结扎结果的总结，请参见K。（A和B）dcLN和scLN（均用箭头表示）显示优先填充同侧dcLN，但未填充scLN。（C） 通过传出颈动脉淋巴管（箭头）排入同侧dcLN。CCA，颈总动脉。（D） 骨颅骨正下方的颈内动脉（ICA）和邻近淋巴管（白色箭头），显示颅骨引流（黄色箭头）。（E和F）翼腭动脉（PPA）周围的淋巴管，显示硬脑膜淋巴管（箭头）仅在颅骨基底部靠近其出口处吸收示踪剂。MMA，脑膜中动脉。（G） 在dcLN的传出淋巴管（星号）周围放置缝合线。箭头，传入淋巴管。（H） 结扎后dcLN的传入淋巴管（星号），显示传入血管肿胀（箭头）。（I和J）MMA后支周围的淋巴管，显示结扎后淋巴管充盈增加，延伸至关节盂后静脉（RGV）水平以上。n个=2–3/组。数据是两个独立实验的代表。棒材：（A–E和G–J）500µm；（F） 100微米。
K14-VEGFR3-Ig小鼠硬脑膜淋巴管缺如
通过VEGFR3的VEGF-C/D信号传导是淋巴管生成的关键调节因子(Secker和Harvey，2015年). 为了（a）研究硬脑膜淋巴管是否受VEGFC/D–VEGFR3信号调节，以及（b）确定一个可以检测硬膜淋巴管再生障碍的功能后果的动物模型，我们研究了K14-VEGFR3-Ig转基因（TG）小鼠，其VEGF-C/D–VEGFR3信号受损。这些小鼠表达一种可溶性VEGF-C/D陷阱蛋白，该蛋白由VEGFR3的配体结合Ig同源结构域1-3与Igγ的Fc结构域融合而成(Mäkinen等人，2001年). 虽然VEGF-C/D trap转基因在角质形成细胞中表达，但循环蛋白抑制大多数组织中的淋巴管生成，小鼠表现为LN发育不全(Mäkinen等人，2001年;Alitalo等人，2013年). 与WT同窝小鼠相比，TG小鼠颅骨上部和底部均无淋巴管(). 令人惊讶的是，小鼠只表现出缺乏scLNs，而没有dcLNs(; 和). 这些数据表明，硬脑膜淋巴管对VEGF-C/D信号的抑制非常敏感，并且硬脑膜的淋巴管对血管内皮生长因子-C/D的信号传导非常敏感K14-VEGFR3-IgTG小鼠是研究大脑淋巴引流缺失的功能后果的合适模型。
硬脑膜淋巴管缺如K14-VEGFR3-IgTG小鼠。（A–F）硬脑膜淋巴管分析K14-VEGFR3-IgTG和WT同窝对照小鼠。（A–C）PECAM1、PROX1和CCL21（A和B）上矢状淋巴管（箭头）的免疫荧光和PROX1的定量+/CCL21型+淋巴EC（LEC）/网格（C）。（D–F）翼腭和脑膜中部淋巴管（箭头）PECAM1和PROX1（D和E）的免疫荧光以及PROX1的定量+LEC/电网（F）。（G–I）立体显微镜照片，显示TG小鼠（G和H）中没有scLN（箭头），并量化（左/右平均）scLN和dcLN表面积（I）。dcLN的显微照片如所示（A–F）n个=3（TG）和4（WT）。（G和H）n个=4/组。数据是两个独立实验的代表。棒材：（A、B、D和E）100µm；（G和H）2 mm。误差条表示SD。统计分析：双尾学生吨测试（C和F）和双向方差分析（ANOVA），然后是什蒂亚克的事后测试（I）。***，P<0.001；****，P<0.0001。
硬脑膜淋巴管缺乏会影响中枢神经系统大分子的清除。脑实质内注射后2小时A488-OVA分布分析K14-VEGFR3-IgTG小鼠和WT室友对照组。（A和B）使用IVIS成像对大脑中的外荧光效率进行代表性假彩色图和量化。（C和D）dcLN中荧光的代表性图像和量化（用箭头表示）。（E和F）A488-OVA示踪剂（箭头所示）在PPA和MMA周围LYVE1染色的淋巴管中积聚的代表性荧光图像，以及A488-OVA阳性信号的定量。注意灌注固定导致示踪剂部分从血管泄漏。（G） 用DAPI和抗内黏蛋白抗体（EMCN）染色的脑切片的荧光图像，显示A488-OVA示踪剂在glymphatic系统中的分布。（H） 沿着G中的指示线进行荧光图谱分析，显示TG和WT小鼠内皮下和血管周围间隙（箭头）中的A488-OVA信号。（一） 用DAPI和LYVE1抗体染色的dcLNs的免疫荧光图像。（J） LYVE1的量化+TG小鼠和WT同胞对照组的dcLNs区域。（A、B和G–J）n个=4（TG）和3（WT）。（C–F）n个=3（TG）和4（WT）。数据是两个独立实验的代表。棒材：（C）2 mm；（E） 100微米；（G） 8微米；（一） 1000微米。误差条表示SD。统计分析：双尾学生吨测试**，P<0.01；***，P<0.001。
硬脑膜淋巴管缺乏会影响中枢神经系统大分子的清除
首先，我们假设硬脑膜淋巴管的缺失会损害ISF和溶质从大脑中的清除。因此，在TG和WT小鼠中测量脑含水量和ISF压力（IFP）。令人惊讶的是，IFP（TG vs.WT：2.50±0.54 vs.2.53±0.53 mmHg，P=0.92，n个=6/组）和含水量（TG vs.WT:3.68±0.023 vs.3.71±0.043 g/g干重，P=0.27，n个=4/组），两组之间无显著差异。这些结果表明，在生理条件下，大脑有其他方法来管理从血管中溢出的液体。
其次，我们假设硬脑膜淋巴管的缺失可能会损害大脑中大分子的清除。为了验证这一点，我们研究了Alexa Fluor 488共轭OVA（A488-OVA，～45 kD）的大脑清除率，这是一种在固定过程中保留荧光信号的大分子。在TG和WT同窝小鼠脑实质注射后2 h，我们记录了脑组织、dcLN和硬脑膜淋巴管荧光。小鼠在处死后进行灌注固定，以防止示踪剂流出。有趣的是，TG小鼠在注射后2小时的时间点表现出OVA清除量的显著减少(). 此外，在TG小鼠的dcLNs中观察到OVA蓄积几乎完全消失(). 在WT小鼠翼腭动脉和脑膜中动脉周围可以观察到充满示踪剂的淋巴管，但在TG小鼠中没有这种现象(). 为了评估引流缺陷的其他可能原因，我们分析了脂肪族功能和dcLN的引流能力。在这种程度上，TG小鼠没有显示出glymphastic功能的质量缺陷，正如在内皮下和血管周间隙中可检测到的血管旁流出的示踪剂所示()或dcLN中引流淋巴管数量显著减少(). 我们还研究了大池注射后PEG-IRDye从蛛网膜下腔转移到dcLNs的情况，这在TG小鼠中明显受到抑制(). 总的来说，这些数据表明硬脑膜淋巴管有助于清除大脑中的大分子。
硬脑膜淋巴管的缺乏抑制了脑脊液对dcLNs的吸收。（A） 实验装置的示意图。（B） 大池注射PEG-IRDye 30分钟后，TG和WT小鼠dcLN的典型荧光图像。AF，绿色通道自动荧光。棒材，1000µm。（C） dcLN荧光定量。n个=6（TG）和5（WT）。数据是两个独立实验的代表。误差条表示SD。统计分析：双尾学生吨测试*，P<0.05。
在这项研究中，我们报告了中枢神经系统硬脑膜中令人惊讶的淋巴管网络发现，硬脑膜淋巴管由完全分化的PROX1排列+/血管内皮生长因子3+/LYVE1系列+/PDPN（PDPN）+/CCL21型+/PECAM1公司低的淋巴管内皮在其形态和瓣膜稀少方面是独特的。18世纪末，意大利解剖学家保罗·马斯卡尼（Paolo Mascagni）描述了脑膜和大脑表面的淋巴管，但他的发现无法重现(马斯卡尼和贝里尼，1816年;Lukić等人，2003年). 中枢神经系统本身被认为没有淋巴管系统。顺便提一下，在大鼠硬脑膜神经支配的电子显微镜研究中提到了淋巴管。此外，还检测到与鼠筛板和人视神经相关的淋巴管(Andres等人，1987年;Gausas等人，2007年;Furukawa等人，2008年). 然而，硬脑膜淋巴网络的范围，或其在脑脊液清除中的作用，尚未认识到。
根据经典的教科书模型，脑脊液由脉络丛产生，流经脑室和蛛网膜下腔，被蛛网膜颗粒吸收并输送至脑静脉窦(2010年，波利). 然而，最近的发现确立了glymphatic系统是大脑废物清除的关键调节器，尤其是在睡眠期间(Iliff等人，2012年;谢等人，2013). 除了通过蛛网膜颗粒清除脑脊液外，几项研究已经证实，部分脑内ISF和CSF被排至颈部淋巴结，但目前尚不清楚CSF如何进入淋巴结(Koh等人，2005年;Weller等人，2009年). 筛板下鼻淋巴管中脑脊液示踪剂的观察表明通过嗅神经鞘通过筛板清除(Kida等人，1993年;Koh等人，2005年). 此外，观察到脑脊液清除沿脊髓和颅神经鞘发生，随后进入颅外淋巴管(Miura等人，1998年;Weller等人，2009年).
我们的数据表明，软脑膜内注射示踪剂后，硬脑膜淋巴管充盈，而硬脑膜内缺乏示踪剂K14-VEGFR3-IgTG小鼠。这表明了一种模型，在该模型中，脑ISF的一部分，即glymphatic系统下游，作为脑脊液直接从蛛网膜下腔清除进入硬脑膜淋巴管。有趣的是，我们还观察到沿颅神经硬脑膜流出颅骨的淋巴管。此外，我们观察到淋巴管穿过筛板，这可能解释了之前的一些观察结果。由于脑脊液间隙和颅外淋巴管之间缺乏其他已知的直接解剖联系，硬脑膜淋巴管可能是颅外淋巴室最重要的脑脊液来源。
对于患有阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的患者来说，了解脑废物管理机制的重要性得到了强调，这些疾病的特点是错误折叠的蛋白质（如淀粉样β）在病理学上积聚到脑实质中(Deane等人，2008年;Huang和Mucke，2012年). 在其他组织中，淋巴管对大分子的吸收至关重要(Tammela和Alitalo，2010年). 在生理条件下，大脑中淀粉样β的主要部分通过血管途径被清除(兹洛科维奇，2011年;赵等，2015). 然而，最近的证据表明，glymphatic系统也可能是淀粉样β清除的关键(Iliff等人，2012年). 目前的数据表明，缺乏硬脑膜淋巴引流导致OVA从脑间质的清除受到抑制，这表明硬脑膜的淋巴管对脑ISF和CSF中大分子的吸收至关重要。
重要的是，这些发现为研究开辟了新的途径。可以预见硬脑膜淋巴管的其他几个潜在作用，例如在脑免疫细胞的运输、在dcLN中的抗原提呈以及在清除脑水肿中。这些数据也可以解释为什么原发性脑肿瘤很少转移到颈部淋巴结(Mondin等人，2010年). 有趣的是，手术切除dcLN会导致小鼠认知功能障碍(Radjavi等人，2014年)据报道，结扎颈深淋巴管会增加大鼠脑水肿和梗死体积，从而加重中风后的脑缺血(Si等人，2006年). 应进行进一步的研究，以确定硬脑膜淋巴管在中枢神经系统稳态和疾病中的全部作用。
