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.2015年7月；18(7):978-87.
doi:10.1038/nn.4025。 Epub 2015年5月25日。

PICALM在淀粉样β血脑屏障转运和清除中的中心作用

Zhen Zhao先生 1, Abhay P Sagare公司 1, 马庆义 1, 马修·哈利迪 1, 潘坤（Pan Kong） 1, 卡桑德拉·基斯勒 1, 伊桑·A·温克勒 2, 安妮塔·拉马纳森 1, Takahisa Kanekiyo先生 三, 布国军 三, 内莉·丘基·欧文斯 1, Sanket V Rege公司 1, 加布里埃尔·西 1, 阿希姆·阿胡贾 1, 朱东辉 4, 卡罗尔·米勒 5, 朱莉·施耐德 6, 马纳米·迈达 7, 前田高弘 7, 托鲁·苏加瓦拉 8, 贾斯汀·伊奇达 8, 贝里斯拉夫·兹洛科维奇 1
附属公司

PICALM在淀粉样β血脑屏障转运和清除中的中心作用

Zhen Zhao先生等。 自然神经科学. 2015年7月.

勘误表in

  • 作者更正：PICALM在淀粉样β血脑屏障转运和清除中的中心作用。
    Zhao Z、Sagare AP、Ma Q、Halliday MR、Kong P、Kisler K、Winkler EA、Ramanathan A、Kanekiyo T、Bu G、Owens NC、Rege SV、Si G、Ahuja A、Zhu D、Miller CA、Schneider JA、Maeda M、Maeda-T、Sugawara T、Ichida JK、Zlokovic BV。 Zhao Z等。 自然神经科学。2024年1月；27(1):208. doi:10.1038/s41593-023-01509-y。 自然神经科学。2024 PMID：37985802 没有可用的摘要。

摘要

PICALM是阿尔茨海默病（AD）的一个高度验证的遗传危险因素。我们发现，AD和小鼠脑内皮细胞中PICALM表达减少与淀粉样β（Aβ）病理学和认知功能障碍相关。此外，Picalm缺乏降低了小鼠血脑屏障（BBB）的Aβ清除率，并加速了Aβ病理变化，这种变化可以通过内皮细胞Picalm再表达逆转。利用人脑内皮单层膜，我们发现PICALM调节了与关键的Aβ清除受体低密度脂蛋白受体相关蛋白-1结合的Aβ的PICALM/氯氰菊酯依赖性内化，并引导Aβ转运到Rab5和Rab11，导致Aβ内皮细胞的跨细胞吞入和清除。AD衍生的内皮单层中的PICALM水平和Aβ清除率降低，这通过腺病毒介导的PICALM转移是可逆的。携带rs3851179保护性等位基因的诱导多能干细胞衍生的人内皮细胞表现出更高的PICALM水平和增强的Aβ清除率。因此，PICALM调节Aβ血脑屏障的转运和清除，这对Aβ脑稳态和清除治疗具有意义。

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数字

图1
图1。阿尔茨海默病患者脑毛细血管内皮细胞PICALM减少
一年龄匹配的对照组（Braak I，左）和AD组（Brak V–VI，右）前额叶皮层中PICALM和Aβ免疫染色。棒材=20µm。b条对来自对照组（Braak 0–I）和AD患者（Brak V–VI）的分离微血管和微血管衰竭大脑中的PICALM、von Willebrand Factor（vWF）、β3微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和GAPDH（负荷控制）进行免疫印迹。c（c），通过与GAPDH相关的密度测定分析确定对照组和AD患者微血管和微血管衰竭大脑中PICALM的相对丰度。平均值±s.e.m.，n=6/组；经方差分析和Tukey事后检验，p<0.05。d日年龄匹配的对照组（Braak I）和AD患者（Braak-III和V-VI）海马（CA1）中的PICALM（绿色）、凝集素阳性内皮毛细血管轮廓（品红色）和微管相关蛋白2（MAP2）阳性神经元（红色）。棒材=20µm。e（电子），量化前额叶皮层和CA1海马亚区中PICALM阳性区域（百分比）占据凝集素阳性内皮毛细血管轮廓。平均值±标准差，n=9名对照组（Braak 0-I）和7名AD患者（BraakV–VI）；经学生t检验，p<0.01。f–i型，前额叶皮层PICALM阳性区域凝集素阳性内皮毛细血管轮廓（百分比）与Aβ负荷之间的相关性(如果)，制动阶段(克)，临床痴呆分级（CDR）(小时)和Mini-精神状态检查（MMSE）(我). 中的每个点f–i型是50的单个值(f–g), 28 (小时)和37(我)控制和AD病例。CDR和MMSE并非适用于所有病例。通过皮尔逊和斯皮尔曼等级相关分析得出显著性。
图2
图2。Aβ间隙减小图片报+/−老鼠
一，脑微血管中PICALM（红色）和内皮特异性凝集素（蓝色）的免疫染色Picalm公司+/+和Picalm公司+/−老鼠。b条，通过免疫印迹和密度测定分析研究了脑微血管和微血管缺失脑匀浆中PICALM蛋白与β-肌动蛋白的相对丰度图片报+/+和图片报+/−老鼠。学生t检验P<0.05；NS，不重要。每组3-4只小鼠的平均值为±s.e.m。c–fAβ40（左）、Aβ42（中）和14C–菊粉（右）(c（c）)穿过BBB的Aβ40和Aβ42间隙(d日)和间隙流体（ISF）体积流(e（电子）)和血浆Aβ40或Aβ42水平(如果)脑内注射人合成的Aβ40、Aβ42和14C–菊粉进入3个月大的尾状核图片报+/+和图片报+/−老鼠。使用人类特异性Aβ40或Aβ42 ELISA测定大脑和血浆中的Aβ。平均值±s.e.m.，每组6只小鼠。学生t检验的统计显著性。NS，不重要。经学生t检验，p<0.05。NS，不重要。
图3
图3。Aβ清除率降低和病理加速应用程序软件/0图片报+/−老鼠
a–b，ISF Aβ40和Aβ42由监控的级别体内3个月大的海马微透析应用程序软件/0；Picalm公司+/−和应用程序开关/0；Picalm公司+/+老鼠。监测基线Aβ水平3小时。c（c），腹腔注射化合物E（γ-分泌酶抑制剂）20 mg/kg后测定ISF Aβ40和Aβ42的消除半衰期。d日3个月大的人Aβ特异性抗体染色的代表性皮质和海马切片应用程序软件/0；图片报+/+和应用程序软件/0；图片报+/−小鼠，无Aβ沉积。棒材：100µm。e–f、9个月大的代表性海马和皮层切片用人类Aβ特异性抗体染色应用程序软件/0；图片报+/+和应用程序软件/0；图片报+/−小鼠，Aβ沉积加速(e（电子）)Aβ负荷增加(如果). 在c（c）和如果，表示±s.e.m.，n=5-6只/组。g–i类，9个月大时的行为变化应用程序软件/0；图片报+/+和应用程序软件/0；图片报+/−用筑巢法研究小鼠(克)，挖洞(小时)、新对象定位（NOL）和新对象识别（NOR）(我). 平均值±s.e.m.n=12-14只/组。在g–i类Student t检验的统计显著性。在我，箱线图表示中间值（暗水平线），方框表示第25和75个百分位，胡须表示第5和95个百分位数第个百分位数。
图4
图4。内皮细胞特异性修复海马PICALM缺乏症应用程序软件/0图片报+/−老鼠
一，PICALM的内皮特异性拯救方案应用程序开关/0；Picalm公司+/−；Tie2–Cre公司使用腺相关病毒的小鼠(AAV公司)携带Cre重组酶依赖性表达盒旗帜–Picalm转基因（详见方法）。b条，Flag–PICALM在5个月大婴儿内皮细胞中的表达应用程序软件/0；图片报+/−；Tie2–Cre公司鼠标在后面AAV–Flex–Picalm公司海马区给药。凝集素，内皮特异性标记物。Co–注入AAV–突触蛋白–GFPFlag–PICALM在神经元中的表达不显著（<3%）。c–e类PICALM在小鼠同侧海马的内皮特异性表达应用程序软件/0；图片报+/−；Tie2–Cre公司小鼠注射AAV–Flex–Picalm公司（请参见b条)减少Aβ沉积(c–d码)Aβ40和Aβ42的积累(e（电子）)6个月大时，与对侧海马注射AAV–柔性控件。未注射的皮层AAV–Flex–Picalm公司Aβ负荷无变化(c、， d日). 红线输入d日表示平均值。配对Wilcoxon符号秩检验P<0.01。f–g，双侧海马给药AAV–柔性–Picalm与相比AAV–柔性（对照）改善6个月大婴儿的行为应用程序软件/0；图片报+/−；Tie2–Cre公司老鼠。平均值±s.e.m.，每组10只小鼠。经学生t检验，p<0.05。
图5
图5。脑内皮细胞对PICALM/氯氰菊酯依赖性Aβ-LRP1复合物的内吞作用
a–b，LRP1–Aβ40复合物与PICALM的显色(一)和氯氰菊酯重链（CHC）(b条)在FAM–Aβ40（250 nM）治疗后30 s内，在人脑内皮细胞（BEC）中进行检测。c（c），不含Aβ（–Aβ）的LRP1、PICALM和CHC的免疫染色。Dapi，核染色（蓝色）。插图：放大倍率更高。棒材=10µm。d日，与PICALM共定位的LRP1点定量a、 c（c）和CHCb、 c（c）和FAM–Aβ40点与LRP1和PICALM共定位a、 b条.三份主要分离物的平均值±标准差。经学生t检验，p<0.05。e（电子）Aβ40（1 nM）刺激30 s或5 min后，在BEC中通过LRP1特异性抗体（IP:LRP1）协同免疫沉淀PICALM、CHC和网格蛋白适配器蛋白α-adaptin（AP-2）；IgG，非免疫性IgG。如果，对照BEC（载体）中的LRP1内化以及用si转染后.加扰RNA和/或si.RNA靶向皮卡姆或CHC公司。在4°C下施加β40（1 nM）15分钟，然后在37°C下施用1分钟，以启动LRP1内化。4°C时的值取100%。三份主要分离物的平均值±标准差。经方差分析和Tukey事后检验，p<0.05。克,体外人重组PICALM与GST标记的LRP1 C末端融合蛋白（GST–LRP1C）的结合。小时，C–人类LRP1小基因（LRP4T100）的末端突变体。我，在转染Flag–PICALM和HA–LRP4T100突变体后，抗Flag抗体（IP:Flag）在HEK293T细胞中共同免疫沉淀HA标记的C–末端LRP1突变体（LRP4T100）。HA–LRP4和Flag–PICALM用作装载控制。
图6
图6。PICALM与LRP1在Aβ跨内皮单层细胞转运过程中的相互作用
一单分子膜中含有PICALM（红色）、ZO–1（绿色）和F–actin（洋红色）。b条在基底外侧膜LRP1–Aβ内化1分钟后，用LRP1（绿色）和FAM–Aβ40（洋红）对PICALM（红色）进行染色。c–d码，描述PICALM–LRP1关联的邻近连接分析（PLA）(c（c）PLA研究了Aβ40（1 nM）添加到基底侧膜后，PICALM和LRP1以及内皮细胞中氯氰菊酯与LRP1之间的关联动力学(d日).e（电子），Aβ40（1 nM）在转染si的单层基底外侧膜内化。LRP1，si。皮卡姆和si。CHC公司比较si.加扰或未经转化的控制。f–g，Aβ40（1 nM）跨转染si的内皮单层的基底外侧至顶端跨细胞转染。皮卡姆和si。CHC公司与si相比.加扰（100%）超过60分钟(如果)以及30分钟内单向跨内皮Aβ40转运的定量(克). 三份主要分离物的平均值±标准偏差。经方差分析和Tukey事后检验，p<0.05。
图7
图7。PICALM与Rab5和Rab11在Aβ跨内皮单层细胞转运过程中的相互作用
一在与FAM–Aβ40（250 nM）培养2分钟的原代人脑内皮细胞（BEC）中，PICALM（红色）和Rab5（绿色）之间的定殖。b条，在与FAM–Aβ40培养5分钟的BEC中，PICALM（红色）和Rab7（绿色）之间缺乏关联。c（c）在用FAM–Aβ40培养的BEC中，PICALM（红色）和Rab11（绿色）之间定殖5分钟。Dapi，核染色（蓝色）。插图：高倍放大，描绘同位化。棒材=10µm。d日，PICALM和Rab5、Rab7或Rab11 punta之间共定位的量化a–c.e–f，FAM–Aβ40（绿色）与Rab5（洋红，上面的)或RAB11b（洋红色，底部)Aβ内化后2分钟和4分钟分别在内皮单层的基底外侧。箭头表示共同定位的白色泪点。g–小时PICALM解放军-Rab11协会(克，bar=10µm）和向基底外侧膜添加Aβ40（1 nM）后PICALM与内皮细胞中Rab5、Rab7和Rab11的结合动力学(小时).我将Aβ40（1 nM）添加到基底膜后0、2和4分钟，用PICALM特异性抗体（IP:PICALM）共免疫沉淀LRP1、Rab5、Rab7和Rab11。j–k60分钟后，与对照组EGFP（100%）相比，Aβ40（1 nM）在表达显性阴性Rab5–S34N、Rab7–T22N或Rab11b–S25N突变体的单层细胞中的基底侧至顶端跨细胞转染(j个)以及30分钟内Aβ40单向转运的量化(k个). 三份主要分离物的平均值±标准偏差。经方差分析和Tukey事后检验，p<0.05。l–m，抑制Rab5(我)和Rab11(米)GTPase活性（si）。皮卡姆与si相比.加扰控件。
图8
图8。Aβ细胞跨AD衍生内皮单层和iPSC衍生内皮细胞转运rs3851179皮卡姆变体
一对照组和AD内皮单层中PICALM的qRT-PCR和western blot分析。b条，AD衍生内皮细胞的Aβ40（1 nM）转染减少，腺病毒介导的AD逆转。皮卡姆重新表达。广告。mLRP1、LRP1迷你基因。对照组和AD单层的8个分离株的平均值±标准偏差，一式三份。c（c），基于CRISPR/Cas9的等基因iPSC系纯合世代图，用于3851179卢比.gRNA=引导RNA。d日iPSC基因组DNA PCR产物的SspI限制性消化3851179卢比区域*表示CRISPR–Cas9修饰的iPSC系。e（电子），iPSC的Sanger测序3851179卢比确认G或A变异体的独立等基因系纯合子。如果FACS点图显示，15.7%的iPSC衍生内皮细胞通过类胚体（EB）形成，内皮标记物CD31和VE–Cadherin呈阳性。克，iPSC衍生内皮细胞与周细胞条件培养基共同培养形成单层在体外ZO–1正紧密连接（绿色）。棒材=100µm。h–iPICALM的qRT-PCR和western blot分析(小时)和Aβ40（1 nM）细胞转染(我)在人iPSC衍生的内皮单层中携带保护性3851179卢比（AA）变体和非保护性3851179卢比（GG）变体。在h–i，表示±s.e.m.，来自6个培养基3851179卢比三份变体。
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